pDsRed-hAPJ质粒载体构建及在人HEK293细胞中的表达

背景:Apelin/APJ系统具有广泛的生理作用,但其在细胞内信号转导,特别是apelin受体的脱敏,内化、复敏降解等方面仍无一致性见解.目的:构建人apelin受体APJ与红色荧光蛋白pDsRED-express-C1融合的真核表达载体并检测其在人胚胎肾293细胞中的表达.方法:以质粒pcDNA3.1-hAPJ为模板,扩增人APJ,用EcoR I和BamH I分别酶切扩增的产物和pDsRED-express-C1载体,常规连接、转化感受态大肠杆菌TOP10.提取质粒,进行酶切鉴定,最后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染,PI染色,激光共聚焦显微镜观察.结果与结论:PCR扩增出约1.2 kb的片段,与预期的人APJ大小序列相符,酶切结果显示重组质粒被切成2条片段,其中一条为pDsRED载体大小,另一条为目的片段大小.共聚焦显微观察显示APJ主要表达在细胞膜上.说明实验成功构建了pDsRed-hAPJ真核重组质粒,此表达载体为研究人APJ的亚细胞区域的位移、内吞定位提供了重要的工具.     

整合素α2在小鼠肾发育中的表达

目的:观察整合素α2在小鼠肾发生发育过程中表达的时空顺序,揭示其在肾发生发育中的作用。方法:实验于2006-06/10在辽宁医学院科学实验中心与组织胚胎学实验室完成。选取健康昆明系小白鼠40只,体质量25～30g,将小白鼠按雌雄比例3∶1同窝饲养,以观察到雌鼠阴道栓脱落的最早时间计为胚龄0d;以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0d。分别选取胚龄14,16,18d的孕鼠和生后1,3,7,14,21,28,40d的仔鼠,每组4只,共40只。实验评估:采用免疫组织化学方法结合体视学方法和蛋白免疫印迹技术测定不同胚龄及生后日龄小鼠肾组织中的整合素α2的表达及含量变化。结果:纳入小白鼠40只,均进入结果分析。①免疫组织化学结果显示整合素α2在生肾区及间充质都有表达;在未成熟肾小球有瞬时表达,在成熟肾小球没有表达;在发育各个时期的肾小管都有明显表达。②体视学测量结果显示整合素α2在肾小管的表达规律是随着肾的发育成熟表达逐渐增多。③蛋白免疫印迹结果显示整合素α2蛋白表达随着肾脏的发育含量逐渐增加。结论:整合素α2主要在发育各个时期的肾小管表达,提示整合素α2对胚胎肾发育的诱导主要在肾小管。     

人TLR4胞外段真核表达质粒的构建及其在HEK293 细胞中的表达

目的 构建人Toll—like receptor 4（TLR4）胞外段真核表达质粒并观察其表达。方法 通过PCR扩增人TLR4胞外段基因，将其克隆入真核表达质粒pcDNA3．1（＋），重组质粒peDNA3．1（＋）-eTLR4转染入人胚肾293细胞（HEK293 细胞）中，RT-PCR检测TLR4胞外段的表达。结果 测序结果表明，成功构建人TLR4胞外段真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-eTLR4，并在HEK293细胞中获得表达。结论 TLR4胞外段能在HEK293细胞中获得正确表达，为TLR4信号通路的进一步研究打下了基础。     

整合素αvβ5在宫颈癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨整合素αvβ5在宫颈癌组织中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学法,分别测定15例正常宫颈、15例宫颈原位癌、60例宫颈浸润癌组织中整合素αvβ5的表达.结果 宫颈浸润癌整合素αvβ5的阳性表达与原位癌和正常宫颈比较有显著差异（P＜0.05）.宫颈癌Ⅱ期整合素αvβ5的阳性表达与I期比较,有统计学差异（P＜0.05）.组织学分级G1整合素αvβ5的阳性表达与G2、G3比较有明显差异（P＜0.05）.宫颈癌淋巴结转移组整合素αvβ5与无淋巴结转移组比较有明显差异（P＜0.05）,宫颈鳞癌整合素αvβ5表达与腺癌相比无显著差异（P〉0.05）.结论 在宫颈癌发生、发展中,整合素αvβ5表达增强与肿瘤的生物学行为密切相关.     

