miR-125b和血管内皮生长因子A在肝细胞癌中的表达及两者的相关性

目的:探讨miR-125b与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达情况及与两者的相关性?方法:利用real-time PCR检测肝癌?癌旁组织?肝癌细胞Huh-7?HepG2以及正常肝细胞L02中miR-125b表达,应用real-time PCR和Western blot分别检测肝癌?癌旁组织中VEGF-A mRNA和蛋白表达?转染miR-125b模拟物(mimic)上调肝癌细胞HepG2中miR-125b表达后,real-time PCR和Western blot检测HepG2细胞中VEGF-A mRNA和蛋白表达?结果:miR-125b 在人肝癌组织中的表达较癌旁组织明显降低(P < 0.05);在肝癌细胞Huh-7?HepG2中的表达较L02明显降低(P < 0.05)?VEGF-A mRNA和蛋白在人肝癌组织中的表达较癌旁组织明显升高(P < 0.05)?miR-125b mimic上调HepG2中miR-125b表达后,转染组VEGF-A mRNA和蛋白表达较空白组和阴性对照组均明显下降(P < 0.05)?结论:miR-125b在肝癌中表达明显下调,而VEGF-A表达上调;低表达的miR-125b丧失对VEGF-A表达的抑制作用可能是肝癌发生的重要机制?     

Hedgehog信号通路与Snail在肝癌细胞系中的表达及意义

目的 探讨Hedgehog(Hh)信号通路在各种肝癌细胞系中的表达及其与Snail蛋白的关系.方法 用RT-PCR检测了Hh信号通路分子Shh、Ihh、Ptch-1、Smo、Gli-1、Gli-2、Gli-3 mRNA在4种肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh-7和永生化肝细胞系L02中的表达情况,应用Western blot检测了Snail蛋白在SMMC-7721和L02细胞中的表达差异.结果 RT-PCR结果显示Hedgehog信号通路分子mRNA在肝癌细胞株中呈高表达,并以Shh信号为主;Gli-2在SMMC-7721细胞中表达最显著,而在正常肝细胞株L02中表达最弱,两者差异显著(P<0.01).Snail蛋白在SMMC-7721细胞中的表达显著高于L02细胞(P<0.05),且与Gli-2的表达呈正相关(P<0.05).结论 Hh信号通路可能通过Gli-2上调Snail的表达,增强肝癌细胞增殖力和侵袭力,促进肝细胞癌的发生和发展.     

间隙连接基因Cx32在肝细胞癌中的表达意义

目的：探讨肝细胞癌（HCC）、癌旁组织及正常肝组织中细胞间隙连接Cx32mRNA与Cx32蛋白的表达及其在HCC发生中的意义和机制。方法：应用Western blot和RT-PCR分别检测Cx32蛋白和Cx32mRNA在26例HCC组织、22例癌旁组织和9例正常肝组织中的表达。结果：Cx32蛋白在HCC中的表达明显低于正常肝组织和癌旁肝组织（P〈0.01）;Cx32mRNA在HCC、癌旁肝组织和正常肝组织均有一定水平,但三者之间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：Cx32蛋白在肝癌中的表达下调可能是肝癌发生的重要环节,Cx32蛋白的减少与该基因在翻译或蛋白质的加工修饰过程中调控异常有关。     

CLEC1B在肝细胞癌中的表达及其对细胞恶性生物学行为的影响

目的：研究C型凝集素结构域家族1成员B(CLEC1B)在肝细胞癌(HCC)组织中的表达并检测其对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测15例HCC患者新鲜癌组织及癌旁正常组织中CLEC1B基因表达差异，免疫组化检测85例HCC组织及癌旁正常组织中CLEC1B蛋白表达，并分析CLEC1B表达与临床病理特征之间的相关性；建立CLEC1B过表达的HepG2稳转细胞株，qRT-PCR及Western blot进行验证；采用克隆形成实验检测HepG2细胞增殖能力变化；Western blot检测Hedgehog信号通路相关因子(Shh、Gli1、Ptch1)蛋白表达情况。结果：HCC组织中CLEC1B表达量较癌旁正常组织明显降低(P<0.05),CLEC1B在HCC中的表达量与肿瘤大小及远处转移有关，且CLEC1B表达越高肿瘤体积相对越小，远处转移概率越低；过表达HepG2细胞CLEC1B表达量，细胞增殖能力明显下调(P<0.05),且细胞中的Shh、Gli1、Ptch1蛋白表达量明显降低(P<0.05)。结论：CLEC1B在肝细胞癌中表现...     

