黄病毒多功能酶NS3研究进展

黄病毒非结构蛋白NS3是一个具有多种酶活性的蛋白,其N端为丝氨酸蛋白酶结构域,C端为RNA解旋酶／核苷三磷酸酶／RNA 5’三磷酸酶结构域。NS3在病毒前体蛋白的加工和病毒基因组的复制过程中发挥重要功能。对NS3的研究有助于新型疫苗和抗病毒药物的设计。本文试图对近年来NS3研究的进展情况进行一简要的回顾。     

登革2型病毒NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域的原核表达及活性研究

目的 表达登革病毒非结构蛋白NS3 NTPase／RNA解旋酶结构域（dNS3），纯化表达产物并对其活性作初步研究。方法提取感染登革2型病毒的BHK-21细胞总RNA，RT-PCR扩增目的基因，经NcoⅠ、HindⅢ双酶切后连入表达载体pET28a，转化宿主菌BL21（DE3），优化诱导表达条件，SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达蛋白。表达产物经亲和层析纯化，超滤浓缩脱盐，孔雀绿钼酸铵法检测NTPase活性。结果成功构建重组表达载体pET28a-dNS3并在大肠杆菌中获得可溶性表达，纯化产物经测定具有良好的NTease活性及抗原性。体外条件下证实登革2型病毒非结构蛋白NS5（RDRP）对dNS3的ATPase活性有促进作用，提示在病毒复制时NS3与NS5间的相互作用对NS3的生物活性及对病毒复制过程可能具有调控作用。结论本研究为基于抑制NS3 NTPase／RNA解旋酶活性的抗病毒药物的筛选提供了实验依据。     

蚊浓核病毒非结构蛋白1的生物信息学分析

目的 通过生物信息学分析软件对蚊浓核病毒(mosquito densovirus,MDV)菲结构蛋白1(Nostructual proteinl,NS1)的结构与功能进行分析预测.方法 应用EXPASY pmtparam tool、ClagtalX1.83、Bioedit、MEGA3.1、ScanProsite、Motifscan等分析软件和在线生物信息学分析工具对MDVNS1的理化特性、同源性、进化关系、二级结构与主要功能结构域进行分析预测.结果 MDV NSI属不稳定亲水性蛋白,氨基酸序列高度保守,与虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)进化距离较近;MDV NSI具有小分子DNA病毒编码的解螺旋酶超家族3(Saperfamily 3 helicage of DNA viruses)的结构域,该结构域包含有NTP-binding区域,使其具有金属离子依赖的ATPase的活性,蛋白靠近N端包含有病毒滚筒复制rolling-circle replication(RCR)起始蛋白的结构域并具有单链切口酶的生物学功能.结论 生物信息学预测结果提示MDV NS1蛋白在病毒的复制、包装等各个阶段起关键性作用.     

HCV NS3/4A介导的逃逸机体固有免疫研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链RNA病毒,归类于黄病毒科、肝炎病毒属,有6个基因型.HCV基因组含有约9600个碱基,编码一条约3010个氨基酸的多聚蛋白前体,该多聚蛋白在翻译的同时或之后被宿主和病毒的蛋白酶剪切加工成至少10种成熟蛋白,包括结构蛋白Core、E1、E2和p7,非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B.其中HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶不仅是HCV多聚蛋白前体加工成熟的关键酶,而且还通过调控干扰素调控因子(IRF)-3的表达水平,从而破坏细胞内固有免疫通路,使病毒能够逃避宿主的固有免疫反应,并形成长期的持续性感染[1].     

p7蛋白--丙型肝炎病毒潜在抑制靶点

丙型肝炎（hepatitisc）是严重的慢性传染病之一，全世界病毒感染者约1．7～2亿。HCV为单链RNA病毒，一个开放读码框编码了3010个氨基酸的前体蛋白，在细胞和病毒蛋白酶共同作用下，前体蛋白被降解成结构蛋白和非结构蛋白两部分。结构蛋白包括核心蛋白（C）和膜蛋白（E1、E2）以及p7蛋白，非结构蛋白包括NS2、NS3、NS4A、NS4B、NSSA和NSSB。p7蛋白结构、功能仍然了解甚少。最近有研究发现p7蛋白可能是一个重要的病毒抑制靶点。     

