siRNA抑制胃腺癌VEGF-C表达和淋巴管生成

目的 研究瘤内注射VEGF-C siRNA抑制胃癌移植瘤VEGF-C表达和肿瘤淋巴管生成的有效性.方法 建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型随机分为4组:VEGF-C sLRNA脂质体混合液组、单脂质体组、单siRNA组和PBS组,对肿瘤进行原位注射干预,记录各实验组肿瘤体积变化,免疫组织化学法检测各实验组肿瘤组织VEGF-C的表达,并通过抗人CD31和抗人LYVE-1单克隆抗体检测瘤体内血管和淋巴管生成情况.结果 免疫组化显示干扰组肿瘤细胞VEGF-C染色减弱,和对照组相比VEGF-C表达下调68.3%(P<0.01),而胃癌组织中淋巴管密度(LVD)值干预组和对照组分别为3.2±1.3、9.8±2.7,VEGF-C siRNA干预组LVD值下降至对照组的32.7%(P<0.01),而MVD值无明显差异(P>0.05).结论 瘤内注射VEGF-C siRNA能显著下调肿瘤组织内VEGF-C的表达,有效抑制肿瘤生长和瘤内淋巴管生成,而对肿瘤血管生成无影响.     

血管内皮生长因子C在胃腺癌中的表达

目的　检测VEGF C在胃腺癌组织中的表达及其表达与胃腺癌淋巴结转移的关系 ,从而探讨VEGF C与肿瘤淋巴道转移的关系。方法　采用免疫组化SABC法 ,检测 60例胃腺癌组织中VEGF C蛋白的表达及定位。结果　 60例胃腺癌组织中VEGF C染色阳性 2 5例 ,阳性物质主要位于肿瘤细胞胞浆内 ,在发生淋巴结转移的病例组 ,VEGF C的表达明显高于未发生淋巴结转移组。结论　VEGF C在胃腺癌中选择性地表达 ,其表达与胃腺癌的淋巴结转移密切相关。     

血管内皮生长因子C在胃腺癌中的表达

目的 检测VEGF-C在胃腺癌组织中的表达及其表达与胃腺癌淋巴结转移的关系，从而探讨VEGF-C与肿瘤淋巴道转移的关系。方法 采用免疫组化SABC法，检测60例胃腺癌组织中VEGF-C蛋白的表达及定位。结果 60例胃腺癌组织中VEGF-C染色阳性25例，阳性物质主要位于肿瘤细胞胞浆内，在发生淋巴结转移的病例组，VEGF-C的表达明显高于未发生淋巴结转移组。结论 VEGF-C在胃腺癌中选择性地表达，其表达与胃腺癌的淋巴结转移密切相关。     

胃腺癌的血管内皮细胞生长因子和KDR受体的表达及其临床意义

目的：研究胃腺癌的血管内皮细胞生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ, ＶＥＧＦ）及其受体 ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ）的表达,并探讨其临床意义。方法：应用免疫组织化学染色法检测ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ的表达,并分析其与６１例胃腺癌临床病理特征之间的关系。结果：胃腺癌组织ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ的阳性表达率分别为５５．９％和３９．３％;其中粘液腺癌和管状腺癌表达率较高（Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０１）,ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ表达率分别为７１．４Ｔ／４２．８％和６１．９％／５２．４％;ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ的阳性表达与ＴＮＭ分期有显著差异（Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０１）,阳性率为Ⅵ＞Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ期,Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ期的表达率分别为 ８０．０％／５０．０％,６８．２％／４５．５％,４０．０％／３０．０％和３６．８％／３１． ６％;胃腺癌并转移患者,ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ的阳性表达分别为７６．２％和４７．６％,远高于无转移的４５．０％和３５．０％（Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０１）;术后生存期小于１年的ＶＥＧＦ的表达率为６６．７％,明显高于术后生存期１年以上的５２．２％。结论：ＶＥＧＦ是胃腺癌血管生成的正向调     

