EB病毒早期基因BHRF1转基因小鼠纯合子建立及建系

目的构建整合有EB病毒(EBV)早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因纯合子转基因小鼠。方法通过显微注射技术构建BHRF1阳性首建鼠F0共16只,将转基因小鼠与正常小鼠交配,得到子代F1小鼠,PCR技术检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性鼠。阳性鼠再与同系阴性鼠杂交得到F2小鼠,筛选出F2小鼠中的阳性鼠近交得F3小鼠。筛选出F3小鼠中的纯阳性鼠进行近交,得到纯阳性F4小鼠。F4小鼠再近交得到纯阳性F5小鼠。结果经PCR及测序证实,F4、F5小鼠均为BHRF1阳性鼠,测序结果经blast比对,与BHRF1基因完全相同。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,并成功筛选出纯阳性BHRF1转基因小鼠,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。     

EB病毒早期基因BHRF1转基因模型鼠的建立

目的构建稳定表达EB病毒早期基因BHRF1蛋白的重组载体,通过显微注射法建立BHRF1转基因鼠模型。方法自EBV阳性细胞系B95-8提取总RNA,应用RT-PCR扩增BHRF1基因,然后与pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1-BHRF1重组载体。重组载体用NruⅠ和DraⅢ双酶切,电泳后纯化回收长约2000 bp的目的片段溶于显微注射缓冲液。从超排小鼠取健康受精卵,通过显微注射技术,将纯化的CMV+BHRF1+polyA DNA片段注射入小鼠受精卵,短暂培养后选择健康受精卵移入假孕母鼠输卵管内。采用PCR检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性首建鼠。结果经PCR、限制性内切酶鉴定及测序证实pcDNA3.1-BHRF1重组载体构建成功,DraⅢ和NruⅠ双酶切获得长约2 000 bp的CMV+BHRF1+polyA DNA片段。自18只见栓超排小鼠获取健康受精卵480枚,分别注入纯化的目的片段,经短暂培养后390枚受精卵仍健康,移入14只假孕母鼠输卵管内,11只受孕,产下74只子鼠。PCR检测子鼠鼠尾DNA获得16只阳性首建鼠,阳性率为21.6%(16/74)。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。     

BHRF1反义寡核苷酸对BHRF1-CNE2细胞生存能力的影响

探讨ＢＨＲＦ１反义寡核苷酸对表达ＢＨＲＦ１的鼻咽癌细胞株ＣＮＦＥ２生存能力的影响。方法检测反义阻断ＢＨＲＦ１表达后ＢＨＲＦ１－ＣＮＥ２细胞在喜树碱作用下增殖能力和凋亡指数的变化。结果在喜树碱作用下，应用ＢＨＲＦ１反义寡核苷酸组的癌细胞较对照组的增殖率下降，凋亡率增高，结论反义阻断ＢＨＲＦ１的表达可降低ＣＮＥ２细胞的生存能力，这种在鼻咽癌的治疗中可能具有一定的价值。     

苦参素诱导胃癌SGC—7901细胞凋亡的初步研究

目的　探讨苦参素对胃癌细胞株SGC - 790 1的抑制增殖效应及凋亡诱导作用。方法　用苦参素处理SGC - 790 1细胞 ,采用MTT法检测药物对细胞的抑制作用 ,倒置显微镜观察细胞形态学改变。结果　在苦参素作用下 ,SGC - 790 1细胞呈凋亡改变。细胞凋亡的同时 ,细胞周期发生特定的改变。结论　苦参素能抑癌细胞增殖 ,能诱导胃癌细胞凋亡     

鼻咽癌细胞EB病毒编码BHRF1基因的研究

利用斑点杂交技术检测正常鼻咽青草 咽未分化癌、低分化及高分化鳞癌中ＥＢ病毒编码ＢＨＲＦ１基因的存在情况。结果表明，鼻咽未分化癌及低分化鳞癌中的ＢＨＲＦ１阳性率分别为９０％和８５．７％，而高分化鼻咽癌组织的阳性率为２５％。提示ＢＨＲＦ１基因可能与因癌细胞的分化有关。     