重组人骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

背景:骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白2诱骨活性最强,在骨组织工程研究中需要大量的骨形态发生蛋白2.目的:克隆表达骨形态发生蛋白2基因,并进行蛋白表达及蛋白纯化定量.设计、时间及地点:单一样奉观察,于2008-05/07在宝牛物工程(大连)有限公司开放实验室完成.材料:表达载体pET28a Vector及相应的宿主细胞E.coil BL21(DE3)购于Novagen公司;分子伴侣质粒pTF16、pGr07、PKJE7购于宝生物工程(大连)有限公司.方法:利用基因重组技术,优化片人工合成骨形态发生蛋白2基因,亚克隆至含T7启动子的原核表达载体pET28a中,构建表达载体pET-BMP.将重组质粒pET-BMP与3种含分子伴侣质粒共转入宿主菌E.coil BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.菌体经超声波破碎,镍柱亲和层析纯化并定量.主要观察指标:①3种表达质粒的表达及町溶性检测及表达上清的westem blotting检测.②pET-BMPg的纯化.结果:在表达宿主菌中,骨形态发生蛋白 2基因获得了高效表达,其中一组为可溶性表达,表达产物经亲和层析纯化后,可溶性表达量达12.18 mg/L培养基.结论:人骨形态发生蛋白2基凼能在PET表达系统中得到高效可溶性表达.     

β1整合素抑制β淀粉样蛋白对记忆长时程增强的作用

背景：抑制小鼠海马脑片整合素活动后,虽然不会影响长时程增强的诱导,但却带来快速的长时程增强衰减,证明整合素对于诱导后长时程增强的维持和稳定起到关键的作用。目的：通过在体电生理技术阐明整合素的β1亚基在活体大鼠的海马CA1区中β淀粉样蛋白抑制长时程增强的过程中所起到的作用。方法：将15只SD大鼠等分为对照组、G淀粉样蛋白组和β1整合素拮抗剂组,分别给予生理盐水,β淀粉样蛋白和β1整合素的选择性拮抗剂,记录自给予β淀粉样蛋白前10min至高频强直刺激后3h时的兴奋性突触后电位。结果与结论：给予对照组大鼠高频强刺激后兴奋性突触后电位明显增强,增幅在30％以上。β淀粉样蛋白组大鼠给予高频强刺激后兴奋性突触后电位在3h中被显著抑制,没有出现明显的变化。而β1整合索拈抗剂组大鼠给予高频强刺激后兴奋性突触后电位又出现明显的增强。推测β1整合素在活体大鼠的海马CA1区中β淀粉样蛋白抑制长时程增强的过程中可能起着重要的介导作用,而其特异性的拮抗剂或抗体可以阻断这种介导作用。     

转化生长因子-β1、Smad4与Smad7蛋白在肾癌组织中的表达及意义

目的:通过检测转化生长因子(TGF)-β1、Smad4与Smad7蛋白在肾癌组织中的表达,研究它们与肾癌发生、发展的关系.方法:应用S-P免疫组化检测方法,对10例正常肾组织、45例未转移的肾癌与10例已有转移的肾癌组织的TGF-β1、Smad4与Smad7蛋白的表达进行检测.结果:Smad4蛋白在正常肾组织和未转移组肾癌组织中的表达明显高于转移组肾癌组织,且肾癌分化程度越低,阳性表达率越低(P<0.05).TGF-β1、Smad7蛋白在转移组肾癌组织中的表达明显高于正常肾组织和未转移组肾癌组织(P<0.05).TGF-β1、Smad4及Smad7蛋白的表达均与淋巴结转移相关.结论:TGF-β1、Smad4与Smad7蛋白三者表达的异常可能与肾癌的发生、发展和转移相关.可能成为研究肾癌分化与转移的生物学标记物.     

