利用Adeasy-1系统构建npcl基因非复制型腺病毒载体并鉴定

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,细菌内同源重组法构建有npcl基因的腺病毒载体.方法利用限制性内切酶kpnl HindⅢ从带有朊病毒启动子的质粒prp-pro-mlpcl中切下目的基因npcl-1,克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV,再与PAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,经抗性筛选和酶切鉴定的质粒再利用脂质体转染人293例细胞中扩增,利用Adeasy-1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒,RT-PCR鉴定目的基因的表达.结果切酶切鉴定,正确的目的基因片断已克隆至穿梭质粒PAdtrack-CMV;卡那霉素进行抗性筛选及Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d后见明显的绿色荧光蛋白表达.回收病毒,可重复感染293细胞,证实有感染能力的病毒颗粒包装成功.结论利用腺病毒载体系统Adeasy-1可构建能成功表达Pac Ⅰ基因的腺病毒载体,为对Niemann pick' s病C型的进一步研究提供了条件.     

新型Smad7 重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7).方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy 1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7.RT PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况.结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT PCR检测证实Smad7表达增强.结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础.     

新型Smad7 重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7)。方法采用常规分子生物学方法，抽提SD大鼠肝脏总RNA，RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA片段，插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游，构建重组穿梭载体pAdTrackCMV-Smad7，线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy-l在细菌BJ5l83内同源重组，鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7。RT-PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况，结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定，与预期结果一致；重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3d可观察GFP明显表达；RT-PCR检测证实Smad7表达增强。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7，为进一步研究TGFl3信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础。     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

一种有效的体外连接法构建heNOS重组腺病毒

目的：探讨一种新的有效的体外连接方法构建重组腺病毒转移载体。方法：将目的基因heNOS(人内皮型一氧化合酶)亚克隆到穿梭质粒pShuttle启动子CMV的下游，再通过Ⅰ-CeuⅠ和PI—Sce Ⅰ两个稀有酶切位点，将目的基因heNOS与腺病毒质粒DNA(pAdeno—X)进行体外连接，获得含目的基因heNOS重组腺病毒质粒DNA，后经限制性内切酶PacⅠ切割后，两端露出反向末端重复序列(ITR)，利用脂质体转染293细胞．获得含目的基因重组腺病毒上清。PCR双引物检测含有目的基因heNOS片段。结果：PCR双引物检测含有目的基因heNOS片段，表明利用体外连接法成功构建了含目的基因heNOS重组腺病毒转移载体。结论：体外连接法是一种有效的复制缺陷型重组腺病毒构建方法。     

受人E2F1启动子调控的条件复制型腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定受人E2F1基因启动子调控的条件复制型腺病毒载体。方法以人胚肾293细胞的基因组DNA为模板,PCR扩增E2F1基因启动子调控序列,构建表达质粒pE2F1 p-EGFP;PCR扩增腺病毒早期基因E1A,构建表达质粒pTERT p-E1A;将重组质粒pTERT p-E1A酶切得到的E1A基因,插入线性化的pE2F1 p-EGFP,构建pE2F1 p-E1A;酶切重组质粒pE2F1 p-E1A产生受E2F1基因启动子调控E1A的完整表达框,插入质粒pDC311中,构建腺病毒包装穿梭质粒pDC311-E2F1 p-E1A,与腺病毒骨架质粒pBHGlox△1,3Cre共转染人胚肾293细胞,得到条件复制型腺病毒Ad-E2F1 p-E1A;扩增病毒并分别感染E2F1活性增强的系列肿瘤细胞株,利用病毒空斑形成实验检测重组条件复制型病毒的条件复制能力。结果限制性内切酶鉴定显示重组质粒构建成功,受人E2F1基因启动子调控的溶瘤腺病毒载体仅在E2F1活性增强的肿瘤细胞株中实现条件性复制。结论构建的新型条件复制型腺病毒载体具有良好的选择性复制能力,在E2F1活性增强的肿瘤治疗方面有良好的应用前景。     

