大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方法的改进

背景:间充质干细胞在骨髓中的含量很低,需进行体外分离纯化和大量增殖.目的:优化骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增的方法,拟提高骨髓间充质干细胞的获得率和扩增率.设计、实施及地点:以细胞为对象的观察实验,于2007-03/2008-02在南方医科大学珠江医院血液科实验室进行.材料:实验动物为6～8周龄清洁级雄性大鼠,体质量130～150 g.方法:采用改进的贴壁法培养骨髓间充质干细胞:保留大鼠肱骨、股骨和胫骨,尽量将骨周边组织剔除干净,从而减少混杂的细胞;冲洗骨髓腔时,选用2.5 mL的注射器,可以将紧贴骨髓腔壁的骨髓间充质干细胞吹洗下来,从而提升获得率;细胞换液时未全部倾去旧培养液,保留了1/4～1/5的旧培养液;采用"二传一"的方法将两瓶原代细胞分别消化后合为一瓶,保证传代时对细胞数目的要求,能避免细胞过度老化.主要观察指标:倒置光显微镜和苏术精-伊红染色进行细胞形态学观察,流式细胞术进行细胞周期分析,MTT法和克隆形成实验测定细胞P1和P5生长曲线和克隆形成能力,用流式细胞仪和碱性磷酸酶对培养进行细胞鉴定.结果:分离的骨髓间充质干细胞人小较为均匀,基本上呈梭形或星形.原代培养细胞传代后,细胞增殖速度较快,基本上三四天传代1次,随传代次数的增加细胞形态趋于一致细胞基本为成纤维细胞型.流式细胞术证明G0G1期的细胞约占80%以上.细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第五天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢、克降能力降低.经流式细胞仪检测显示CD44、CD99阳性,CD45阴性,碱性磷酸酶试验为阳性.结论:采用改良的的方法获得了大量遗传性质均一、功能状态良好的骨髓间充质干细胞,并有效地提高了细胞的获得率和扩增率.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、纯化与培养适宜条件的筛选

目的:为获得大量、高纯度的骨髓间充质干细胞,筛选体外分离、纯化和培养的适宜条件。方法:实验于2006-08/2007-07在解放军兰州军区兰州总医院进行。①实验材料:2月龄SD大鼠,雄性,体质量(100±20)g,由解放军兰州军区兰州总医院实验动物科提供。②实验方法:分别采用全骨髓法(贴壁筛选法)和密度梯度离心法分离和纯化大鼠骨髓间充质干细胞。将采用密度梯度离心法获得的单个核细胞按1×107,1×108,1.5×108,2×108,1×109,2×109L-1的接种密度分别分成1～6组,接种在24孔板内,每组接种6孔。比较细胞出现伸展时间、原代培养时间。于细胞接种后第1,2,3,4,5,6天进行首次换液。将换下的部分细胞置于新的培养皿中进行培养,至少培养3d,观察是否还有新的贴壁细胞出现,以确定首次换液时间。观察体积分数为0.10,0.12,0.15,0.18,0.20血清对原代及传代后细胞生长的影响,比较不同浓度血清中细胞数量、集落形成率。集落形成率=集落数目/接种细胞数目×100%。采用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞细胞周期。选取第5代扩增的骨髓间充质干细胞,接近完全融合后进行成骨和成脂肪诱导培养。诱导剂分别为:10nmol/L地塞米松、0.05nmol/L抗坏血酸及10nmol/Lβ-甘油磷酸钠;1μmol/L地塞米松、0.5mmol/LIBMX、0.01mmol/L人胰岛素、0.01mmol/L吲哚美辛。并设未加诱导剂培养液培养的骨髓间充质干细胞对照。③实验评估:采用碱粒酶测定成骨诱导后细胞,采用油红O染色鉴定成脂肪诱导后细胞。结果:①细胞出现伸展时间、原代培养时间:密度梯度离心法培养细胞出现伸展时间与全骨髓法相比,差异无显著性意义。密度梯度离心法原代培养时间较全骨髓法长[(9.41±1.11),(14.73±2.86)d,P<0.05]。②不同接种密度对密度梯度离心法所获细胞生长影响:1×109L-1组细胞出现伸展时间及原代培养细胞融合时间较早。1×107L-1组培养20d内不能传代。③首次换液时间对细胞生长的影响:第5天开始在换下的液体中,很少有再贴壁的细胞出现。因此首次换液时间应为第5天。④不同体积分数血清对细胞生长的影响:在其他条件相同的前提下,骨髓间充质干细胞在含体积分数为0.12胎牛血清中细胞集落形成率最高。⑤成骨及成脂诱导:成骨诱导的骨髓间充质干细胞经碱粒酶测定,结果钙化结节呈蓝色。成脂诱导的骨髓间充质干细胞经油红O染色,苏木精-伊红复染后胞内脂滴呈桔红色,核呈蓝色。结论:采用密度梯度离心法分离纯化的骨髓间充质干细胞以1×109L-1密度接种,在含体积分数为0.12胎牛血清的MEM培养基中培养,生长状况良好,增殖速度快。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要.目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测.方法:通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化.结果与结论:大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上.生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃.第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达.成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性.全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能.实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