TP53BP2基因真核表达载体的构建及在人胚肾Expi293F细胞中蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的 构建人肿瘤抑制因子p53 结合蛋白2（tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2）的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F 细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2 蛋白并对其进行生物学活性鉴定。方法 利用UniProt 网站查询TP53BP2 基因序列,并进行Expi293F 表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2AeGFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFPTP53BP2质粒瞬时转染至Expi293F 细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验（Western blot,WB）检测TP53BP2 重组蛋白表达水平。通过His 标签纯化试剂盒及Superdex 200 10/300GL 层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE）对纯化后重组蛋白进行鉴定。利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）检测重组人全长TP53BP2 蛋白与p65 蛋白结合情况。利用免疫荧光（immunofluorescence,IF）检测重组人全长TP53BP2 蛋白与p65 蛋白共定位。利用表面等离子体共振（surface-plasmon resonance,SPR）技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2 蛋白与TP53BP2抗体的相互作用。结果 经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2 构建成功。经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB 结果表明TP53BP2 蛋白在Expi293F 细胞中过表达,证明转染成功。SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90% 以上,证明纯化成功。Co-IP 结果表明,TP53BP2 重组蛋白可与p65 蛋白相互作用。IF 结果表明,His 标签蛋白、TP53BP2 蛋白及p65 蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用。SPR 结果表明,纯化的重组人TP53BP 蛋白与TP53BP2 抗体具有较好的结合活性。以上结果均证明重组人全长TP53BP2 蛋白具有生物学活性。结论 成功构建了TP53BP2 基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F 细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2 蛋白,为进一步研究TP53BP2 的结构和功能奠定了基础。     

山羊胚胎皮肤的发育及β1整合素在发育中的表达

目的：观察山羊胚胎皮肤发育的过程以及在此过程中表皮干细胞的特异性标志β1整合素的表达状况，以定位表皮干细胞。方法：实验于2006—11，2007—05在西北农林科技大学动物科技学院组织胚胎学实验室完成。取8-18周龄山羊胚胎背部皮肤，用组织学方法，观察山羊胚胎皮肤发育的形态学变化；用免疫组织化学SP法，观察β1整合素在山羊胚胎皮肤发育过程中的表达特征。结果：①表皮于8～9周龄时开始发育，10周龄时表皮由三层细胞构成，在11周龄时可见有原始毛囊的出现，有少量张力原纤维的存在，并发现朗格罕斯细胞，12～13周龄时表皮细胞出现角化层、透明层及颗粒层的分化，可见汗腺，14-15周龄毛球上皮细胞索开始分化为外根鞘、内根鞘的原基和毛发的前体，在毛囊一旁出现皮脂腺，张力原纤维增多、变粗，并发现典型的桥粒结构，16～17周龄时表皮层变薄，毛开始形成，并随着发育逐渐长出体表。18周龄皮肤的结构渐趋成熟。②胚胎发育早期，基底层细胞胞浆内表达β1整合素，随着皮肤发育，β1整合素阳性细胞出现在毛囊隆突区和外根鞘。结论：①山羊胚胎表皮的发生优先于真皮的发生，在胚胎时期处于剧烈的分化阶段。②β1整合素的阳性反应定位于基底层，随着皮肤的发育也表达于毛囊隆突区和外根鞘，表皮干细胞的数量和分布的部位与皮肤的发育特点有关系。     

血清整合素β1、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白在子宫内膜异位症中的临床价值

目的 探讨血清整合素β1(ITGb1)、纤维粘连蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)在子宫内膜异位症(EMT)中的临床价值.方法 选择2019年1月至2020年12月在该院就诊的EMT患者96例为EMT组,另选择同期体检健康者52例为对照组.采用酶联免疫吸附试验检测各组血清ITGb1、FN和LN水平.比较两组血清ITGb1...     

Agonist-dependent internalization of the human melanocortin-4 receptors in human embryonic kidney 293 cells