携带乙肝核心抗原基因复制缺陷型重组腺病毒的高效制备和表达

目的构建表达乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的复制缺陷型重组腺病毒载体。方法扩增乙肝病毒(HBV)C基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBVC区基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹PacⅠ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装。体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达。结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBc。重组质粒pAd-HBc导入293细胞,经过包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBc,其病毒滴度达5×109pfu/mL,并能在真核细胞中有效表达目的基因。结论成功构建表达HBcAg复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础。     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

重组腺病毒pAdxsi-eGFP-rNIS的构建及初步应用

目的 构建包含rNIS和eGFP基因的重组腺病毒栽体及初步应用.方法 以CMV为启动子,将pShuttle-eGFP-CMV重组穿梭载体和含有目的 基因rNIS的原始质粒酶切后,电泳、切胶回收,分别得到载体片段和插入片段.连接酶连接两种片段后,转化化学感受态DH5a菌株,涂布到抗性固体培养基中;挑取单克隆菌落,接种到抗性液体培养基培养;提取pShuttle-eGFP-CMV-rNIS重组穿梭质粒,酶切鉴定.用类似的方法将pShuttle-eGFP-CMV-rNIS重组穿梭质粒转移到pAdxsi重组腺病毒骨架栽体上.在细菌内扩增培养后,提取pAdxsi-eGFP-rNIS病毒质粒,酶切鉴定.将最终的重组腺病毒Ad-eGFP-rNIS转染到A549细胞,荧光显微镜下观察、拍照;细胞与125I溶液培养后,γ计数器检测细胞放射性计数.结果 rNIS构建到pShut-tle-eGFP-cMV(-)TEMP重组穿梭质粒中,并成功转移到pAdxsi重组腺病毒骨架载体上,经酶切鉴定,rNIS和eGFP均表达正确.荧光显微镜下,转染Ad-eGFP-rNIs的A549细胞可见大量强烈绿色荧光,未转染细胞未见明显绿色荧光.转染细胞摄取放射性计数为(29 250±1 441)cpm,未转染细胞摄取放射性计数为(490±27)cpm,两者之间的差异有统计学意义,t=15.2,P<0.001.结论 成功构建了含rNIS基因的重组腺病毒载体,转染肿瘤细胞后rNIS功能正常,为下一步rNIS介导的肿瘤基因靶向治疗及分子显像奠定了基础.     

大鼠骨形成蛋白4基因重组腺病毒的构建

目的 利用Cre-loxP特异性位点基因重组技术构建大鼠骨形成蛋白BMP4的重组腺病毒.方法 高保真PCR得到大鼠BMP4 cDNA,克隆到质粒pCR-Blunt Ⅱ-TOPO中,然后将目的基因片段连接到中间载体质粒pDNR-CMV,测序后在Cre重组酶作用下,将BMP4 cDNA转移到腺病毒载体pLP-Ade-no-X-CMV.在HEK 293细胞中扩增重组腺病毒,并检测BMP4基因重组腺病毒在细胞中的表达和功能.结果 PCR法和限制性内切酶Xhol I消化法均证实BMP4重组腺病毒的成功构建,RT-PCR和Western Blot检测证实该重组腺病毒显著性增强了CFSC-2G细胞中BMP4的mRNA和蛋白表达水平.结论 Cre-loxP特异性位点基因重组技术是一种快速、高效构建基因重组腺病毒的方法,大鼠BMP4基因重组腺病毒的成功构建为进一步研究BMP4的细胞调控功能和BMP4基因治疗提供了良好的工具.     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的 为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1) cDNA重组腺病毒载体.方法 以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIM P1的正确性.通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度.结果 经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010 IU/mL.结论 成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础.     

Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建

［摘要］目的: 应用基因同源重组技术,构建及鉴定携带小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)的复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步研究betatrophin的功能奠定基础。方法: 根据基因库中登录的小鼠betatrophin基因Gm6484(NM_001080940)序列,经化学合成得到含BamHⅠ/ AgeⅠ酶切位点的小鼠betatrophin基因全长cDNA质粒,将其酶切后插入到带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的GV314载体CMV MCS 3FLAG SV40 EGFP中,得到重组病毒穿梭质粒pGV314 betatrophin;经BamHⅠ/ AgeⅠ双酶切后,与线性化的pDC315病毒基因组质粒体外同源重组,构建含有目的基因的腺病毒载体Ad betatrophin,酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293T细胞包装成重组病毒颗粒,经在HEK293T细胞反复扩增数代后,利用聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹法及测序鉴定重组的腺病毒。结果： 阳性克隆质粒Ad betatrophin在HEK293T细胞中成功包装出重组病毒,经PCR、蛋白质印迹及测序检测表明重组腺病毒包装成功。结论： 成功构建了携带小鼠betatrophin基因的复制缺陷型重组腺病毒过表达载体。     

