人体脂肪基质细胞分离培养及其成骨潜能

目的 :分离人体脂肪基质细胞并诱导培养其成骨表型。方法 :将脂肪抽吸术获取的人体脂肪进行机械分割 ,通过Ⅰ型胶原酶消化后得到脂肪基质细胞 ,在BGJb 培养基中原代培养 10d ,消化传代后用含体积分数 10 ?S及 10 - 8mol/L地塞米松 ,50mg/L左旋抗坏血酸 ,10nmol/L维生素D3 ,10mmol/Lβ 磷酸甘油钠的DMEM /F12培养基中诱导培养 14d ,观察细胞形态 ,绘制细胞生长曲线并对其成骨表型进行鉴定。结果 :脂肪基质细胞呈成纤维细胞样贴壁生长 ,其中的成体干细胞经诱导培养后体积明显增大 ,胞核大面圆 ,胞浆丰富 ,群体倍增时间为 66h。Gomori萘酚磷酸酯法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒 ,vonKossa染色表明聚集的细胞团能形成矿化结节。结论 :脂肪基质细胞中的成体干细胞经过矿化诱导培养后可向成骨细胞分化 ,并具有明显的成骨表型     

人牙囊细胞的体外分离、培养及表型鉴定

目的 :建立人牙囊细胞 (dentalfolliclecells ,DFCs)的体外培养方法 ,为牙周组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。方法 :分离人 8月龄胚胎下颌磨牙牙胚 ,胰酶消化后分离牙囊组织 ,采用胶原酶消化法和组织块法相结合原代培养人牙囊细胞 ,利用牙囊细胞和上皮根鞘细胞对胰酶的耐受性差别分离纯化 ,通过倒置显微镜及HE染色观察细胞形态及生长状况、透射电镜观察细胞的超微结构 ;采用免疫组化波形丝蛋白 (vimemtin ,Vim)、角蛋白(cytokeration ,CK)、Ⅰ型胶原 (typeⅠcollagen ,ColⅠ )、Ⅲ型胶原 (typeⅢcollagen ,ColⅢ )、纤维连接蛋白 (fibronectin ,FN)和早期矿化相关的标志骨桥蛋白 (osteopontin ,OPN)、骨涎蛋白 (bonesialapretion ,BSP)的表达情况对细胞做表型鉴定。结果 :原代培养的人牙囊细胞生长良好 ,但其中混有少量上皮根鞘细胞 ,经传代可完全分离 ,传至 11代仍保持原有活力 ;牙囊细胞为长梭型 ,成纤维样 ;电镜下见细胞核浆比例大 ,核仁明显 ,含有溶酶体、大量的粗面内质网和发达的高尔基体 ,含有大量的中间丝。电镜结果显示细胞代谢旺盛 ,增殖活性高 ,含有牙囊细胞特有的高密度电子颗粒 ,免疫组化Vim、ColⅠ、ColⅢ、FN、OPN、BSP呈阳性着色 ,抗角蛋白呈阴性着色。结论 :本实验培养的是牙囊细     

矿化液对人脂肪基质细胞(hADSCs)成骨分化的影响

目的:比较人脂肪基质细胞(human adipose-derived mesenehymal stem cells,hADSCs)在矿化条件与非矿化条件下分别培养,评价矿化液对其增殖和分化的影响。方法:酶消法原代培养人脂肪基质细胞,再以含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的矿化液进行诱导,MTT检测矿化液对细胞增殖的影响,细胞培养上清液检测碱性磷酸酶(ALP)活性及骨钙素(OCN)含量。结果:矿化液抑制细胞的增殖,提高人脂肪基质细胞ALP活性和骨钙素的含量。结论:人脂肪基质细胞在矿化条件下可以表现出成骨细胞特性。     

犬外周血基质细胞的分离培养及其横向分化潜能研究

目的：对犬外周血基质细胞（peripheral blood stromal cells,PBSCs）进行体外分离培养,研究其向成骨、成脂方向诱导分化的潜能。方法：取犬外周血,利用密度梯度离心法分离培养犬外周血基质细胞,免疫组化方法检测CD34和CD105表达情况;并用特定诱导液将分离的细胞向成骨细胞和脂肪细胞定向诱导分化。结果：该细胞表达CD105,不表达CD34;成骨诱导后,矿化结节茜素红染色阳性、OPN表达阳性;成脂诱导后,经油红O染色可见细胞内脂滴的积累。结论：利用密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法可分离培养出外周血基质细胞,外周血基质细胞经诱导培养后具有多向分化潜能,有可能成为组织工程的种子细胞。     