姜黄素诱导人胃癌SGC7901细胞自噬性凋亡的研究

目的 观察姜黄素体外诱导人胃癌SGC7901细胞自噬性凋亡的作用,并探讨其可能的作用机制.方法 用不同浓度的姜黄素处理SGC7901细胞,MTT法检测细胞增殖;单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin,MDC)荧光染色和Hoechst33342荧光染色观察细胞自噬和凋亡的发生;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测细胞凋亡相关蛋白NF-κB、自噬相关蛋白Beclin1及LC3Ⅱ的表达.结果 姜黄素可呈剂量依赖性明显抑制SGC7901的生长.MDC染色显示,40μmol/L姜黄素在作用12h后即可诱导SGC7901细胞发生自噬,24 h自噬减少;Hoechst33342荧光染色显示,40μmol/L姜黄素诱导凋亡在24 h最明显;流式细胞术显示,40μmol/L姜黄素作用24h时SGC7901细胞凋亡率明显增加.Western blot检测显示,姜黄素诱导SGC7901细胞自噬性凋亡过程中,凋亡相关蛋白NF-κB、自噬相关蛋白Beclin1及LC3的表达均上调.结论 姜黄素通过诱导自噬性凋亡抑制人胃癌细胞SGC7901的生长,其机制与NF-κB、Beclin1及LC3蛋白的表达上调有关.     

丝裂霉素诱导人膀胱癌细胞凋亡的研究

为进一步探讨丝裂霉素膀胱内灌注治疗膀胱肿瘤的机制，研究了丝裂霉素诱导人膀胱癌 Ｂ Ｉ Ｕ８７ 细胞凋亡的规律。形态学观察具有典型凋亡征象，胞浆浓缩，染色质凝集，核固缩、裂解及凋亡小体。凋亡指数与诱导时间呈正相关（ Ｐ＜ ０．０１）；流式细胞仪 Ｄ Ｎ Ａ 直方图上出现特征性的亚二倍体（亚 Ｇ１ ）峰；凋亡过程中伴 Ｂｃｌ２ 基因的下调，且与诱导时间呈负相关 （ Ｐ＜ ００１）。提示丝裂霉素诱导癌细胞凋亡是腔内化疗的重要机制，降低 Ｂｃｌ２ 的表达可提高膀胱癌腔内化疗的疗效。     

沙培林诱导SGC7901胃癌细胞凋亡及机制的研究

目的:观察沙培林在体外诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡的作用,并探讨其分子机制. 方法:分别以不同浓度(0、0.001、0.01、0.1和0.5 KE/ml)的沙培林干预SGC7901细胞6、12、24和48h后,用噻唑蓝(MTT)比色法检测SGC7901细胞的生长情况;用膜连蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)加碘化丙啶(PI)双染法观察沙培林作用后SGC7901细胞的凋亡情况;用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测沙培林干预后细胞survivin、caspase-3 的mRNA表达变化情况. 结果:沙培林处理后,胃癌SGC7901细胞生长受到抑制,抑制率在一定范围内呈剂量、时间相关性.沙培林作用48h后,流式细胞仪检测SGC7901细胞凋亡显示:随着沙培林浓度的提高,细胞的凋亡率也增加.半定量RT-PCR检测发现:沙培林可以使SGC7901细胞survivin mRNA表达减少,caspase-3 mRNA表达上升(P<0.05). 结论:沙培林在体外可抑制SGC7901细胞增殖,并诱导其发生凋亡,提示该药有治疗胃癌的潜在价值.沙培林诱导SGC7901细胞发生凋亡的生物学效应可能与survivin mRNA表达下调,caspase-3 mRNA表达上升有关.     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌SGC7901细胞株凋亡的实验研究

目的 观察Survivin反义寡核苷酸（ASODN）对胃癌细胞株（SGC7901）增殖、凋亡的作用。方法 人工合成Survivin硫代ASODN，通过脂质体转染胃癌细胞株（SGC7901）后，用MTT法检测细胞毒作用；用荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡；用RT-PCR、免疫组化技术检测SurvivinmRNA及蛋白的表达。结果 （1）Survivin ASODN抑制胃癌SGC7901细胞增殖呈时间和剂量依赖性；（2）Survivin ASODN处理组SGC7901细胞24h后凋亡率为33．6％，正义寡核苷酸（SODN）组为10．7％，2组相比，有显著性差异（P〈0．05）；（3）SurvivinASODN处理组SGC7901细胞Survivin蛋白及mRNA的表达水平显著下降。结论 Survivin ASODN能够抑制增殖、诱导凋亡，推测可能通过下调Survivin mRNA及蛋白表达而起作用。     

丝裂霉素诱导人膀胱癌细胞凋亡的研究

为进一步探讨丝裂霉素膀胱内灌注治疗膀胱肿瘤的机制，研究丝裂霉素诱导人膀胱癌ＢＩＵ－８７细胞凋亡的规律，形态学观察具有典型凋亡征象，胞浆浓缩，染色质凝集，核固缩，裂解及凋亡小体。凋亡指数与诱导时间呈正相关（Ｐ〈０．０１）；流失细胞仪ＤＮＡ直方图上出现特征性的亚二倍体（亚Ｇ１）峰，凋亡过程中伴Ｂｃｌ－２基因的下调，且与诱导时间呈负相关（Ｐ〈０．０１），提示丝裂霉素诱导癌细胞凋亡是腔内化疗的重要机制，降     

