L型伤寒沙门菌兔感染实验

为了更好地做好伤寒的防治工作，加强病原学研究，对在江西萍乡某村发生的一起伤寒流行中分离出的L型伤寒杆菌，进行了动物感染试验，并对动物的致病性进行了观察，应用脉冲场凝胶电泳和侵袭相关基因spa0的测序，进行了基因多态性分析，证实这种基因类型是国内首次发现的一种新的类型。用这种方法能使感染兔患病，感染动物的细菌与接种的细菌完全一致。表明建立的这种动物模型，既经济又简单，对病原学研究、疾病防治都具有重要意义。     

PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节初探

目的:探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响.方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异,并选择部分差异表达基因进行RT-RCR验证.结果:经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调,有22 个基因表达下调.结论:PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期的基因表达调节中发挥重要作用.     

伤寒沙门菌fljA样基因表达载体的构建

目的：进一步明确二相伤寒沙门菌鞭毛抗原表达调节机制，系统分析伤寒沙门菌fljA样基因功能，构建含倒样基因的表达载体并验证其表达。方法：根据倒样基因两端序列设计引物，以z66抗原阳性伤寒沙门菌GIFU10007基因组为模板，通过PCR获得该基因，与表达载体pET22b连接后，重组体转化至大肠杆菌JM109中诱导培养，并通过RT-PCR观察傅4样基因表达情况。结果：基因克隆和序列分析结果显示伤寒沙门菌庳4样基因被成功导入载体pET22b，RT-PCR结果提示大肠杆菌JM109可利用此重组载体进行西4样基因表达。结论：成功获得能在大肠埃希菌中表达伤寒沙门菌西4样基因的载体。     

伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究

目的:探讨伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能.方法:用载体pBAD介导回补uhpA至伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株,用qRT-PCR观察cysM和treB基因表达,用表达载体pET-22b原核表达UhpA蛋白,用凝胶阻滞试验观察UhpA蛋白与cysM和treB启动子区域DNA片段的结合.结果:成功构建pBADuhpA重组质粒,在uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因后,cysM和treB的表达明显恢复,但UhpA-His6蛋白与cysM和treB的启动子区域DNA片段无明显结合.结论:伤寒沙门菌UhpA在高渗应激条件下能促进硫代谢及海藻糖代谢相关基因表达,且可能为间接作用.     

mig-14对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的调节

目的:探查伤寒沙门菌mig-14在高渗应激下对若干基因表达的调节作用.方法:用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌mig-14基因缺陷变异株,用基因芯片分析高渗应激早期野生株和mig-14缺陷株基因表达差异,并对部分结果采用实时荧光定量PCR进行验证.结果:成功制备伤寒沙门菌mig-14缺陷株,高渗应激早期mig-14变异株与野生株相比有77个基因表达下调和72个基因表达上调. 结论:mig-14可能是一种调节基因,主要参与调节细菌的物质和能量代谢.     

Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期基因表达的调节

目的：探查伤寒沙门菌hfq基因在高渗应激早期对其他基因表达的影响。方法：用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术,比较伤寒沙门菌野生株和咆向基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异,并选择部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果：伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调,有32个基因表达下调。实时定量PCR结果与芯片分析一致。结论：Hfq作为一个调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

非编码小RNA T64对伤寒沙门菌基因表达的影响

目的: 对由转录组测序获得的伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)非编码小RNA(small non-coding RNA,snRNA)T64的表达进行验证,并对其功能进行初步探讨。方法: 选取特异性引物采用反转录PCR(RT-PCR)和普通PCR确认T64在S.Typhi中的表达;将含有T64 snRNA序列的重组质粒导入S.Typhi野生株构建T64高表达株;结合应用S.Typhi全基因组芯片分析技术,比较S.Typhi T64高表达株和空载体对照株在对数期基因表达谱差异,并对部分基因芯片结果进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。结果：RT-PCR结果显示,snRNA T64在S. Typhi确有表达;基因芯片分析结果显示,与空载体对照株比,snRNA T64高表达株在对数期有20个基因表达上调,7个下调;4个被选基因表达的qRT-PCR结果与芯片分析结果相符。结论： snRNA T64在S. Typhi中表达,可能在基因的表达调节中发挥重要作用。     

LuxS/AI-2对伤寒沙门菌基因表达的调节

目的:探讨伤寒沙门菌luxS基因在葡萄糖存在下对细菌对数生长中期基因表达调控的影响.方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌luxS基因缺陷变异株;比较野生株与缺陷株的生长情况及动力差异;用哈氏弧菌BB170作为报告菌株检测不同时期野生株与缺陷株的生物发光;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术,比较在葡萄糖存在下伤...     