几种骨髓间充质干细胞体外培养特性的比较

背景：骨髓间充质于细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell．BMSC）可分化成多种非造血细胞系及寻踪损伤组织并进行修复，BMSC潜在的临床应用已被广泛研究，其生物学特性有待进一步探讨。目的：观察体外培养条件下几种不同种属骨髓间充质干细胞生物学特性。 设计：随机对照观察。 单位：解放军广州军区广州总医院医学实验科。 材料：实验于2004-06／2005—07在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。选择30只体质量为（16．0&;#177;2.0）g，出生35～40d的昆明小鼠；30只体质量为（160&;#177;20）g，出生约40d的SD大鼠；8只体质量（2．0&;#177;0．2）kg，出生80-90d的新西兰白兔。所有动物为清洁级，购自南方医科大学动物中心；10名健康志愿者的骨髓，所有健康志愿者年龄25—32岁，男女各半。 方法：采用Caplan实验室建立的方法制备小鼠和大鼠BMSC，通过髂骨穿刺取得骨髓液分离免和人的BMSC。光镜和电镜观察各种属BMSC形态，MTT法测各种属BMSC定生长曲线，免疫荧光细胞化学法和流式细胞仪分析各种属BMSC表面分子Stro-1的表达，并通过试剂盒检测碱性磷酸酶（AKP）活性、免疫组化检测骨钙素表达以及Von Kossa法显示钙盐沉积等手段评价BMSC对成骨诱导液（10nmol／L地塞米松，10mmol／L磷酸甘油和50mg／L抗坏血酸）反应性。成脂分化程度以含Oil Red-O-染色油滴的细胞百分数评估。 主要观察指标：①各种属BMSC的生长形态和生长曲线。②各种属BMSC标志物Stro-1的表达。③对成骨诱导液的反应。 结果：①光镜下观察的各种属BMSC生长形态明显不同，在成熟或老化阶段，小鼠细胞变扁平，呈不规则多角形，破碎时成点状沉积在瓶底；大鼠、家兔和人的细胞老化后体积明显增大。呈多边形，胞浆中出现空泡，呈棉絮状漂起、自瓶壁脱落。各种属BMSC多层重叠生长方式相同。均无接触抑制并分别含有两群细胞（一群可从单细胞长成克隆，迅速扩增；另一群零星散在分布，不进行增殖）。电镜显示所有原代细胞均有微绒毛，根据超微结构可分为2个亚群：一群细胞富有细胞器，以常染色体为主；另一群细胞器少，且以异染色体为主。各种属BMSC生长曲线基本一致。②人原代贴壁细胞BMSC标志物Stro-1的阳性率为（91．4&;#177;8．3）％，小鼠为（83．5&;#177;6．2）％。③在成骨诱导液中，小鼠BMsc向脂肪细胞分化，家免细胞死亡，大鼠和人细胞可被成功诱导为成骨细胞。BMSC在培养中有自发分化现象。 结论：小鼠、大鼠、家兔和人BMSC可在体外被大量扩增，得到以低／未分化细胞为主的、不同分化程度细胞的混合物；不同种属BMsc在形态学和对同一诱导液的反应性上存在差异。     

优化骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的优化方法.方法:全骨髓贴壁法分离、体外培养原代大鼠骨髓MSC,种植后3h首次换液,培养前72 h内频繁换液;通过流式细胞学方法检测原代培养细胞的MSC特征性表面标记的表达及比例;通过体外培养诱导成脂、成骨、成软骨分化,确立原代培养骨髓MSC的多向分化潜能.结果:早期、频繁换液的方法分离培养大鼠骨髓MSC,P0 MSC以单克隆生长,呈典型漩涡状排列,细胞形态均一;P1细胞均一表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45;原代培养骨髓MSC具有成脂、成骨、成软骨分化潜能.结论:全骨髓贴壁法分离培养大鼠原代骨髓MSC,早期、频繁换液有助于在早期获得高纯度细胞,原代细胞具有多向分化潜能.早期、频繁换液的全骨髓贴壁法是体外分离培养骨髓MSC的优化方法.     