EB病毒相关胃癌组织中P53及P21蛋白的表达

目的探讨Epstein-Barr病毒(EBV)感染、P53和P21蛋白表达异常在胃癌发生发展中的作用以及三者相关性。方法应用免疫组化技术检测13例EBV相关胃癌(EBVaGCs)、45例临床指标与之匹配的EBV阴性胃癌(EBVnGCs)以及58例相应癌旁组织中P53和P21蛋白的表达。结果胃癌组织P53蛋白阳性率明显高于癌旁组织,差异有极显著性(χ2=50.000,P<0.01)。EBVnGCs组织中P53蛋白阳性率与EBVaGCs相比差异无显著性(χ2=0.072,P>0.05);但EBVaGCs组织P53蛋白过表达率明显低于EBVnGCs组织,差异有极显著性(χ2=7.259,P<0.01)。胃癌组织P21蛋白阳性率明显低于癌旁组织,差异有极显著性(2χ=12.500,P<0.01)。EBVnGCs与EBVaGCs组织P21蛋白阳性率无明显差异(P>0.05)。胃癌组织中P21与P53蛋白共同表达率较高,但无显著相关性(2χ=1.323,P>0.05,r=0.202 5)。结论P21蛋白表达存在p53依赖性和p53非依赖性两条途径;胃癌组织中EBV感染与P53蛋白的异常表达有关,而与P21蛋白异常表达无显著相关性。     

体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响。方法应用实时定量PCR方法检测七株胃癌细胞株中REG4基因的mRNA表达。针对REG4基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3),瞬时转染高表达胃癌细胞株。用RT-PCR方法检测转染后REG4基因的mRNA表达水平、MTT法检测细胞增殖能力、AnnexinV-PI法检测细胞凋亡水平。结果以永生化正常胃粘膜细胞株GES-1作为参照。MKN-45和AGS胃癌细胞株中REG4表达水平升高200倍以上,遂选用AGS细胞进行RNA干扰。RT-PCR结果证实siRNA2、siRNA3均有干扰效果,尤以siRNA3效果明显。选用siRNA3干扰AGS细胞株,MTT实验结果证实干扰AGS后,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。AnnexinV-PI实验结果显示细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论干扰REG4基因具有抑制胃癌细胞增殖、促进凋亡的作用,REG4基因可能成为胃癌基因靶向治疗的新靶点。     

二氯化钴对胃癌细胞SGC7901凋亡和增殖的影响

目的了解胃癌细胞系SGC7901在缺氧状态下凋亡和增殖情况,探讨低氧诱导因子(hypoxia induced factor,HIF-1α)与胃癌细胞SGC7901凋亡和增殖的关系。方法以二氯化钴(CoCl2)作为缺氧模拟剂,利用RT-PCR、免疫荧光及Western blotting法检测SGC7901细胞HIF-1α在转录水平和翻译水平上的表达,利用流式细胞仪检测SGC7901细胞在不同缺氧程度下的细胞凋亡率,利用MTT法观察SGC7901细胞的增殖情况。结果 (1)50μM CoCl2处理SGC7901细胞24小时后,HIF-1a mRNA及蛋白表达明显增加;(2)50μM CoCl2处理SGC7901细胞24小时后,细胞凋亡减少;(3)50μM CoCl2处理24小时后,细胞生长和增殖均加快。结论 50μM CoCl2处理SGC7901细胞24小时后,细胞增殖能力增加,细胞凋亡减少,HIF-1α表达增加,提示其在此过程中发挥重要作用。     

胃癌和相应癌旁组织中细胞凋亡与bcl-2的表达

①目的　探讨细胞凋亡和bcl 2蛋白表达在胃癌发生发展中的作用。②方法　选取 5 8例胃癌和相应癌旁组织作为研究对象 ,采用脱氧核苷酸移换酶 (TdT)介导的dUTP缺口末端标记法 (TUNEL)及免疫组化技术检测其细胞凋亡指数 (AI)和bcl 2蛋白的表达。③结果　胃癌和相应癌旁组织中AI及bcl 2蛋白表达差异有显著性 (t=13.4 0 0 ,P <0 .0 1;χ2 =4 .32 1,P <0 .0 5 )。bcl 2表达阳性组AI明显低于bcl 2表达阴性组 ,差异有显著性 (t=2 .381,P <0 .0 5 )。④结论　bcl 2蛋白异常表达可抑制细胞凋亡 ,与胃癌的发生有明显相关性     