SsrB对伤寒沙门菌氧应激早期基因表达的调节

目的:研究伤寒沙门菌ssrB基因在氧应激早期对其他基因表达的调节.方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和ssrB基因缺陷变异株在氧应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证;利用HeLa细胞进行细菌侵袭实验,研究ssr...     

OsmY缺失对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的影响

目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节。方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果:成功制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;基因芯片结果显示,在高渗应激早期,与野生株相比,伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株有128个基因表达下调,有27个基因表达上调。实时定量PCR与芯片结果一致。结论:OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

伤寒沙门菌基因组DNA芯片基因表达谱分析技术的建立与优化

目的: 建立和优化基于伤寒沙门菌全基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术.方法: 提取伤寒沙门菌野生z66阳性菌株总RNA,以6,9核苷酸随机引物(N6、N9)和(或)基因组特异引物(GDP)反转录合成cDNA,用荧光素Cy5或Cy3直接掺入标记后,与包括伤寒沙门菌4201个蛋白编码基因的伤寒沙门菌全基因组芯片杂交,用芯片扫描仪扫描后获得表达谱分析结果,经过数据标准化处理后进行分析.结果: 采用N9+GDP混合引物,直接掺入法标记时,既能获得较好标记效果,又能节约试剂成本,同时可减少繁琐步骤所引起的不必要失误.结论: 建立的基于伤寒沙门菌基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术,为细菌的基因表达调控及功能基因组学研究提供了平台.     

伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株的制备

目的:为深入研究伤寒沙门菌调节因子phoP的功能,制备伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株.方法:根据伤寒沙门菌phoP基因序列,设计PCR特异性引物,并在5′末端加接酶Bgl Ⅱ位点,PCR扩增phoP基因上、下游片段后,用Bgl Ⅱ消化,再定向连接成phoP基因的缺损性同源性核苷酸片段.将此片段胶回收后并导入自杀质粒pGMB151的BamH Ⅰ位点,将阳性质粒用电转化导入伤寒沙门菌野生株,进行同源重组.用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为phoP基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定.结果:PCR及序列分析证实,缺陷变异株的phoP基因缺失297个碱基.结论:成功构建伤寒沙门菌phoP基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌中的功能奠定了基础.     

OmpR对伤寒沙门菌侵袭上皮细胞能力的影响

目的: 研究OmpR对伤寒沙门菌侵袭力的影响及相关分子机制。方法: 利用空载体对照株(WT pBAD33)、ompR缺陷株(ΔompR pBAD33)和ompR回补株(C ΔompR)进行HeLa细胞侵袭实验,探究伤寒沙门菌OmpR对于HeLa细胞侵袭力的影响。进一步用荧光实时定量PCR(qRT PCR)、凝胶阻滞实验(EMSA)分析伤寒沙门菌OmpR对侵袭相关基因iagA、invF、prgH的调控作用。结果： 成功制备伤寒沙门菌C ΔompR。在HeLa细胞侵袭实验中,ΔompR pBAD33侵袭力显著低于WT pBAD33(P<0.01),而C ΔompR侵袭能力较ΔompR pBAD33明显升高（P<0.01）;qRT PCR结果显示,ΔompR pBAD33中侵袭相关基因iagA、invF、prgH的转录水平较WT pBAD33明显下降(P<0.01);EMSA结果表明,OmpR可直接与prgH基因启动子区域结合,与iagA和invF基因启动子区域未有结合。 结论： OmpR通过直接调节prgH和间接调节iagA、invF增加侵袭相关基因的表达,从而增强伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力。     

鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株的制备

目的: 为进一步研究鼠伤寒沙门菌毒力基因spvC的功能,制备鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株。方法: 根据鼠伤寒沙门菌spvC基因序列,设计PCR特异性引物,制备spvC基因缺陷性同源性核苷酸片段,导入自杀质粒pCVD442后再导入鼠伤寒沙门菌野生株,进行同源重组,用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为spvC基因的缺陷变异株,并通过核苷酸序列分析加以确定。结果： PCR及序列分析证实,缺陷变异株的spvC基因缺失711个碱基。结论： 成功构建鼠伤寒沙门菌spvC基因缺陷变异株,为进一步研究其在鼠伤寒沙门菌中的功能奠定了基础。