A chimeric protein comprised of melanocortin-4 receptor (MC4R) and the green fluorescent protein (GFP) was created for studying receptor/ligand localization and trafficking. The ligand binding affinities and second messenger stimulation induced by MC4R-GFP closely resembled those of the wild-type receptor, suggesting functional integrity of the chimeric protein. As observed with a confocal microscope, in human embryonic kidney (HEK)-293 cells MC4R/GFP was distributed evenly along the cell membrane. Addition of [Nle4-d-Phe7]-alpha-melanocyte-stimulating hormone (NDP-MSH), a peptide MC4R agonist, induced receptor translocation into intracellular compartments in a time- and concentration-dependent manner. [Ac-Nle-c[Asp-His-d-Nal(2')-Arg-Trp-Lys]-NH2] (SHU9119), a potent MC4R antagonist, completely inhibited NDP-MSH-mediated internalization. MC4R-GFP internalization was unaffected by a protein kinase A inhibitor N-[2-(p-bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinesulfonamide (H89), but was impaired by pretreatment with inhibitors of endocytosis through clathrin-coated pits, hypertonic sucrose, or concanavalin A. Time-dependent colocalization of MC4R-GFP with rhodamine-transferrin, an early endosome marker, and with LysoTraker, a lysosome marker, was observed after short-term (45 min) and prolonged (20 h) agonist exposure, respectively. Rhodamine-[AcNle-c[Asp-His-d-Phe-Arg-Trp-Lys]-NH2] (MTII), a fluorescent derivative of an MC4R agonist, was found to cointernalize with MC4R-GFP into intracellular vesicles. No significant receptor recycling or segregation from the ligand was observed 60 min after removal of the agonist. In contrast, an antagonist rhodamine-Ac-Cys-Glu-His-(d-Nal)-Arg-Trp-Gly-Cys-Pro-Pro-Lys-Asp-NH2 (HS014) bound to and colocalized with MC4R-GFP on the cell surface and did not stimulate receptor internalization. In sum, these results suggest that MC4R is subject to agonist-dependent endocytosis via clathrin-coated pits. Prolonged agonist exposure directs MC4R into lysosomes, possibly for degradation. Receptor and ligand recycling is not efficient for MC4R in HEK-293 cells.     

P73蛋白在大肠癌中的表达及其临床意义

目的:研究P73在大肠癌中的表达与临床意义.方法:选取92例大肠癌组织标本,腺瘤10例,淋巴结转移灶34例,肝转移灶16例,癌旁正常组织10例,通过免疫组化PV-9000通用型二步法检测P73在上述标本中的表达,分析P73在原发灶,转移灶,癌旁正常组织中的表达情况,与大肠癌临床病理参数的关系.结果:P73在大肠癌组织中的阳性表达率为76%,在腺瘤中的阳性表达率为40%,癌旁正常组织中的阳性表达率为10%,淋巴结转移灶阳性表达率为71%,肝转移灶阳性表达率为75%,P73在原发灶与腺瘤、正常大肠黏膜组织之间的表达差异存在显著性(P＜0.05).P73在大肠癌中的阳性表达率与结肠癌的Dukes分期及癌细胞的分化程度,淋巴结转移肝转移有关,而与肿瘤的大小、年龄、性别、组织分型、肿瘤部位、病理分型无关.结论:P73的高表达参与大肠癌的形成、发展、侵袭和转移有关.P73有可能作为大肠癌预后的肿瘤标志物.     

P16蛋白与P27蛋白在肝细胞癌中的表达及意义

目的:探讨P16蛋白与P27蛋白在肝细胞癌中表达的意义。方法:应用免疫组织化学方法(SABC法),检测61例HCC组织及53例癌旁组织中P16、P27蛋白表达水平。结果:P16蛋白在肝癌组织中呈低表达,明显低于其在癌旁中的表达(P<0.05),P16蛋白表达率随病理分化程度下降而下降;P27蛋白在肝癌组织中呈低表达,明显低于其在癌旁中的表达(P<0.05),P27蛋白表达率随病理分化程度下降而下降。结论:P16、P27与肝细胞癌的发生、分化程度有关,可作为肝细胞癌分化程度的参考指标。     

人胚肾(HEK293)细胞自身的钾通道

目的研究人胚肾(HEK293)细胞自身的电压依赖性的钾通道。方法利用全细胞膜片钳技术,记录HEK293细胞上的外向电流及其通道的电生理特点。结果HEK293细胞上未发现氯电流。59.7%的细胞表达一种类似瞬间外向钾电流(Ito)的钾电流,该电流对4-AP敏感,2mmol/L的4-AP可明显抑制此电流。在40mV时,此电流幅度为(175±112)pA。失活曲线显示其通道的半数失活电压为(-3.5±0.9)mV,斜率为(6.3±0.8)mV。该通道从失活状态中恢复的时间常数为(333.3±33.9)ms,其失活动力学曲线呈钟形。结论HEK293细胞自身存在Ito样电流,且此电压依赖性钾通道是其自身表达的最主要的有功能的离子通道,提示在利用此广泛应用的表达系统来研究外源性离子通道的时候,应该加倍注意。     