人体脂肪基质细胞成肌潜能研究

目的　研究分离的人体脂肪基质细胞经过诱导培养后向骨骼肌细胞分化的潜能。方法　通过脂肪抽吸 术获取健康成人脂肪,机械分割后用Ⅰ型胶原酶消化,得到脂肪基质细胞。将脂肪基质细胞在BGJb培养基中原代 培养10 d,在DMEM/F12培养基中进行成肌诱导培养20 d,获得细胞爬片。细胞爬片经4%多聚甲醛固定后,用甲 苯胺蓝、Mallory磷钨酸苏木素染色观察细胞形态;Myosin单克隆抗体免疫细胞化学染色观察肌球蛋白表达情况。 结果　经过成肌诱导培养的细胞与常规培养的脂肪基质细胞在形态上有明显的差异,表现为细胞体积增大,单个 核的细胞融合形成多核的肌管样结构,胞浆内细胞器发达,肌浆网扩张并形成肌原纤维骨骼肌特异性的Myosin表 达阳性。未经诱导的脂肪基质细胞在相同时间点无此现象。结论　人类脂肪基质细胞中存在着成体干细胞,在成 肌诱导培养条件下具有向骨骼肌细胞分化的潜能。     

人胎儿骨髓基质干细胞的分离、体外培养和鉴定

目的 分离培养并鉴定人胚胎骨髓基质干细胞。方法 抽取流产胎儿股骨骨髓，Percoll离心纯化分离，取界面有核细胞培养。不同培养基培养对比，观察细胞生长曲线，免疫细胞化学鉴定细胞膜表面分子。结果 得到纯化率较高的骨髓基质干细胞(MSCs)，用αMED比DMEM和RPM11640原代培养生长速度快，第二代MSCs在上述三种培养基中倍增时间分别为43h、54h、56h。免疫细胞化学结果99％CD4( )、98％Vim( )、所有细胞CD34(-)、CD29(-)。结论 Percoll离心法成功地分离纯度较高的MSCs。MSCs在αMEM中培养增殖率比在DMEM和M1640中培养为快。     

人牙周膜细胞不同分离培养方法的比较研究

目的探讨组织块法、酶解组织块法和酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞的优缺点。方法分别应用组织块法、酶解组织块法及酶消化法进行人牙周膜细胞分离培养,鉴定细胞来源,利用倒置显微镜观察细胞生长状况。结果应用组织块法从24块人牙周膜组织中成功分离培养出人牙周膜细胞,成功率96%（24/25）,细胞生长状态良好;应用酶解组织块法成功率80%（16/20）;应用酶消化法成功率75%（12/16）。结论组织块法原代培养人牙周膜细胞方法简单且成功率较高。     

人牙囊细胞的分离培养和生物学特性

目的：应用酶消化法体外培养人牙囊细胞并研究其生物学特性。方法：分离合法引产人胚胎乳牙胚的牙囊组织，消化法获得人牙囊细胞，HE染色观察细胞形态、免疫组织化学染色技术检测波形丝蛋白、Ⅰ型胶原表达，RT—PCR检测细胞的骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶的表达。结果：原代培养的人牙囊细胞呈成纤维细胞形态，有部分一上皮成分混杂，经纯化后可排除；在牙囊细胞中Ⅰ型胶原和波形丝蛋白的表达呈阳性，定位于细胞的胞质中；RT—PCR结果显示骨涎蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶表达。结论：体外培养的人牙囊细胞具有成纤维细胞的特性，具有合成Ⅰ型胶原的能力；不同程度表达Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、碱性磷酸酶等矿化相关蛋白。     

脂肪基质细胞骨向诱导分化的研究进展

脂肪基质细胞(ADSCs)是目前骨组织工程的理想种子细胞,诱导其定向成骨分化是该领域的研究热点。脂肪基质细胞定向成骨诱导的方法主要有改变ADSCs所处的微环境、修饰ADSCs内部基因等。本文对脂肪基质细胞骨向诱导分化的研究进展进行综述。     