靶向VEGF基因的siRNA体外抑制兔VX2细胞生长的研究

目的:探讨靶向VEGF基因的siRNA对兔VX2肿瘤细胞生长的影响。方法:采用化学合成法得到靶向兔VX2细胞VEGF基因的siRNA分子,应用脂质体将其转染体外培养的VX2细胞。转染48h后,RT-PCR法检测VEGF mRNA水平,ELISA法检测细胞分泌的VEGF蛋白,MTT法检测细胞生长活力。结果:VEGF-si1和VEGF-si3单独转染VX2细胞,细胞的生长抑制率分别为（38.5±7.3）%和（30.0±5.8）%,均显著高于scr-siRNA转染的对照组（P<0.01）;细胞VEGF mRNA表达水平分别为（0.37±0.06）和（0.45±0.07）,均显著低于对照组（P<0.01）;细胞分泌VEGF蛋白的抑制率分别为（58.1±7.3）%和（51.9±7.9）%,均显著高于对照组（P<0.01）。结论:VEGF siRNA分子在体外能特异地抑制兔VX2细胞的VEGF基因mRNA转录,VEGF蛋白分泌以及细胞增殖。     

Ad．VEGF．siRNA抑制荷人骨肉瘤裸鼠血管生成的形态学研究

背景与目的：血管内皮生长因子是骨肉瘤血管形成重要的促进因子,本研究通过抗血管生成方法,观察其抑制荷人骨肉瘤裸鼠血管生成的形态学表现。方法：取4～8周龄的Balb／c裸鼠作为实验动物,人骨肉瘤细胞株MG63皮下接种法构建骨肉瘤的动物模型。建模成功后将荷人骨肉瘤的裸鼠随机分为3组,每组15只。A组使用自行构建的Ad—VEGF-siRNA干扰新生血管形成;B、C组分别使用等剂量的Ad-EGFP或PBS作为对照。实验维持19d,药物使用后隔日测量肿瘤体积和体重．绘制肿瘤生长曲线：采用常规HE染色、VEGF和CD31相关抗原免疫组化染色观察各组肿瘤标本：各组随机抽取一个标本在透射电镜下观察仿血管发生的超微结构。结果：实验结束时,A组裸鼠瘤体体积为（0．31±0．18）cm^3,重量为（0．75±0．21）g,微血管密度（microvessed density,MVD）为5．79±0．34,VEGF表达为235228．09±123244．41,B、C照组裸鼠瘤体积分别为（1．21±1．29）cm^3、（1．43±0．95）cm^3;瘤重分别为（1．19±0．27）g、（1．19±0．35）g;MVD分别为11．00±0．68、10．42±0．10：VEGF表达分别为9641992．40±90479．62、981298．00±213590．50。A组肿瘤体积、重量、MVD和VEGF表达均显著低于B、C组。MVD和VEGF呈正相关关系,相关系数为0．9989。Ad-VEGF—siRNA组仿血管发生数量1．4000±0．5477,明显小于Ad—EGFP和PBS对照组。透射电镜可见肿瘤细胞形成的仿血管。结论：通过宏观和微观的形态学观察,证实Ad—VEGF-siRNA介导的以VEGF为靶向的抗血管生成能够抑制荷人骨肉瘤裸鼠的血管生成。     

siRNA CD31沉默 PECAM-1 对鼠源血管内皮瘤细胞VEGF表达的影响

目的： 研究siRNA CD31靶向沉默血管内皮细胞中血小板内皮细胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1 ）基因对鼠源性血管内皮瘤（murine hemangioendothelioma,EOMA）细胞增殖及其VEGF表达的影响。 方法: 实验分为裸siRNA CD31组、siRNA CD31-FAM组、稳定阴性对照 （SNC）组、空白对照（Opti-Med）组,以阳离子脂质体（RNAi-mate）为载体将化学合成的2′-O-甲基修饰的siRNA CD31转染体外培养的EOMA细胞,以激光共聚焦显微镜观察siRNA CD31的转染效果,以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测siRNA CD31对EOMA细胞增殖的影响,以RT-PCR、Western blotting分别检测EOMA细胞中 PECAM-1 、VEGF的表达水平。 结果 : 与SNC组和空白对照组比较,裸siRNA CD31和siRNA CD31-FAM转染的EOMA细胞中的 PECAM-1 mRNA和蛋白、VEGF mRNA和蛋白的表达量均显著降低（均P < 001）。与SNC组比较,裸siRNA CD31组、siRNA CD31-FAM组的EOMA细胞增殖抑制率明显上升［（1882±146）%、（1891±221）% vs （061±106）%,均P<001］。 结论: 采用siRNA CD31-脂质体复合物沉默EOMA细胞中的 PECAM-1 基因可抑制VEGF mRNA和蛋白的表达,从而抑制EOMA细胞的增殖。     