人骨髓间充质干细胞的培养及多能性研究

目的：培养人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）并检测其多能性。方法：抽取人胚胎骨骨髓，Percoll分离液梯度分离后，将含MSC的低密度层培养于MSCGM培养基并扩增MSC。将MSC种植于裸鼠皮下，4周后观察MSC的分化情况。结果：成功地进行了MSC的原代和传代培养。植入裸鼠体内后MSC可分化成骨、软骨、脂肪、骨骼肌、肌腱样组织等结构。结论：人MSC是一种具有多能性的干细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10／2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1．073kg／L的Percoll分离液。方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞，在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

几种骨髓间充质干细胞体外培养特性的比较

背景:骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,BMSC)可分化成多种非造血细胞系及寻踪损伤组织并进行修复,BMSC潜在的临床应用已被广泛研究,其生物学特性有待进一步探讨。目的:观察体外培养条件下几种不同种属骨髓间充质干细胞生物学特性。设计:随机对照观察。单位:解放军广州军区广州总医院医学实验科。材料:实验于2004-06/2005-07在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。选择30只体质量为(16.0±2.0)g,出生35～40d的昆明小鼠;30只体质量为(160±20)g,出生约40d的SD大鼠;8只体质量(2.0±0.2)kg,出生80～90d的新西兰白兔。所有动物为清洁级,购自南方医科大学动物中心;10名健康志愿者的骨髓,所有健康志愿者年龄25～32岁,男女各半。方法:采用Caplan实验室建立的方法制备小鼠和大鼠BMSC,通过髂骨穿刺取得骨髓液分离兔和人的BMSC。光镜和电镜观察各种属BMSC形态,MTT法测各种属BMSC定生长曲线,免疫荧光细胞化学法和流式细胞仪分析各种属BMSC表面分子Stro-1的表达,并通过试剂盒检测碱性磷酸酶(AKP)活性、免疫组化检测骨钙素表达以及VonKossa法显示钙盐沉积等手段评价BMSC对成骨诱导液(10nmol/L地塞米松,10mmol/L磷酸甘油和50mg/L抗坏血酸)反应性。成脂分化程度以含OilRed-O-染色油滴的细胞百分数评估。主要观察指标:①各种属BMSC的生长形态和生长曲线。②各种属BMSC标志物Stro-1的表达。③对成骨诱导液的反应。结果:①光镜下观察的各种属BMSC生长形态明显不同,在成熟或老化阶段,小鼠细胞变扁平,呈不规则多角形,破碎时成点状沉积在瓶底;大鼠、家兔和人的细胞老化后体积明显增大,呈多边形,胞浆中出现空泡,呈棉絮状漂起、自瓶壁脱落。各种属BMSC多层重叠生长方式相同,均无接触抑制并分别含有两群细胞(一群可从单细胞长成克隆,迅速扩增;另一群零星散在分布,不进行增殖)。电镜显示所有原代细胞均有微绒毛,根据超微结构可分为2个亚群:一群细胞富有细胞器,以常染色体为主;另一群细胞器少,且以异染色体为主。各种属BMSC生长曲线基本一致。②人原代贴壁细胞BMSC标志物Stro-1的阳性率为(91.4±8.3)%,小鼠为(83.5±6.2)%。③在成骨诱导液中,小鼠BMSC向脂肪细胞分化,家兔细胞死亡,大鼠和人细胞可被成功诱导为成骨细胞。BMSC在培养中有自发分化现象。结论:小鼠、大鼠、家兔和人BMSC可在体外被大量扩增,得到以低/未分化细胞为主的、不同分化程度细胞的混合物;不同种属BMSC在形态学和对同一诱导液的反应性上存在差异。     