胃癌细胞凋亡相关基因研究进展

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,死亡率很高。胃癌的发生是细胞凋亡与增殖调控失衡的结果。现综述细胞凋亡相关基因在胃癌的发生、发展、转归和治疗中的地位及其应用前景。     

外源性HPV16 E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞Cyclin E表达的影响

目的研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒（HPV）16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E（Cyclin E）表达的影响,探讨HPV16 E7癌基因以及Cyclin E在宫颈癌发生发展中的作用。方法用含有HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）检测感染前后Cyclin E表达的差异。结果HPV16 E7感染后Cyclin E表达较感染前明显增加。结论HPV16 E7基因的表达促进Cyclin E的表达,对宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。     

LYVE-1在胃癌中的表达及意义

目的：通过LYVE-1在胃癌组织中的表达,探讨胃癌组织癌内、癌周淋巴管生成机制及其与淋巴结转移的关系。方法：选用泸州医学院附属医院病理科随访的53例胃癌患者的手术切除组织病理存档蜡块,利用免疫组织化学方法检测LYVE-1和nm23在53例胃癌组织及正常胃黏膜组织中的表达,并进行微淋巴管密度（lymphatic vessel density,MLD）计数;分析nm23表达与LYVE-1阳性MLD、淋巴结转移的关系。结果：在胃癌组织中,癌周LYVE-1阳性MLD在淋巴结转移阳性组明显高于淋巴结转移阴性组（P〈0.01）;并显著高于正常胃黏膜组织及癌内组织（P〈0.01）;后两者MLD无显著性差异（P〉0.05）。而癌内LYVE-1阳性MLD在各临床病理参数之间无显著差别（P〉0.05）。结论：癌周淋巴管生成可能促进了淋巴结转移的发生,癌周淋巴管对胃癌的发生、发展起重要作用。     

c-FLIP在胃癌中的表达及其对凋亡的影响

目的检测c-FLIP在胃癌组织和胃癌细胞系中的表达,探讨其对胃癌细胞凋亡的影响。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测6株胃癌细胞系和32例配对的胃癌组织及癌旁形态学正常组织中c-FLIP的表达;应用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测下调c-FLIP表达对细胞凋亡的影响。结果 6个胃癌细胞系中存在c-FLIP的差异表达,其中BGC823高表达c-FLIP基因。在32例胃癌组织中有27例(84.4%)高表达c-FLIP基因,而在32例配对的癌旁形态学正常组织中仅有13例(40.6%)表达且表达水平明显低于胃癌组织。shR-NA干扰c-FLIP表达后明显抑制了细胞的凋亡。结论胃癌组织和细胞中存在c-FLIP的高表达,且其与细胞的凋亡相关,提示c-FLIP可能在抑制胃癌细胞凋亡中发挥重要作用。     

EBV相关胃癌组织中bcl-2和Ki-67蛋白表达的检测

①目的　探讨Epstein BarrVirus(EBV)相关胃癌 (EBVaGC)组织中bcl 2和Ki 6 7蛋白表达与EBV感染的关系。②方法　应用PCR Southern技术 ,检测 1 85例胃癌及相应癌旁组织中EBVDNA ,原位杂交技术检测PCR阳性标本EBV小RNA1 (EBER1 )的表达 ,确证EBVaGC。并选择EBV阴性胃癌 (EBVnGC)标本 ,应用免疫组化技术检测其bcl 2和Ki 6 7蛋白的表达。③结果　 1 85例胃癌组织中检测到EBVaGC 1 3例 ,阳性率为 7.0 3% ,1 85例癌旁组织均为阴性 ,胃癌组织和相应癌旁组织EBV阳性率比较差异有显著性 (χ2 =1 1 .0 77,P <0 .0 0 1 )。E BVaGC和EBVnGC组织中bcl 2表达率分别为 5 3.85 %和 4 8.89% ,二者比较差异无显著性 (χ2 =0 .0 99,P >0 .0 5 )。EBVaGC和EBVnGC组织中Ki 6 7指数 (KI)平均值分别为 2 8.2 5 4± 6 .2 84和 37.86 4± 1 4 .5 2 3,二者比较差异有极显著意义 (t′=2 .5 5 3,P <0 .0 1 )。④结论　EBV感染与部分胃癌的发生有一定相关性 ,EBVaGC的发生与bcl 2蛋白表达无明显相关性 ,与Ki 6 7蛋白表达有一定相关性。