siRNA抑制VEGF基因表达对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

目的:应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人鼻咽低分化鳞状上皮细胞癌细胞株CNE-2中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,研究VEGF对鼻咽癌细胞生物学行为的影响.方法:构建针对VEGF的siRNA真核表达载体pU-VEGF-siRNA,将其表达载体经脂质体LipofectamineTM2000转染至CNE-2细胞,荧光显微镜下观察转染效率,采用RT-PCR、Western blot方法检测转染后CNE-2细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达.通过流式细胞仪分析细胞周期的分布,并应用平板克隆形成实验、Transwell侵袭小室模型观察转染后CNE-2细胞恶性生物学行为的变化.结果:pU-VEGF-siRNA转染后CNE-2细胞株中VEGF mRNA和蛋白表达较pU-siCONT组、空白对照组显著下降(P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降.结论:通过RNAi技术阻断VEGF的表达,可抑制CNE-2细胞的生长、增殖、迁徙,提示VEGF在鼻咽癌的发生、发展过程中起重要作用.     

高表达P73基因抑制肺腺癌细胞VEGF、bFGF mRNA表达

目的　观察高表达的p73基因对肺腺癌细胞生长曲线以及血管内皮生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)mRNA表达水平的影响 ,探讨高表达 p73基因在肺腺癌血管生成中的作用。 方法　将 p73α、p73 β以脂质体法转染A5 49细胞、H12 99细胞 ,采用细胞计数法绘制转染前后两种细胞生长曲线 ,RT PCR法半定量分析转染前后两种细胞中VEGF、bFGFmRNA的表达水平的变化。结果　转染p73基因后 ,A5 49细胞、H12 99细胞生长受到抑制 ,VEGF、bFGFmRNA表达水平下降 ,较未转染 p73基因的细胞有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ,其中 p73 β对VEGFmRNA表达的抑制作用更为显著 (P <0 .0 1)。 结论　高表达的 p73基因能够抑制肺腺癌细胞生长 ,降低肺腺癌细胞中VEGF、bFGFmRNA表达水平 ,提示高表达的 p73基因可能参与调控人肺腺癌VEGF和bFGF基因表达 ,从而起到一个抑癌基因的作用     

胃癌VEGF和nm23表达与血管生成的关系及其临床意义

目的 探讨血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）和ｎｍ２３与血管生成及胃癌发展的关系。方法 采用免疫组织化学Ｓ－Ｐ法对４０例胃癌组织中的ＶＥＧＦ、ｎｍ２３蛋白表达和微血管密度（ＭＶＤ）进行检测,分析其与胃癌组织学类型、浸润深度、淋巴结转移和预后的关系。结果 ＶＥＧＦ阳性者（ＭＶＤ）值显著高于阴性者（Ｐ〈０．０１）,ＶＥＧＦ表达率和ＭＶＤ值与胃癌浸润深度、淋巴结转移呈正相关（Ｐ〈０．０５）,ｎｍ２３高表达     

siRNA 抑制肝癌细胞DNA 修复门控基因表达的实验

 目的 本实验旨在研究siRNA抑制DNA修复门控基因Rad52、Ku70和Ku80的效果并筛选出高效的siRNA作用靶位。方法 依据siRNA设计原则，针对每一个门控基因的mRNA序列各选择了2个靶位点并构建了相应的siRNA表达载体（psiRNA1～6）。酶切分析及DNA测序鉴定重组质粒构建成功后，将其转染人肝癌细胞株HepG2。RT-PCR和WesternBlot分别用来检测psiRNAs在转录水平和翻译水平干扰靶基因的效果。结果 psiRNA1～6作用细胞后明显抑制了靶基因的表达。比较而言，psiRNA1、psiRNA4、psiRNA5干扰效果分别比psiRNA2、psiRNA3、psiRNA6更佳。结论 siRNA为进一步研究DNA修复门控基因Rad52、Ku70和Ku80的功能奠定基础。     