芳香化酶P450A在子宫内膜异位症中的表达及其作用

目的 研究卵巢巧克力囊肿异位内膜腺上皮、间质细胞及其在位内膜P450芳香化酶蛋白和mRNA表达，探讨其在子宫内膜异位症发病中的作用及其临床意义。方法 采用逆转录聚合酶联反应（RT-PCR）和免疫组化技术检测45例巧囊壁、32在位内膜和35例正常内膜中P450芳香化酶（P450A）mRNA及蛋白的表达。结果 巧囊壁异位内膜P450A mRNA表达量高于在位内膜（P﹤0.01）； 35例正常内膜中仅有2例表达；免疫组化检测巧囊壁P450A蛋白其表达特征与mRNA一致。结论 子宫内膜异位症异位灶有P450A表达，这种雌激素的合成酶能在异位灶局部合成异常的雌激素；在位内膜有P450A表达，提示在位内膜本身局部有雌激素的合成，其保护机制劣于正常内膜。子宫内膜异位症P450A的表达在其发病中起到重要作用。     

P33／ING1在正常和异常增生口腔黏膜角化细胞及Tca8113细胞中的表达研究

目的研究抑癌基因P33／ING1在人正常口腔黏膜角化细胞（hNOK）、人异常增生口腔黏膜角化细胞（hDOK）和舌鳞癌细胞系Tea8113细胞中的表达及意义。方法对hNOK、hDOK和Tea8113细胞进行体外培养,间接免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜检测细胞中P33／ING1的表达与亚细胞定位。结果在hNOK和hDOK中P33／ING1呈高强度表达,主要分布于胞核和胞膜,偶见于胞浆;而Tea8113细胞中P33／ING1微弱表达,主要分布于胞桨。P33／ING1染色阳性率与组织病变恶性度显负相关（P〈0．05）。结论P33／ING1在口腔鳞癌发生发展过程中的表达呈进行性下降或缺失,ING1基因突变或缺失可能在口腔鳞癌的发生发展过程中起重要作用。     

Mdm2、p53在乳腺癌中的表达及意义

目的研究Mdm2、P53蛋白在乳腺肿瘤组织中的表达及临床意义。方法应用免疫组化SP法检测Mdm2、P53蛋白在不同组织学类型乳腺癌60例、正常乳腺组织20例中的表达。结果Mdm2、P53蛋白在乳腺癌组织中阳性表达率与正常乳腺组织比较差异有统计学意义（P〈0．01）。Mdm2、P53蛋白表达与肿瘤大小比较无差异（P〉0．05）,在临床分期、腋窝淋巴结转移之间比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论Mdm2、P53蛋白在乳腺癌组织中的异常表达,说明在乳腺癌的发生及发展中起重要作用。     

P120连环蛋白在鼻咽癌中的表达及其与细胞凋亡的关系

目的:研究鼻咽癌组织中上皮钙黏蛋白(E-cadherin)/P120连环蛋白(P120ctn)的表达情况,探讨它们与临床病理特征、细胞凋亡之间的关系.方法:应用免疫组化二步法、TUNEL技术检测56例鼻咽癌标本和15例正常鼻咽黏膜上皮标本中E-cadherin、P120ctn的表达情况以及鼻咽癌细胞凋亡情况.结果:鼻咽癌组织中E-cadherin和P120ctn的异常表达率分别为64.29%(36/56)和67.86%(38/56).E-cadherin和P120ctn的异常表达均与鼻咽癌的病理分型(分别为P=0.0118和P:0.001 0)、TNM分期(分别为P=0.020 8和P=0.012 4)、颈部淋巴结转移(分别为P=0.043 8和P=0.040 6)之间存在显著相关.P120ctn与E-cadherin在鼻咽癌组织中的表达呈正相关(r=0.521 7,P=0.0000).12例E-cadherin与P120ctn共同正常表达组癌细胞凋亡指数(AI)为0.3%～2.00/0(均数为0.83%),28例E-cadherin与P120ctn共同异常表达组癌细胞AI为0.1%～1.3%(均数为0.56%),无统计学差异(P=0.327 1).结论:鼻咽癌的发生发展过程中常发生E-cadherin与P120ctn的表达异常,与肿瘤的浸润、转移有关,可作为判断鼻咽癌生物学特征和预后的重要指标.鼻咽癌组织中E-cadherin与P120ctn的表达与癌细胞凋亡无直接相关关系.