p14ARF、ARF-BP1、c-myc在肝细胞癌中的表达及意义

目的:探讨肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)组织及其癌旁肝组织中p14ARF、ARF-BP1、c-myc的表达及意义.方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术、免疫组化技术对45例HCC组织及其癌旁肝组织中p14ARF、ARF-BP1、c-myc的mRNA表达和p14ARF、c-myc蛋白表达情况进行检测.结果:p14ARF、ARF-BP1、c-myc的mRNA在HCC组织中阳性表达分别为80.00%、86.67%、84.44%,在癌旁肝组织中分别为11.11%、20.00%、53.33%,三者的mRNA在癌组织中呈过表达,明显高于癌旁肝组织(P＜0.01).p14ARF、c-myc蛋白在HCC组织中表达分别为78.38%、75.68%,明显高于癌旁肝组织的13.51%(P＜0.01)和51.35%(P＜0.05).结论:p14ARF、ARF-BP1、c-myc在HCC组织中高表达,这种高表达可能与HCC的发生有相关性.     

Survivin与p21waf-1在大鼠肝细胞癌变过程中的动态表达及其相关性的研究

目的:动态观察黄曲霉毒素B1(AFB1)在诱发大鼠肝细胞癌(HCC)过程中survivin 及p21waf-1表达的变化及它们在HCC发生发展中的关系.方法:用免疫组化及RT-PCR检测24只用AFB1诱发出的大鼠肝癌及癌旁肝组织、6只未诱发出肝癌的大鼠及11只对照大鼠不同时期肝活检组织中的survivin与p21waf-1基因和蛋白表达.结果:①HCC组织中survivin阳性率41.67%、癌旁肝组织54.17%;未发生肝癌及对照组大鼠活检肝组织,均未检出survivin蛋白(P<0.01);②HCC及癌旁肝组织中survivin mRNA的表达水平显著上调(P<0.01);③HCC及癌旁肝组织p21waf-1蛋白阳性率明显低于58周未出癌及对照组大鼠肝组织(P<0.01);④出癌大鼠p21waf-1 mRNA表达水平在HCC形成过程逐渐下调(P<0.01);⑤在HCC形成中,survivin与p21waf-1表达呈负相关.结论:在HCC形成的早期p21waf-1mRNA表达的下调逐渐失去抑制细胞增殖、促进细胞分化功能,使细胞增殖,而survivin mRNA表达上调,抑制细胞凋亡,两者在HCC形成过程中可能发挥协同作用.     

肝细胞肝癌组织中survivin基因的表达及与p53、Bcl-2表达的关系

目的 探讨survivin基因在肝细胞肝癌(HCC)组织中的表达、定位及临床意义,以及与p53和Bcl-2表达的关系.方法 应用SABC免疫组织化学染色技术对87例HCC组织及其50例癌旁组织、4种肝癌细胞系和27例非肝癌肝组织进行survivin蛋白检测,对其中的30例HCC组织进行突变型p53和Bcl-2蛋白检测;应用Western blot和real time-PCR等技术对8例HCC组织及其癌旁组织、4种肝癌细胞系进行survivin蛋白和mRNA进行检测;对74例HCC患者的临床分期、病理分级、瘤块大小等与survivin蛋白表达情况进行相关性分析.结果 ①HCC组织、癌旁组织和非肝癌肝组织中,survivin蛋白阳性表达率分别为59.77%(52/87),26.00%(13/50)和0(0/27),HCC组织中survivin蛋白表达与癌旁组织和非肝癌肝组织比较差异均有统计学意义(P<0.01),且与患者年龄、性别、瘤块大小、有否转移、临床分期和病理分级等均无相关关系(P>0.05).②survivin mRNA在HCC组织、癌旁组织中阳性表达率分别为37.5%(3/8)和0(0/8);survivin蛋白和mRNA在4种肝癌细胞系(SMMC-7721,HHCC,HCC-9724 和HepG2)中,除HepG2外均呈高表达.③survivin蛋白表达与突变型p53表达存在明显正相关(χ2=4.693,P=0.030),与Bcl-2表达无明显相关(χ2=0.25,P=0.617).结论 survivin基因可能成为肿瘤基因治疗的靶点;survivin基因与p53基因在抑制肿瘤细胞凋亡方面可能具有某种协同作用;检测survivin表达水平对判断HCC恶性程度和预后可能无临床价值.     

