截短型鸭乙型肝炎病毒核心蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

目的: 制备能与鸭乙型肝炎病毒核心抗原(DHBcAg)特异性结合的单克隆抗体(mAb),使之能特异性地对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)进行检测.方法: 以原核表达的截短型鸭乙型肝炎病毒核心抗原(DHBcAg1-214)免疫BALB/c小鼠后常规杂交瘤技术进行细胞融合,有限稀释法克隆化,间接酶联免疫吸附试验( ELISA)和免疫组织化学( IHC)筛选、鉴定.结果: 筛选出3株(3H4、 4A11、 5A12)能有效分泌抗鸭乙肝病毒核心抗原的杂交瘤细胞株.该mAb可用于ELISA、 IHC和Western blot研究.结论: 获得了3株有效分泌抗核心抗原的mAb,可用于鸭乙肝病毒相关肝病组织与血清的检测.     

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得能特异性识别人层粘连蛋白（hLN）的单克隆抗体（McAb）。方法用纯化的人层粘连蛋白（hLN）作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株（2A1、3B5、2C4、4D1）,培养上清的ELISA效价分别为：1∶512、1∶1024、1∶512、1∶256;腹水效价分别为：1×10^6、1×10^7、1×10^6、1×10^5;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG。结论成功建立了4株稳定分泌抗人LNMcAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体。     

抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。方法利用重组Derf1蛋白为免疫原,免疫BALB／c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,其Ig亚型均为IgG1,且6株单抗均具有良好的效价。ELISA和Western—blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组Derf1蛋白和天然的粉尘螨提取物。其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别。结论成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原Derf1的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Derf1检测及纯化方法奠定了基础。     

识别HIV-1 P_(24)蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以细胞培养的HIV-1全病毒抗原免疫,通过鼠-鼠杂交瘤技术获得3株分泌单克隆抗体(以下简称单抗)的杂交瘤细胞系(21A、51G、47B)。免疫印迹结果显示3株单抗均能识别病毒的核心元原-P_(24)蛋白。ELISA阻断抑制试验提示,3株单抗分别识别两个不同的抗原决定簇。进而为HIV-1病毒抗原的研究和制备以双抗体夹心法检测P_(24)抗原的试剂打下基础。     

抗重组人白细胞介素18单克隆抗体的制备与特性研究

目的 :获得有生物活性的小鼠抗重组人白细胞介素 18(rhIL 18)单克隆抗体。方法 :采用重组hIL 18免疫BALB C小鼠 ,应用杂交瘤技术 ,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株并经多次克隆化。结果 :建立了 2株小鼠抗hIL 18单克隆抗体杂交瘤细胞 1C7和 1F5 ,染色体数目分别为 92条和 90条 ,所分泌的抗体分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型 ,腹水IgG抗体经亲和层析法纯化后纯度达 95 %以上 ,效价为 1× 10 - 4和 1× 10 - 5,Westernblot显示 2株单抗均能特异性识别 18 3kD处的rhIL 18蛋白。 1C7单抗的亲和常数Ka=1 7× 10 5,1F5的亲和常数Ka=1 3× 10 5。 2株单抗识别不同抗原表位。结论 :制备的 2株单抗为进一步研究IL 18的分子结构、生物学功能及其与免疫相关性疾病的关系提供了实验材料。     

禽流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

目的：制备抗禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）的单克隆抗体（mAb）并进行特性鉴定。方法：分别用甲醛灭活的和TritonX-100裂解的AIV H9N2及AIVNP基因的原核表达产物免疫BALB／c小鼠。经细胞融合、间接ELISA筛选及克隆化，建立能稳定分泌抗AIV NP mAb的杂交瘤细胞株。mAb的效价采用间接ELISA测定，用交义反应试验及间接免疫荧光染色法检测mAb的特异性。结果：经细胞融合、筛选及克隆化，间接ELISA法测定，mAb共得到6株能稳定分泌抗禽流感病毒NPmAb的杂交瘤细胞株，分别命名为4F4、1C3、1G11、1C2、1D10及2E7。1G11、1D10腹水的ELISA效价最高，分别为2^-13和2^-14。交叉反应试验及间接免疫荧光染色检测表明，两株mAb的特异性良好。结论：其获得6株抗AIVNP的mAb，其中2株mAb1C11和1D10的效价最高，特异性良好，为AIV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。     