釉基质蛋白对猪骨髓基质细胞黏附、伸展及增殖的影响

目的：研究釉基质蛋白（enamel matrix proteins,EMPs）对体外培养的猪骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）黏附、伸展和增殖活性的影响。方法：抽取猪髂骨骨髓．全血培养法获得骨髓基质细胞。培养液中EMPs的浓度分别为25、50、100、200μg／ml,以不加EMPs为对照。用比色法检测不同浓度EMPs对BMSCs黏附的影响。通过计数预定视野中伸展的细胞数,计算BMSCs在培养1h、3．5h、6、5h后的伸展率。MTT法测定各组细胞的增殖活性。对实验数据行单因素方差分析和SNK法组间比较。结果：猪BMSCs在含有EMPs的培养液中生长良好。对照组以及不同浓度EMPs实验组对细胞黏附的影响无统计学差异。在1h、3．5h、6．5h．各组细胞的伸展率无显著不同。EMPs对BMSCs的促增殖作用呈浓度和时间依赖性．200μg／ml浓度的EMPs从实验的第3天开始．显著促进猪BMSCs的增殖。结论：EMPs对体外培养的猪BMSCs的黏附和伸展无显著影响．200μg／ml浓度的EMPs可显著促进猪BMSCs增殖,为联合应用EMPs和BMSCs修复牙周组织缺损提供了理论依据。     

脂肪间质干细胞在软骨组织工程中的研究现状

脂肪间质干细胞是新发现的一种可以自我更新,具有向软骨、骨、脂肪、肌肉、神经细胞等分化的成体干细胞。目前已经对它进行了深入的研究。在对其生物学特性研究的基础上,进一步研究了它的应用,认为它可以成为组织工程的种子细胞。构建的组织工程组织中比较成熟的是软骨,有望应用于临床。下面就脂肪间质干细胞生物学特性和成软骨的研究进展进行综述。     

富血小板血浆的三次离心法制备及其对脂肪干细胞增殖、成骨矿化的影响

目的 探索高效制备富血小板血浆(PRP)的方法,并观察不同体积分数的PRP对Beagle犬脂肪干细胞(ADSC)体外增殖及其向成骨细胞分化的影响.方法 抽取3只Beagle犬静脉血各40 mL,分别用传统的二次离心法和改良的三次离心法制备PRP,进行血小板计数分析.分别将体积分数为5%、100k、15%、20%的PRP...     

SD大鼠脂肪组织来源干细胞体外生物学特性研究

目的：体外培养并鉴定脂肪组织来源干细胞,为相关实验研究奠定基础。方法：分离SD大鼠腹股沟脂肪组织,经过胶原酶消化,加入脂肪组织来源干细胞条件培养基中培养,用流式细胞仪检测分离的脂肪组织来源干细胞并通过诱导检测分离细胞的多向分化潜能。结果：分离培养的细胞具有不断增殖能力,有多向分化能力,存在脂肪组织来源干细胞的相关标志分子。结论：成功建立了脂肪组织来源干细胞的分离培养方法,可用于进一步的实验研究。     

富血小板纤维蛋白与富血小板血浆体外释放生长因子的比较及其对脂肪干细胞增殖分化的影响

目的比较富血小板纤维蛋白（PRF）与富血小板血浆（PRP）体外释放生长因子的质量浓度及其对脂肪干细胞（ADSCs）增殖和成骨分化的影响。方法抽取兔耳中央动脉血,一次离心法制备PRF,二次离心法制备PRP,分别将其置于5 mL新鲜的α-MEM培养液中,分别于37 ℃下静置1、7、14、21、28 d,收集PRF与PRP析出液,检测析出液中转化生长因子-β1（TGF-β1）及血小板源性生长因子-AB（PDGF-AB）的质量浓度。将收集的PRF与PRP析出液配置成条件培养液培养ADSCs,观察其对ADSCs增殖及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。结果1）生长因子释放情况：不同时间点的PRF析出液中,14 d时TGF-β1的质量浓度达到最高,7 d时PDGF-AB的质量浓度最高;不同时间点的PRP析出液中,1 d时TGF-β1与PDGF-AB的质量浓度即达最高,以后逐渐下降。2）对ADSCs增殖及ALP活性的影响：PRF析出液中,14 d时对其影响最大;PRP析出液中,1 d时对其影响最大。结论与PRP相比,PRF能够缓慢持久地释放生长因子,更有力地刺激ADSCs的增殖和分化。     