小GTP酶Arl6调控原纤毛生成和Shh信号转导

目的:研究小GTP酶Arl6对sonic hedgehog(Shh)信号通路的调控作用?方法:构建Arl6敲低稳转细胞株,检测Shh通路靶基因Gli1及Ptch1的mRNA表达水平;激光共聚焦显微镜下观察Arl6在原纤毛的定位,并且检测Arl6敲低细胞中原纤毛的生成情况?结果:Arl6的敲低抑制Shh信号通路的完全激活,在高浓度Shh条件性培养基或Smo激动剂Purm刺激下,靶基因Gli1 mRNA表达水平明显低于对照shControl组(P < 0.01),Ptch1 mRNA的表达水平也明显降低(P < 0.05);Arl6定位于原纤毛的基部小体,Arl6的缺失会影响原纤毛的生成;同时,Shh信号会刺激Arl6的表达(P < 0.05)?结论:小GTP酶Arl6的敲低抑制Shh通路的完全活化,与其抑制原纤毛生成有关?     

苦参碱通过调控β-catenin信号通路抑制肝癌细胞干性

目的探讨苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞增殖活性、细胞干性、β-catenin转录活性以及AKT/GSK3β/β-catenin信号 通路的影响。方法应用MTT法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验检测0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对 人肝癌HepG2 和Huh7 细胞的克隆形成能力,荧光定量PCR分析0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱对人肝癌 HepG2 和Huh7 细胞干性基因CD90、EpCAM（上皮细胞粘附分子）和CD133 mRNA的表达水平,双荧光素酶报告基因检测 0 g/mL、200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱对人肝癌HepG2 和Huh7 细胞内β-catenin 转录活性,Western blotting 检测 0 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞内AKT（蛋白激酶B）、GSK-3β和β-catenin及其相应磷酸化 蛋白的表达水平。结果MTT实验结果显示,苦参碱呈时间-浓度依赖性地抑制肝癌HepG2 和Huh7 细胞的增殖,处理24、 48、72 h 对HepG2 细胞的半数抑制浓度依次为2369、1565、909.1 μg/mL,对Huh7 细胞的半数抑制浓度依次为1355、781.8、 612.8 μg/mL。苦参碱浓度依赖性地抑制肝癌细胞的克隆形成能力,400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制HepG2细胞的 克隆形成能力（P<0.01,P<0.001）,200 g/mL、400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞的克隆形成能力（P<0.05,P<0.01, P<0.001）。苦参碱能够显著肝癌细胞内CD90、EpCAM和CD133 等干细胞标志物mRNA的表达,其中400 μg/mL、800 μg/mL 苦参碱能够显著抑制HepG2细胞中CD90（P<0.01,P<0.001）、EpCAM（P<0.05,P<0.01）和CD133（P<0.01,P<0.01）mRNA的表 达,400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著抑制Huh7细胞中CD90（P<0.01,P<0.01）、EpCAM（P<0.05,P<0.01）和CD133（P<0.01, P<0.01）mRNA的表达。同时400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱显著抑制HepG2细胞（P<0.001,P<0.001）和Huh7细胞（P<0.01,P<0.001） 内β-catenin的转录活性。研究结果显示400 μg/mL、800 μg/mL苦参碱能够显著降低HepG2和Huh7细胞内β-catenin和磷酸化 的AKT和GSK-3β蛋白水平,增加β-catenin的磷酸化水平。结论苦参碱可抑制肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖、克隆形成以及 肝癌干性基因CD90、EpCAM和CD133的表达,其机制可能与抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路,从而降低β-catenin的转录 活性有关。     

SHH信号通路对子痫前期患者滋养细胞凋亡和侵袭的影响及其机制

目的：探讨激活SHH信号通路对子痫前期（PE）患者滋养细胞凋亡和侵袭的影响,并阐明其作用机制。方法：将HTR8/SVneo细胞分为正常对照组、缺氧/复氧（H/R）处理组和purmorphamine+H/R处理组。Western blotting法检测PE胎盘组织和正常妊娠晚期胎盘组织及各组HTR8/SVneo细胞中SHH信号通路相关蛋白SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平,流式细胞术（FCM）检测各组HTR8/SVneo细胞的凋亡率,Transwell小室法检测各组HTR8/SVneo细胞的穿膜细胞数,Western blotting法检测各组HTR8/SVneo细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白表达水平。结果：PE胎盘组织HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平均明显低于正常妊娠晚期胎盘组织（P<0.05）;H/R处理组HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及穿膜细胞数均明显低于正常对照组,细胞凋亡率明显高于正常对照组（P<0.05）;purmorphamine+H/R处理组HTR8/SVneo细胞中SHH、Ptch1、Smo、Gli1、Gli3、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平及穿膜细胞数均明显高于H/R处理组（P<0.05）,细胞凋亡率明显低于H/R处理组（P<0.05）。结论：激活SHH信号通路可减少PE患者胎盘组织中HTR8/SVneo细胞凋亡,并通过上调MMP-2和MMP-9表达提高细胞的侵袭能力。     