丙肝病毒NS5A蛋白对NS5B的RdRP活性影响的研究

丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus,HCV )非结构蛋白 (Nonstructural,NS) 5 A在 HCV基因组复制中的作用目前尚不清楚。本文研究 His- NS5 A对 NS5 B的 RNA依赖性 RNA酶 (Rd RP)活性的影响 ,以了解 NS5 A在HCV RNA复制中的作用。采用变性 -复性方法 ,纯化大肠杆菌表达的重组组氨酸 NS5 A融合蛋白。 GST结合洗脱实验 (GST pull- down assay)研究 NS5 A和 NS5 B是否结合。以不同的摩尔浓度比 ,将纯化的 NS5 B和 NS5 A蛋白混合 ,检测 NS5 A对 NS5 B的 Rd RP活性的影响。获得高得率的纯化 His- NS5 A蛋白。重组 NS5 A蛋白可在体外与NS5 B结合并抑制后者的 Rd RP活性。本研究报道了纯化重组 His- NS5 A蛋白的变性 -复性方法 ,结果显示纯化的重组 NS5 A在体外可与 NS5 B相互结合 ,并明显抑制 NS5 B Rd RP活性。提示了 HCV NS5 A在病毒复制中的可能作用。     

重组甲型流感病毒NS2蛋白抑制感染小鼠肺组织干扰素的产生

目的用大肠杆菌表达获得甲型流感病毒(IAV)非结构蛋白2(NS2),并观察NS2蛋白对小鼠肺组织γ干扰素(IFN-γ)产生的影响。方法构建p ET22b(+)/NS2原核表达质粒并转化大肠杆菌Rosetta-gami(2),通过诱导表达、纯化获得NS2。将40只BALB/c小鼠,随机分8组,分别为正常对照组、200μg/kg NS2联合病毒组、200μg/kg NS2联合RNA组、100μg/kg灭活病毒、0.2×半数致死量(LD50)病毒组、50μg/kg病毒RNA组、200μg/kg NS2组和100μg/kg NS2组,各组滴鼻给予小鼠处理。通过反转录PCR、Western blot法分别检测肺组织IFN-γ的mRNA和蛋白表达。结果在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达并纯化获得重组NS2;将NS2或/和IAV滴鼻给小鼠后,反转录PCR和Western blot法检测表明NS2联合病毒组的小鼠肺组织IFN-γmRNA和蛋白水平较病毒组均降低。结论 NS2抑制IAV所诱导的小鼠肺组织IFN-γmRNA和蛋白的水平。     

HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究进展

丙型肝炎病毒感染最显著的特征是慢性化,已经成为严重的社会公共卫生问题.目前治疗方法仅限于干扰素-利巴韦林联合使用,持续疗效有限而且副作用大,因此迫切需要寻找特异有效的抗病毒药物.HCV NS3基因编码的NS3蛋白具有丝氨酸蛋白水解酶、解旋酶和磷酸核苷酶活性,在病毒RNA复制和多聚蛋白前体的加工成熟中有着重要作用.因此,NS3丝氨酸蛋白酶的抑制剂是抗病毒的理想药物.本文就HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究综述如下.     

HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究进展

丙型肝炎病毒感染最显著的特征是慢性化，已经成为严重的社会公共卫生问题。目前治疗方法仅限于干扰素-利巴韦林联合使用，持续疗效有限而且副作用大，因此迫切需要寻找特异有效的抗病毒药物。HCV NS3基因编码的NS3蛋白具有丝氨酸蛋白水解酶、解旋酶和磷酸核苷酶活性，在病毒RNA复制和多聚蛋白前体的加工成熟中有着重要作用。因此，NS3丝氨酸蛋白酶的抑制剂是抗病毒的理想药物。本文就HCV NS3丝氨酸蛋白酶及以其为靶位的抗感染研究综述如下。     

西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体。方法:以原核表达的重组NS1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以真核表达的重组NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。并利用Western blot和IFA试验对所获得的单克隆抗体进行鉴定。结果:共获得了2株稳定分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为WN-1C10和WN-3D10,其亚类鉴定分别属于IgG2a和IgG1。这2株单克隆抗体均能与西尼罗病毒NS1蛋白和病毒抗原发生特异性反应,而与日本脑炎病毒无交叉反应。结论:本实验成功制备出针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体,为我国建立西尼罗病毒与日本脑炎病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白标记的重组丙型肝炎病毒体外细胞培养系统的建立