密度梯度离心结合贴壁法培养成年大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景:研究骨髓间充质干细胞的培养方法,以获取大量高纯度的骨髓间充质干细胞,对应用组织工程技术重建眼部组织治疗眼部疾病具有重要意义。目的:应用密度梯度离心结合贴壁法进行成年大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养,观察其生长特性及大量繁殖的可能性。设计:完全随机分组设计/重复测量实验。单位:中山大学中山眼科中心病理科实验室。材料:选用6周龄SD大鼠4只,雌雄不限,清洁级2级,体质量约250g/只,由中山大学动物中心提供,许可证号码SCSK(粤2004/0011)。DMEM/F12培养基(美国GIBCo公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)、胰蛋白酶、依地酸二钠、淋巴细胞分离液。纤维连接蛋白、CD44、CD34、CD31单克隆抗体,免疫组化二步法试剂盒(北京中杉生物技术公司)。方法:实验于2005-09/2006-01在中山大学中山眼科中心病理科实验室完成。①取SD大鼠,断颈处死后于750g/L酒精浸泡10min。无菌条件下,分离并暴露骨髓腔,用注射器吸入应用液直接插入股骨腔,用含肝素的培养液将骨髓腔里的细胞冲洗出来作为细胞混悬液,密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,观察活体细胞生长情况。②将第2代细胞接种于预置在培养板内的无菌盖玻片上,当细胞基本融合时,取出作原位甲醇固定10min,苏木精-伊红染色。原位丙酮固定10min,按二步法作免疫组织化学纤维连接蛋白、CD44、CD34、CD31反应,3,3’-二氨基联苯胺显色,最后将盖玻片反扣在载玻片上,封固、观察。③将细胞按4.25×107L-1的浓度接种于96孔板中,每孔200μL,置培养箱中,分别于接种后1,2,3,4,5,6d各于两排孔中加入20μL/孔四甲基偶氮唑盐,继续培养4h后吸去上清液,每孔加200μL二甲基亚砜,振荡5min后,于570nm波长测吸光度值,绘制细胞生长曲线。主要观察指标:①大鼠骨髓间充质干细胞活体培养观察结果。②2代细胞免疫组织化学染色观察结果。③接种后1,2,3,4,5,6d细胞生长曲线。结果:①刚接种入培养板的大鼠骨髓间充质干细胞于倒置显微镜下可见呈大小较一致的圆形,胞膜清晰,胞体透亮。第2天可见细胞已开始贴壁,3d后多数细胞伸出伪足,变成多角形、星形或不规则形。4d后细胞开始分裂繁殖,约12d细胞便基本单层融合,呈漩涡状排列。②对分离后所获得的细胞进行免疫组化染色,细胞CD44、纤维连接蛋白均阳性,CD34、CD31均阴性。③大鼠骨髓干细胞传代后第2天细胞数量就开始大量增加,至第5天数量达到顶点,细胞融合,生长达到平台期。结论:采用密度梯度离心结合贴壁培养法可获得较高纯度的骨髓间充质干细胞,是实用、便捷和可行的方法。并且在体外培养条件下能大量增殖,为应用组织工程技术治疗眼部疾病提供种子细胞。     

不同血清培养条件下骨髓间充质干细胞的增殖

背景:目前,分离培养骨髓间充质干细胞应用最为广泛的细胞生长添加剂是胎牛血清/4,牛血清,应用脐血清进行骨髓间充质干细胞培养的相关研究较少.目的:观察不同血清培养对骨髓间充质干细胞增殖的影响.方法:用Ficoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,在含脐血清、胎牛血清以及无血清的L-DMEM培养基中培养,观察各组细胞形态、增殖情况;应用流式细胞术对细胞表面抗原CD34、CD44、CD45、CD105进行表型鉴定.结果与结论:脐血清培养后细胞形态较小,似纺锤状,细胞呈网状生长;胎牛血清培养后细胞呈梭形成纤维细胞样,呈集落样生长;脐血清和胎牛血清均能促进细胞生长增殖,但骨髓间充质干细胞在脐血清中增殖更活跃,无血清培养基本无增殖.流式细胞鉴定显示CD34、CD45阴性,CD44、CD105阳性,脐血清扩增后骨髓间充质干细胞的表面标记无明显改变.     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10／12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5d后首次换液，细胞融合率达90％时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14d左右可达90％融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1～3d为潜伏期，3d后进入对数生长期，7～8d为平台期，平均倍增时间为24．22h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93．0％。结论：采用密度梯度离心联合差速贴擘、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