Expression of metadherin/AEG-1 gene is positively related to orientation chemotaxis and adhesion of human hepatocellular carcinoma cell lines of different metastatic potentials

Metastasis contributes to the poor prognosis of hepatocellular carcinoma (HCC). However, the mechanism through which a primary HCC cell develops into a metastatic phenotype is not well understood. The purpose of this study was to examine the correlation between metadherin (MTDH)/ astrocyte elevated gene-1 (AEG-1) expression in HCC cell lines of different metastatic potentials and such metastatic phenotypes as orientation chemotaxis and adhesion. MTDH/AEG-1 expression was detected by RT-PCR and western blotting in HCC cell lines (HepG2, Huh7, Sk-HEP-1, MHCC-97H). Distribution of MTDH/AEG-1 was observed by immunofluorescence staining and confocal laser scanning microscopy. The abilities of orientation chemotaxis and adhesion and the index of interaction between HCC cell lines and microvascular endothelial cell lines (MVECs, including HUVECs and HPMECs) were measured by chemotaxis assay and adhesion assay, respectively. The results showed that MTDH/AEG-1 protein expression was significantly higher in high metastatic potential cancer cell lines (Sk-HEP-1, MHCC-97H ) than in low metastatic potential cell lines (HepG2, Huh7) (P<0.05). The MTDH/AEG-1 protein was localized in the perinuclear region of HCC cells. Furthermore, the abilities of orientation chemotaxis and adhesion of HCC cells to HPMECs were increased as compared with those of HCC cells to HUVECs (P<0.05). The abilities of orientation chemotaxis and adhesion were much stronger in Sk-HEP-1 and MHCC-97H cells with MTDH/AEG-1 highly expressed than in HepG2 and Huh7 cells with MTDH/AEG-1 lowly expressed (P<0.05). These results suggested that the expression of MTDH/AEG-1 gene in HCC cell lines of different metastatic potentials was closely positively related to the abilities of orientation chemotaxis and adhesion of HCC cells. It was deduced that MTDH/AEG-1 might play a pivotal role in the lung-specific metastasis of HCC, which may be medi-ated through orientation chemotaxis and adhesion abilities of HCC cells. MTDH/AEG-1 may serve as a potential therapeutic target for HCC.     

O-GlcNAc转移酶在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义

目的：探讨氧连氮-乙酰葡萄糖胺转移酶（OGT）在原发性肝细胞癌（HCC）组织、细胞及血清中表达情况,阐明OGT在HCC的诊断和治疗中的意义。方法：采用Western blotting法分别检测20例HCC组织和癌旁组织中以及8例肝癌细胞株和正常人肝细胞裂解物中OGT蛋白表达水平,采用直接酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测20名健康志愿者、肝硬化（LC）、HCC患者血清中OGT蛋白表达水平,分析HCC组织、细胞、血清中OGT蛋白表达水平与肿瘤发生发展的关系。结果：Western blotting检测,OGT在HCC肿瘤组织及相对应癌旁组织中均有表达,HCC患者肿瘤组织中OGT阳性表达率高于相对应癌旁组织（P < 0.05）;同时OGT在肝细胞癌株及正常人肝细胞裂解物中均有表达,而肝细胞癌株中阳性表达率高于正常人肝细胞裂解物（P < 0.05）。ELISA法检测,HCC和LC患者血清中OGT表达水平均高于健康志愿者（P < 0.05）。结论：OGT在HCC肿瘤组织中表达升高,OGT有望成为HCC新的诊断靶点。     