Ang-2、VEGF在进展期胃癌中的表达及与淋巴管生成的相关性分析

目的探讨Ang-2、VEGF在进展期胃癌中的表达及两者与胃癌淋巴管生成的相关性。方法对66例进展期胃癌患者采用免疫组化SP法检测胃癌癌周淋巴管阳性表达及胃癌组织中Ang-2、VEGF的阳性表达。结果胃癌组织中的Ang-2、VEGF阳性表达率分别为63．6％和54．5％,显著高于癌旁组织及正常组织,P〈0．05。胃癌组织中Ang-2、VEGF表达与TNM分期和有无淋巴结转移明显相关。Ang-2阳性表达组淋巴管密度平均为（15．32±3．25）个,显著高于阴性组的（12．65±2．51）个,P〈0．05;而VEGF阳性表达组淋巴管密度平均为（15．06±3．17）个,显著高于阴性组的（12．48±2．49）个,P〈0．05。结论进展期胃癌中Ang-2、VEGF能够促进癌周微淋巴管的生成,从而促进胃癌淋巴结转移。Ang-2、VEGF有望成为预测淋巴管生成以及淋巴管转移的重要指标。     

MAGE3 siRNA表达载体的构建及其沉寂作用

目的构建针对人MAGE3基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对MAGE3基因的干扰作用。方法设计MAGE3靶向的发夹状siRNA,依据设计合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pSUPER.neo载体,转化扩增后进行序列测定。用脂质体包裹转染胃癌细胞BGC823,采用RT-PCR检测MAGE3基因mRNA表达水平的变化。结果把针对MAGE3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆到pSUPER.neo载体,经过酶切鉴定与测序,结果正确;稳定转染人胃癌细胞BGC823后,RT-PCR检测显示,MAGE3基因的表达水平明显降低。结论成功构建了针对MAGE3基因的siRNA载体,转染细胞后可抑制MAGE3基因表达。     

靶向HPV18E6基因siRNA对HeLa细胞p21、VEGF、Bax 和Bcl-2基因的影响

 目的 探讨针对人乳头瘤病毒18型E6基因的特异性小干扰RNA（siRNA）对宫颈癌HeLa细胞p21、VEGF、Bax和Bcl-2基因的影响。 方法 采用脂质体法将特异性siRNA瞬时转染HeLa细胞,半定量RT-PCR检测siRNA转染后HeLa细胞中p21、血管内皮生长因子（VEGF）、Bax和Bcl-2 mRNA的变化,免疫组化检测HeLa细胞中p21和VEGF蛋白的变化。 结果 RT PCR检测结果显示转染后24、48、 72h p21和Bax mRNA的表达与转染前比较均有升高。转染后24、48、72h VEGF和Bcl-2 mRNA的表达与转染前比较均有降低。免疫组化检测结果显示转染后48、72h p21蛋白的表达与转染前比较均有升高。转染后48、72h VEGF蛋白的表达与转染前比较均有降低。 结论 靶向HPV18 E6基因的siRNA可有效干扰宫颈癌HeLa细胞中p21、VEGF、 Bax和Bcl-2基因的表达,从而抑制细胞增殖。     

稳定转染PGRMC1基因的小分子干扰RNA对卵巢癌细胞体外增殖的影响

摘要：目的观察稳定转染PGRMC1基因的小分子干扰RNA(siRNA)对卵巢癌COC1细胞体外增殖的影响。方法实验分为3组,重组载体组即由pcDNA3.1A- PGRMC1质粒转染COC1细胞;空载体组即仅转染空载体pcDNA3.1A质粒;空白组即未转染质粒组。3组均经抗性筛选获得稳定转染的细胞系。采用RT-PCR技术检测3组细胞中PGRMC1 mRNA的表达;四甲基偶氮唑盐比色法观察细胞增殖情况,绘制细胞生长曲线;裸鼠接种3组细胞后观察其成瘤能力的变化。结果（1）重组载体组细胞中PGRMC1 mRNA转染前、后的表达水平分别为(79.6±2.3)%和（29.4±1.6）%,两者比较,差异有统计学意义（P<0.05）;空载体组和空白组PGRMC1 mRNA转染前、后表达水平分别比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）重组载体组COC1细胞增殖速度明显慢于空载体组和空白对照组（P<0.05）;（3）接种转染后的COC1细胞后,重组载体组裸鼠的成瘤时间为（5.8±0.7）d,明显短于空载体组的（11.9±0.5）d和空白对照组的（12.6±0.9）d,差异均有统计学意义（P<0.05）;而空载体组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。接种5周后,重组载体组裸鼠的肿瘤重量和体积分别为（0.7±0.4）g和（197±26） mm³,明显低于空载体组[（2.3±0.4）g和（785±38）mm³ ]和空白对照组为[（2.5±0.8） g和（896±22） mm³ ],差异均有统计学意义（P<0.05）。结论PGRMC1 siRNA可显著降低卵巢癌细胞中的PGRMC1 表达,并对卵巢癌细胞的生长有抑制作用。     