大鼠骨髓和脂肪来源间充质干细胞的成骨特性比较

背景:尽管骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞均具有向骨和软骨分化潜能,但终究带有各自来源组织的特点,那么是否意味着两者在非基因影响下成骨特性存在一定差异呢?目的:比较大鼠骨髓和脂肪来源的间充质干细胞在体外成骨分化中的特性区别。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-07/2008-03在中国科学院昆明动物研究所国家级重点实验室完成。材料:6周龄和18周龄SD大鼠各2只,分别用于制备骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞。方法:选取第3代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,按5×107L-1接种后各分为2组:诱导组加入含10-8mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养基1.5mL,未诱导组不加入成骨诱导培养基。主要观察指标:碱性磷酸酶染色与茜素红染色结果,碱性磷酸酶和骨钙素定量分析结果。结果:成骨诱导7,14d,经诱导的骨髓基质干细胞和脂肪间充质干细胞呈碱性磷酸酶阳性,有钙结节形成,未诱导组呈阴性。成骨诱导3,7,10d,未诱导组间比较碱性磷酸酶及骨钙素含量均基本相似(P>0.05);与未诱导组比较,脂肪间充质干细胞诱导组碱性磷酸酶及骨钙素含量均明显升高(P<0.05),骨髓间充质干细胞诱导组升高幅度更为显著(P<0.001)。结论:大鼠骨髓来源间充质干细胞体外成骨性能强于脂肪来源间充质干细胞,在骨组织工程种子细胞的选用中应优先考虑前者。     

不同培养条件下兔骨髓间充质细胞成骨特性的比较

目的:观察不同培养的条件下兔骨髓间充质细胞的成骨特性。方法:比较骨髓间充质细胞在普通培养基培养、诱导培养基培养和新鲜兔骨碎粒的共培养3种条件下的成骨分化特性,观察3种条件下细胞的形态及碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙素水平,并用免疫组化方法检测Ⅰ型胶原、骨钙素。结果:共培养及诱导培养的间充质细胞同期ALP活性及细胞内骨钙素均显著高于普通培养组(P<0.01),诱导培养最高;经过诱导培养及共培养的间充质细胞,其Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化阳性;对照组Ⅰ型胶原免疫组化弱阳性、骨钙素免疫组化阴性。结论:诱导培养及共培养条件呈现促间充质细胞向成骨方向转化的特点,诱导培养短期能使ALP、骨钙素达到较高水平。     

全骨髓贴壁培养大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨的定向诱导及鉴定

背景:许多分离纯化骨髓间充质干细胞操作繁琐、费用昂贵,且对细胞的活性影响较大,许多研究都致力于寻找有效且价格低廉的培养鉴定方法。目的:采用全骨髓贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞经体外进行成骨诱导和分化,并进行细胞鉴定。设计:观察对比实验。单位:青岛大学医学院。材料:实验于2005-11/2007-03在青岛大学医学院口腔研究室及分子生物学实验室完成,选用20只生后三四周Wistar大鼠,SPF级,雌雄不拘,体质量120～150g,由青岛市实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司,碱性磷酸酶检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,逆转录试剂盒为PROMEGA产品,引物由上海生工公司合成。方法:采用全骨髓培养法分离培养成年大鼠骨髓间充质干细胞,用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后分瓶,以5×10~7L~(-1)的密度接种于6孔培养板,诱导分化组加入诱导分化培养液,对照组加入等量基础培养液培养。①倒置相差显微镜观察细胞诱导分化结果及钙结节形成情况。②采用钙结节Von Kossa染色、钙结节茜素红染色进行诱导后细胞的生物学特性检测。③采用重氮盐法染色观察碱性磷酸酶活性。④RT-PCR检测细胞内成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。主要观察指标:①细胞诱导分化结果。②大鼠骨髓间充质干细胞诱导后细胞的生物学特性。③碱性磷酸酶活性。④成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达。结果:①诱导分化组加入诱导分化培养液后,9d后开始密集重叠生长,21～28d出现较多散在的致密圆形矿化结节。对照组细胞虽密集重叠生长,但不形成矿化结节。②诱导分化组成骨诱导21～28d形成明显的圆形或卵圆形肉眼可见的钙化结节。Von Kossa染色为黑色沉淀,茜素红染色为橙红色结节状,对照组未见钙结节形成。③诱导分化组诱导2周细胞碱性磷酸酶活性明显增高,对照组活性较弱。④诱导分化组经诱导后成骨细胞转录因子、骨钙素、成骨细胞特异性基因mRNA的表达均较强。结论:大鼠的骨髓间充质干细胞经全骨髓培养法体外诱导和分化,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。     