Hedgehog信号通路分子Shh、Ptch和Smo在化学诱导小鼠肝癌模型过程中的动态表达

目的探讨C57BL／6J小鼠诱癌过程中Hedgehog信号通路成员Shh、Ptch和Smo在各阶段的动态表达。方法将95只正常C57BL／6J雄性小鼠随机分为诱癌组50只（化学诱癌处理）和对照组45只（正常喂养）,定期获取小鼠肝组织标本行免疫组织化学法、实时荧光定量RT—PCR法和蛋白质印迹法检测。结果免疫组织化学提示,诱癌组Shh、Ptch和Smo蛋白分别在第6周、第8周和第10周出现弱阳性,均在第16周出现中度阳性,第20周出现强阳性表达,而正常对照组中未检测出三者的表达。RT—PCR法提示,诱癌组小鼠肝组织中ShhmRNA、PtchmRNA和SmomRNA的表达量持续升高,第20周时j者的表达水平均达到最高（ShhmRNA15．986±1．784,PtchmRNA11．272±0．295,SmomRNA10．185±0．716）,明显高于同期正常对照组（P〈0．05）。蛋白质印迹法提示,诱癌组Shh、Ptch和Smo蛋白分别从第6周、第8周和第10周起出现弱表达,到第20周时显著增强,而正常对照组中未检测出3种蛋白的表达。结论Hedgehog信号通路分子Shh、Ptch和Smo伴随着小鼠诱发肝癌时间的延长其表达量逐步升高,认为Hedgehog信号通路与小鼠肝癌的发生、发展密切相关。     

Inhibition of connective tissue growth factor overexpression decreases growth of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo

Background  We have previously found that connective tissue growth factor (CTGF) is highly expressed in a rat model of liver cancer. Here, we examined expression of CTGF in human hepatocellular carcinoma (HCC) cells and its effect on cell growth.

Methods  Real-time PCR was used to observe expression of CTGF in human HCC cell lines HepG2, SMMC-7721, MHCC-97H and LO2. siRNA for the CTGF gene was designed, synthesized and cloned into a Plk0.1-GFP-SP6 vector to construct a lentivirus-mediated shRNA/CTGF. CTGF mRNA and protein expression in HepG2 cells treated by CTGF-specific shRNA was evaluated by real-time PCR and Western blotting. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized to evaluate the growth effect, and a colony formation assay was used for observing clonogenic growth. In vivo, tumor cell proliferation was evaluated in a nude mouse model of xenotransplantation. Statistical significance was determined by t test for comparison between two groups, or analysis of variance (ANOVA) for multiple groups.

Results  Immunohistochemical staining of CTGF was seen in 35 of 40 HCC samples (87.5%). CTGF was overexpressed 5-fold in 20 HCC tissues, compared with surrounding non-tumor liver tissue. CTGF mRNA level was 5–8-fold higher in HepG2, SMMC-7721 and MHCC-97H than in LO2 cells. This indicated that the inhibition rate of cell growth was 43% after knockdown of CTGF expression (P <0.05). Soft agar colony formation assay showed that siRNA mediated knockdown of CTGF inhibited colony formation in soft agar of HepG2 cells (P <0.05). The volume of tumors from CTGF-shRNA-expressing cells only accounted for 35% of the tumors from the scrambled control-infected HepG2 cells (P <0.05).

Conclusions  CTGF was overexpressed in human HCC cells and downregulation of CTGF inhibited HCC growth in vitro and in vivo. Knockdown of CTGF may be a potential therapeutic strategy for treatment of HCC.

     

MiR-18B-5p调节BTG3及其下游信号通路促进肝细胞癌的发生发展

目的 本研究旨在探讨miR-18B-5p在肝癌中的作用及其机制。 方法 检测miR-18B-5p在肝癌患者血清中的表达水平,对其临床意义进行分析。下调miR-18B-5p表达水平,检测miR-18B-5p在肝癌细胞系增殖、迁移和侵袭中的作用,用实时荧光定量聚合酶链反应和荧光素酶报告法探讨其作用机制。 结果 低miR-18B-5p表达组患者生存率高于高miR-18B-5p表达组（P＜0.05）,多因素分析结果显示,miR-18B-5p的表达水平（RR:2.064,95%CI:1.522~2.800）和年龄（RR:1.762,95%CI:1.347~2.305）是患者生存的影响因素,HepG2细胞表达的miR-18B-5p水平高于Bel-7402组、MHCC97组和Hep3B组（P＜0.05）,Si-miR-18B-5p细胞系的Si-miR-18B-5p表达和细胞增殖低于HepG2细胞系（P＜0.05）,在Si-miR-18B-5p细胞系miR-18B-5p下调,细胞迁移和侵袭能力低于HepG2细胞系（P＜0.05）,Si-miR-18B-5p细胞中BTG3的mRNA表达高于HepG2细胞系（P＜0.05）,BTG3 WT相对荧光素活性低于BTG3 Mut（P＜0.05）。 结论 MiR-18B-5p可作为肝癌新的治疗靶点和预后标志物。