目的 构建一个易检测且灵敏度高的丙型肝炎病毒(HCV)细胞感染模型,为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的筛选提供一个有效的体外细胞培养体系.方法 利用重组PCR技术在HCV的非结构蛋白NS5A的C端引入优势突变点V2440L,然后在其RsrⅡ酶切位点插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因,基因测序及酶切鉴定重组基因序列构建成功后,体外转录获得RNA,然后转染入肝癌细胞系Huh7.5,用Western blot检测EGFP与NS5A融合蛋白,用细胞免疫荧光(IFA)检测病毒复制水平和EGFP表达情况.用RT-PCR检测转染细胞培养液不同时间点的HCV RNA水平.用IFN-α鉴定该系统用于抗丙型肝炎药物筛选的可行性.结果 在重组病毒JFH1-2440-EGFP RNA转染的细胞内可检测到EGFP的表达,EGFP表达水平与病毒复制水平一致.转染细胞的培养上清液能感染新的Huh7.5细胞,IFA结果显示转染后第9天培养上清液的病毒滴度为104 FFU/ml,提示JFH1-2440-EGFP RNA转染的细胞能释放有传染性的HCV病毒颗粒.RT-PCR检测结果显示转染细胞上清液中的HCV RNA在转染72 h后可达到3.06×105拷贝/ml,第9天可达到7.96×106拷贝/ml.EGFP的表达呈干扰素浓度依赖性.结论 构建的重组病毒HCVJFH1-2440-EGFP体外细胞培养系统具有经济、快速、敏感等优点,为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的筛选提供了一个有效的工具.     

嗜肝DNA病毒核衣壳装配的研究进展

嗜肝 DNA 病毒核衣壳装配是病毒复制周期的一个中心环节,需要3种病毒成分(前基因组 RNA、核心蛋白、多聚酶蛋白)特异和有次序地相互作用。研究表明:核心蛋白的氨基端具有自我组装核壳的能力,而羧基端具有结合核酸、稳定核壳的作用;多聚酶蛋白的4个区域均为介导前基因组 RNA 包装所需:前基因组 RNA 上存在的包装信号决定其选择性包装。本文最后讨论了嗜肝 DNA 病毒核衣壳装配研究的潜在应用价值。     

寨卡病毒NS4A蛋白影响小鼠大脑皮质神经元的迁移

目的在体研究寨卡病毒(Zika virus)NS3和NS4A蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响。方法通过c DNA末端快速扩增技术(RACE)及反转录PCR测定Zika病毒SZ01株基因组的开放阅读框,确定NS3和NS4A蛋白编码序列,构建融合Flag标签的p CIG蛋白表达载体。通过子宫内电转技术在E13.5 d小鼠的大脑皮质的神经前体细胞中表达病毒蛋白。免疫组化检测Flag标签、TBR1与e GFP,观察表达NS3和NS4A蛋白的细胞在E18.5 d大脑皮质中的分布,评估Zika病毒蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响。结果 1)NS4A的氨基酸序列与NCBI数据库一致,NS3存在1处氨基酸位点突变。2)Flag标签荧光信号与e GFP荧光共定位,提示e GFP可以指示病毒蛋白在皮质中的表达。3)TBR1荧光显示在体表达NS4A后,神经元的分布与p CIG对照组及表达NS3相比有显著差异(P0.001)。结论在体表达Zika病毒的NS4A蛋白可能影响神经元迁移。     

TIMP-3N端结构域重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建N-TIMP3重组腺病毒载体,为深入研究组织金属蛋白酶抑制因子-3(tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP-3)N端结构域对胰腺癌的作用奠定基础.方法 PCR扩增编码人TIMP3信号肽及其N端结构域的DNA序列,定向克隆至空载穿梭质粒pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-N-TIMP3,并测序鉴定.将重组pShuttle-N-TIMP3转化BJ5183感受态细菌,与其内的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,构建重组腺病毒载体pAd-N-TIMP3,并经酶切与PCR鉴定.将线性化的重组载体转染QBI-293A细胞包装病毒,TCID50法检测病毒滴度,用Western 印迹检测目的 蛋白的表达.结果 重组腺病毒载体pAd-N-TIMP3经鉴定正确,病毒滴度为5×108 PFU/ml,并检测到目的 蛋白的表达.结论 成功构建了重组腺病毒载体pAd-N-TIMP3.     