Experimental study on the gene therapy of malignant glioma with antisense VEGF RNA

Objective: To study the effect of antisense VEGF RNA on rat C6 gliomas in vivo and find out the feasibility of antiangiogenesis therapy with antisense VEGF RNA formalignant gliomas. Methods: Parental rat C6 glioma cells and C6 cells transfected with antisense VEGF cDNA were implanted intracerebrally and subcutaneously into SD rats as control and transfected group. Rats bearing cerebral and subcutaneous C6 gliomas were treated with antisense VEGF cDNA as treated group and sense VEGF cDNA and empty vector as control of treated group. The general manifestation, survival time, MRI and histopathological changes of all rats were observed. The volume of subcutaneously implanted tumors was determined regularly. In situ hybridization and immunohistochemical staining were used for detection of VEGF gene expression of gliomas while PCNA immunostaining and TUNEL method for examination of proliferation activity and apoptosis of gliomas, respectively. Results: The survival of the rats in transfected and treated group was prolonged.There were two rats surviving over 90 d in the treated group and their tumors disappeared. The VEGF gene expression, the number of microvessels and the proliferation activity were decreased and a large amount of apoptotic cells could be found in cerebral and subcutaneous gliomas in treated and transfected groups. Conclusion:VEGF is one of the candidate genes for gene therapy of malignant gliomas. Antisense VEGF RNA combined with other therapies should be studied further for enhancing the therapeutic effect of malignant gliomas.     

慢病毒介导的siRNA干扰乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C表达的实验

目的研究慢病毒载体介导的siRNA对乳腺癌MCF-7细胞系VEGF-C表达的敲减作用。方法构建慢病毒VEGF-C/siRNA载体,转染乳腺癌MCF-7细胞,采用Real-time PCR检测MCF-7细胞在转染前后VEGF-C的mRNA表达,计算其转染效率和VEGF-C敲减率。结果慢病毒VEGF-C/siRNA转染效率超过80%,其VEGF-C的mRNA表达敲减率达50%。结论慢病毒VEGF-C/siRNA转染率高,能有效敲减VEGF-C的mRNA表达。     

COX-2、VEGF和EGFR预测鼻咽癌预后的价值

[目的]探讨环氧化酶-2（COX-2）、血管内皮生长因子（VEGF）、表皮生长因子受体（EGFR）预测鼻咽癌放疗后预后的价值。[方法]应用免疫组织化学S-P法,检测85例鼻咽癌组织中COX-2、VEGF、EGFR蛋白的表达情况,并分析三者表达与鼻咽癌预后的关系。[结果]COX-2阳性表达率为72.9%（62/85）,VEGF阳性表达率为64.7%（55/85）,EGFR表达阳性率为70.6%（60/85）。COX-2、VEGF、EGFR的表达均与鼻咽癌预后相关,表达阳性者生存率低于表达阴性者（P〈0.05）;三者联合分析可以进一步提高预测能力。[结论]COX-2、VEGF、EGFR的表达与鼻咽癌的不良预后密切相关,可作为预测鼻咽癌预后的重要的分子生物学指标,三者联合分析可以进一步提高预测能力。     

RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子表达

目的：应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法：将VEGF基因作为RNA干扰的靶区，通过E—RNAi网上提供的服务，设计两个特异的RNA干扰序列，将其装入含U6启动子的载体上，构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA（shRNA）表达载体，再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2，通过RT—PCR、Northern杂交和免疫荧光观察VEGF表达受抑的程度。结果：成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体，RT—PCR发现其在HEK293和HT29细胞系中，能明显抑制VEGF基因的表达，抑制率分别为72％和42％。但在Hela和HepG2细胞中的抑制率仅为28％和13％；Northern杂交显示，在HEK293细胞和HT29细胞中，VEGF mRNA明显受抑，抑制率达88％和89％；免疫荧光显示，在HT29细胞中，VEGF蛋白表达的受抑制率为73％。结论：针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达，但在不同细胞系中的作用强度存在差别。