骨髓间质干细胞突变的致瘤肿瘤干细胞分离及培养

目的建立合适的骨髓间质干细胞突变的肿瘤细胞系F6(肿瘤干细胞)分离及体外长期培养方法并探讨其生物学特性。方法采用抗CD133-PE抗体经流式细胞仪分选F6肿瘤干细胞(F6 CSCs),研究不同培养体系对F6 CSCs体外生长的影响,探讨最适体外培养条件。结果一次分选获得F6 CSCs纯度达到80%。分选的F6 CSCs对Balb/c小鼠有体内致瘤能力,在含2%胎牛血清的L-DMEM营养液中可以长期稳定的培养,其CD133表面标志的表达维持在68.87%。结论低浓度胎牛血清的培养液能维持F6 CSCs的生长并保留其相应的生物学特性,这为肿瘤干细胞体外培养及研究提供了新的思路和方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离培养及鉴定

背景:骨髓间充质干细胞的分离和培养扩增至今缺乏统一的方法.内皮祖细胞可以由外周血或骨髓中的单个核细胞诱导分化而成,但因获取骨髓单个核细胞的方法各异,分离效果亦有较大差异.目的:拟在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,并对其进行鉴定.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-10/2009-02在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成.材料:清洁级健康雄性SD大鼠2只,由安徽省动物中心提供.方法:抽取大鼠骨髓,通过密度梯度离心法提取单个核细胞,采用差速贴壁法分离骨髓间充质干细胞.原代骨髓间充质干细胞培养48h后,收集未贴壁细胞,加入含胎牛血清、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、重组人上皮生长因子的EGM-2完全培养液诱导骨髓间充质干细胞向内皮祖细胞分化.设立3组:分别为早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞、2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞、大鼠成熟主动脉内皮细胞,采用硝酸还原酶法间接测量细胞培养液中一氧化氮的含量.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞体外培养情况,细胞培养液中一氧化氮的含量.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,24 h内大部分细胞贴壁,9～10 d可达90%融合,纯化扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭性,传代周期为8 d左右,流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞C034,CD45呈阴性,CD105呈阳性.2次贴壁的内皮祖细胞培养3 d内贴壁,6 d形成集落,8～10 d出现条索状结构,呈微血管样生长,2周时大部分细胞呈多角形,细胞集落相互连接,呈典型的"铺路石"样,7～10 d细胞Dil-acLDL、FITC-UEA-1双染呈阳性,流式细胞仪检测Flk-1,CD133阳性.2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞培养液中一氧化氮含量明显高于早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞(P<0.05),但低于大鼠成熟主动脉内皮细胞(P<0.05).结论:差速贴壁法能有效地分离、纯化、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,加入多种细胞生长因子诱导后具有较强地向内皮细胞方向分化的能力,且2次贴壁细胞已具有部分内皮细胞的功能.     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点

背景:黄芪提取物有较好的抗氧化、清除氧自由基的作用,加之骨髓间充质干细胞的多向分化潜能及其自体移植的优越性,可能为神经退行性疾病的治疗提供新的方式.目的:探讨黄芪诱导后大鼠骨髓间充质干细胞的分化特点.设计:细胞学体外观察.材料:清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心.黄芪注射液批号060105,为大理药业有限公司产品.方法:全骨髓法体外分离培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代时,按4×108L-1密度接种于置有盖玻片的12孔板内,制备细胞爬片.盖玻片上细胞达80%～90%融合后全量换液,加入含200 g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基连续诱导6 d;对照组DMEM培养基中不加入黄芪注射液.主要观察指标:倒置显微镜观察诱导前后骨髓间充质干细胞的形态变化,诱导后免疫细胞化学染色鉴定特异性标志物的表达.结果:原代培养的骨髓间充质干细胞多呈圆形,扩增至第4代后细胞形态多呈梭形或成纤维细胞状,诱导后细胞形态发生改变,自胞体长出突起,随诱导时间延长,长出突起的细胞数量逐渐增多,部分突起末端呈分叉状,可见网络状连接.免疫细胞化学染色结果显示,诱导第3天巢蛋白阳性细胞、神经元特异性烯醇化酶阳性细胞和神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较多,诱导第6天微管相关蛋白2阳性细胞较多.结论:黄芪首先诱导骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化,然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化,并能够使已分化细胞的进一步成熟、老化.