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的：制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法：酶切pMD18T-NP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至芽梭载体构建重组pAcTrack-CMV-NP9载体，线性化后与pAdEasy-1共转化BJ5183，通过同源重组得到重组的pAD-NP9病毒载体将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果：酶切鉴定得到阳性pAD-NP9重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(CFP)表达并逐渐增多、增强：结论：成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒，为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。     

IP-10重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的利用细菌内同源重组法构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的!-干扰素诱导蛋白10(IP-10)重组腺病毒载体并制备重组腺病毒。方法将IP-10编码序列克隆入带有EGFP示踪的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移载体pAdTrack-CMV/IP-10,将其在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd/IP-10;酶切鉴定正确后转染HEK293细胞。收集病毒上清,PCR鉴定正确后,扩增并再次感染HEK293细胞检测病毒感染能力。结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在HEK293细胞中包装成有感染活性的病毒颗粒。结论成功地构建了表达IP-10蛋白的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒Ad/IP-10,为研究IP-10的蛋白功能提供了一个重要工具。     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

携带凋亡抑制蛋白Livinα基因的重组腺病毒载体的构建

目的构建携带凋亡抑制蛋白Livinα和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒pAd-Livinα。方法 PCR扩增Livinα基因片段,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在人胚肾293细胞中包装扩增得到携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒pAd-GFP-Livinα。采用PCR对重组腺病毒进行鉴定。结果经酶切及PCR鉴定证实携带Livinα的重组腺病毒载体构建成功,并可在人胚肾293细胞中表达,病毒滴度2.15×1010 pfu/mL。结论成功构建了携带Livinα和GFP基因的重组腺病毒载体系统,为进一步研究Livinα的生物学特性奠定了基础。     

利用Gateway克隆技术构建人Hiwi腺病毒载体

目的：获得人的全长Hiwi编码区基因,构建携带绿色荧光蛋白（GFP）的人Hiwi腺病毒载体,为进一步研究Hiwi诱导白血病干细胞分化和凋亡的作用和机制奠定基础。方法：运用重叠延伸PCR方法扩增Hiwi编码区基因全长;利用Gateway克隆技术将Hiwi编码区基因全长插入带有GFP的载体Flag-IRES -hrGFP中构建成为pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP,再将克隆载体pDown-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP与表达载体pAV.Des1d进行同源重组反应,得到重组腺病毒载体pAV.Ex1d-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP。经PCR筛选阳性克隆提取重组腺病毒质粒,包装成重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒。结果：人Hiwi全长编码区基因克隆成功,经酶切及基因测序鉴定证实重组Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒构建成功。采用Lipofectamine法将Ad-Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP转染入HEK293A细胞中,在荧光显微镜下,可以观察到转染细胞中的绿色荧光。结论：成功构建重组Ad- Hiwi-3×flag-IRES-hrGFP腺病毒质粒,其可在HEK293A细胞内表达。     

密码子优化的HIV-1型gp120基因重组腺病毒载体疫苗的构建与鉴定

目的 构建密码子优化型gp120基因重组腺病毒载体（rAden-mgp120）,为研发新型HIV预防性疫苗奠定基础.方法 首先利用PCR的方法扩增mgp120基因,将目的基因克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得重组穿梭载体克隆pENTR/D-TOPO-mgp120.经过穿梭载体克隆与表达载体（pAd-CMV/VS-DEST）间的重组反应获得表达克隆质粒pAden-mgp120,表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到复制缺陷型重组腺病毒rAden-mgp120.结果 经PCR和测序鉴定,重组载体rAden-mgp120构建正确,转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为6.8x1011pfu/ml,该重组腺病毒载体能正确表达mgp120蛋白.结论 成功构建了重组腺病毒rAden-mgp120为HIV-1预防奠定了基础.