病毒对宿主PKR信号转导途径抑制作用的研究进展

干扰素(interferon,IFN)诱导的双链RNA激活的蛋白激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase,PKR)的激活是细胞抵御病毒感染的重要机制之一,活化的PKR可磷酸化真核起始因子2(eukaryotic initiation factor2,elF2)的α亚基,导致病毒蛋白合成停止,因此,PKR信号转导途径异常与病毒持续感染密切相关.@@1 PKR的结构与功能@@人类PKR基因位于染色体2p21-22,属于丝/苏氨酸蛋白激酶亚家族的成员,为一种双链RNA (double-stranded RNA,dsRNA)结合蛋白,相对分子质量为68kDa,含551个氨基酸.PKR由氨基末端的调节结构域和羧基末端的催化结构域构成,后者含有11个保守的激酶亚结构域,其中位于296位的赖氨酸在磷酸化反应时结合ATP.     

西尼罗病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定

目的以西尼罗病毒非结构蛋白(nonstructural protein1,NS1)为免疫原制备西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体,并鉴定其特异性。方法在表达具有良好抗原性的重组西尼罗病毒NS1蛋白基础上免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光(IFA)和免疫印迹对所获得单克隆抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制试验对m Ab识别的抗原位点进行分析。结果获得39株特异性针对西尼罗病毒NS1蛋白的单克隆抗体,Ig亚类测定结果Ig G3和Ig G2a单抗各2株,Ig G2b单抗5株,Ig G单抗1株,另外29株均为Ig G1。结论成功获得了特异性针对西尼罗病毒NS1蛋白的单克隆抗体,将为进一步建立西尼罗病毒NS1抗原检测方法及探讨NS1蛋白及抗体在西尼罗病毒发病机制中提供依据。     

破坏HCV组装病毒体的重要基因

据美国BIOCOMPARE科技新闻网（2008／4／11）报道，HCV（Hepatitis C Virion，C型肝炎病毒）是一种危害人类极严重的病毒体，全球感染率超过3％，在美国估计有400万人受到感染。美国佛罗里达州Scripps感染学院的研究人员发现，将病毒的NS5A磷酸蛋白进行突变，能够破坏病毒体的产生。研究人员表示：NS5A磷酸蛋白主要负责RNA的复制工作，一旦此蛋白被破坏，HCV就无法正常组装完成病毒体，显示此NS5A磷酸蛋白对HCV的重要性。     

乙脑病毒持续感染模型中变异株性状及NS3区序列分析

目的　研究乙脑病毒变异性状与NS3区基因序列的关系。方法　应用乙脑病毒野生株及一种人肝癌细胞KN73建立持续感染模型 ,采用标准胰蛋白酶消化技术进行细胞传代 ,经反复冻融法收集细胞内变异病毒。采用BHK细胞空斑实验方法进行病毒滴定 ,利用NS3区特异引物进行逆转录 多聚酶链反应以获NS3区基因片段 ,应用ABI PRSMTM310测序系统进行序列分析。结果　在早期 (感染后 2 4～ 36h)细胞培养液中病毒量为 10 6PFU/ml,在后期 (感染后 3年 )细胞培养液中病毒量为10 3～ 4 PFU/ml,细胞内病毒含量一直维持在 10 2～ 3PFU/ml水平。NS3区测序结果可见 :位于核苷酸碱基序列上第 6 6位C→U ,第 72位A→C ,第 2 94位U→C ,第 30 6位A→G及第 342位A→G ,但相应编码的氨基酸未发生变异。结论　变异株存在性状变异 ,即增殖性低于野生株 ;NS3区编码蛋白对野生株及变异株均至关重要 ,亦提示病毒性状变异的原因可能由其它区域蛋白变异或病毒与宿主间蛋白相互作用所致     

LncRNA ANRIL对缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞焦亡及NLRP3炎性体通路的影响

目的 探讨长链非编码RNA(LncRNA)的INK4基因座中反义非编码RNA(ANRIL)对缺氧/复氧(A/R)诱导的H9c2心肌细胞焦亡及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性体通路的影响.方法 qRT-PCR检测LncRNA ANRIL在A/R诱导的H9c2细胞中的表达;通过慢病毒转染构建抑制LncR...