大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的：研究脂肪组织来源干细胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）在体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的能力，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法：从SD大鼠腹股沟脂肪垫分离出脂肪组织，通过Ⅰ型胶原酶消化法获取原代ADSCs，适时传代。逐日倒置显微镜下观察细胞形态及增殖特征。第3代细胞用成骨诱导培养基向成骨细胞诱导分化，并进行碱性磷酸酶染色、VonKossa染色及免疫细胞化学染色鉴定成骨细胞特性。结果：从大鼠脂肪组织中分离培养出ADSCs，体外形态类似成纤维细胞，增殖迅速。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠及1，25-（OH）2 VitD，诱导下，ADSCs表现出成骨细胞特性：ALP活性显著增高，Von Kossa染色出现钙化结节，OC、Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性。结论：ADSCs易于分离培养，体外扩增迅速，经矿化诱导后可分化为成骨细胞，可作为骨组织工程的种子细胞。     

大鼠脂肪源性内皮细胞成脂潜能的研究

目的:研究脂肪源性内皮细胞向脂肪细胞的分化潜力和过程。方法:获取4只雄性SD大鼠鼠蹊部皮下脂肪,通过机械分割和组织消化法获取脂肪基质细胞,在内皮细胞培养液中培养7d后,经免疫细胞化学及透射电镜鉴定证实95%以上细胞已具内皮细胞表型特征,再将这些细胞进行成脂(DMEM/F-12培养基内加入0.5mmol/L1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤,1μmol/L地塞米松,10μmol/L胰岛素,200μmol/L吲哚美星)定向诱导7d,形态学观察和油红O特殊染色鉴定诱导后的细胞。结果:SD大鼠脂肪源性内皮细胞呈典型的铺路石样单层融合贴壁生长;Ⅷ因子、W-P小体阳性;在此基础上经成脂诱导,发现约85%内皮细胞转化为脂肪细胞,油红O染色可见细胞质中有大量脂滴形成。结论:从SD大鼠皮下脂肪获取的脂肪源性内皮细胞经过成脂诱导后可转化为脂肪细胞,这对研究脂肪细胞的来源和形成以及脂肪组织工程研究具有重要的意义。     

来源于脂肪组织的基质细胞向成骨细胞分化

目的：研究来源于脂肪组织的基质细胞体外培养和向成骨细胞分化条件。方法：常规方法培养脂肪组织来源的基质细胞．向成骨细胞分化诱导．应用免疫细胞化学办法对细胞进行鉴定．碱性磷酸酶法对分化的成骨细胞鉴定。结果：从成年人的脂肪组织中分离出基质细胞．在体外生长形态类似成纤维细胞。可以维持在未分化状态稳定增殖，体外可持续扩增和传代。在一定的条件下可诱导分化为成骨细胞．分化的细胞表达碱性磷酸酶和I型胶原．在培养皿中也发现钙化斑。结论：脂肪组织中存在的基质细胞能分化为成骨细胞．这种细胞可以做为组织工程的种子细胞。     

Bone engineering with adipose tisssue derived stromal cells

INTRODUCTION: Tissue engineering offers the means for replacing or repairing diseased or damaged organs within the patient's body. This current study deals with the general differentiation potential of human adipose tissue derived stromal cells (ATSCs) into mesenchymal tissues and particularly into bone. MATERIAL AND METHODS: ATSCs were isolated and cultivated until the 3rd passage. Three different ways of mesenchymal differentiation (adipogenic, osteogenic, myogenic) were induced and analysed histologically (v. Kossa, Sudan III) and immunhistologically (alpha-actin, osteocalcin). Nine different cell cultures were analysed in terms of calcium deposition (donor's age dependend) in the cell matrix and release of alkaline phosphatase (AP) during the differentiation period. Three-dimensional osteogenic constructs, based on collagenous micro-particles were performed and analysed histologically. RESULTS: Effective differentiation of ATSCs into osteogenic, adipogenic and myogenic cells could be demonstrated in histological and immunohistological analyses. There was an increase of calcium deposition in the cell matrix of osteogenically differentiated ATSCs that did not show any correlation with the age of the donor. Two out of three three-dimensional constructs showed clear zones of mineralization (v. Kossa) in the area of osteocalcin-producing cells. CONCLUSION: Adipose tissue derived stromal cells are a promising source for tissue engineering with a clear potential to differentiate into adipogenic, osteogenic and myogenic cells. The osteogenic differentiation potential did not show any correlation to the age of the donors (calcium deposition, AP-activity). Three-dimensional osteogenic constructs could be established.