登革病毒非结构蛋白NS1群特异性单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备登革病毒NS1群特异性单克隆抗体,建立可检测登革病毒1～4型NS1抗原的ELISA检测法,为登革热的早期快速诊断奠定基础。方法应用毕赤酵母表达系统分泌表达登革病毒2型重组非结构蛋白NS1,以此为抗原免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选和亚克隆,获得能稳定分泌登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用所获得的单克隆抗体建立可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结果从登革病毒2型NS1重组毕赤酵母（Pichia Pastoris-NS1）中获得了大量纯化的登革病毒重组NS1蛋白;经免疫小鼠、细胞融合、间接ELISA筛选及3次亚克隆后,最终获得2株能高效分泌抗登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D7B6B4和2D10E2F6,间接ELISA显示抗体效价高达1∶8000～1∶16000;ELISA及免疫荧光检测证实,其所分泌的抗体与1～4型登革病毒及其重组NS1蛋白均有特异性免疫反应,为登革病毒NS1群特异性单克隆抗体;两株单克隆抗体均为IgG2a亚类;初步建立了检测4个血清型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法。结论成功研制出两株能高效分泌抗登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。初步建立了可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测法。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp)单克隆抗体（McAb),并对其特异性进行鉴定。用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA,Westen blotting试验分析其特异性。结果,制备出2A5和1H10两株能稳定分泌抗LDHpMcAb的杂交瘤细胞株,两株单抗均为IgG2b,2A5和1H10培养上清的ELISA效价分别为1：512和1：256,腹水效价分别为1：25600和1：12800,两株单抗与间日疟,红细胞,弓形虫,日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应,能识别恶性疟原虫的33Kda虫源蛋白。证明制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

蛋白酶K单抗研制及其双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立

目的 研制蛋白酶K单克隆抗体并构建定量检测蛋白酶K的双抗体夹心ELISA方法 ,用于生物制品中蛋白酶K的检测。方法 用杂交瘤技术制备抗蛋白酶K的单抗,用棋盘法优化ELISA条件,建立定量检测蛋白酶K的双抗体夹心ELISA方法,分析其特异性、精密性和准确性。结果 经免疫、融合、克隆、筛选到稳定分泌蛋白酶K单抗的杂交瘤细胞。获得1株阻断蛋白酶K活性的单抗5G6,以5G6为包被抗体、4D3为酶标抗体,构建蛋白酶K定量检测的ELISA方法。本方法线性相关系数R=0.99,线性范围为293.4~2 500 pg/ml;定量限度为293.4 pg/ml;变异系数为CV<15%;回收率介于89.3%~129.2%之间,37℃6 d的回收率>80%;与蛋白酶K以外的其他蛋白无交叉反应。结论 获得阻断蛋白酶K活性的单抗,构建出灵敏、特异的蛋白酶K定量检测方法。     

抗烟曲霉菌单克隆抗体鉴定和初步应用

目的 :制备抗烟曲霉菌单克隆抗体 (McAb) ,建立一种快速检测烟曲霉菌抗原方法。方法 :用基因重组烟曲霉菌半乳糖甘蛋白 (AFMP1)抗原 ,免疫BALB/c小鼠 ,制备单克隆抗体 ,选择针对不同抗原决定簇单抗配对 ,建立双抗夹心ELISA法检测烟曲霉菌抗原。结果 :筛选出 3株稳定分泌抗烟曲霉菌单抗杂交瘤细胞株 ,IgG亚类鉴定分别为IgG1、IgG2a、IgG2b ,抗体亲和常数分别为 1 2× 10 10 、4 5 6× 10 9和 1 81× 10 10 mol/L ,免疫印迹证实单抗特异性识别烟曲霉菌培养上清和细胞裂解产物 ,相加试验表明 3株单抗是针对不同抗原决定簇 ,组成配对双抗夹心ELISA法 ,检测最高灵敏度为 0 1ng/ml,可测范围为 0 1～ 6 0ng/ml。结论 :3株杂交瘤细胞株特异性好、亲和力高 ,组成配对夹心ELISA法可用于快速检测烟曲霉菌抗原。     

抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗禽流感病毒M2蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:利用纯化的融合蛋白GST-M2免疫BALB/c小鼠,然后以GST-M2 和 GST分别作为ELISA抗原进行筛选,选择GST-M2抗原检测强阳性、GST抗原检测阴性的杂交瘤细胞进行克隆,建立能稳定分泌抗AIV M2 mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA和琼脂扩散试验(AGP)测定,用夹心ELISA测定Ig亚类,Western blot、抗原捕获ELISA、间接免疫荧光及免疫组化染色法检测 mAb 的特性.结果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的杂交瘤细胞株1E1、2F8、4E3 和 5D6,小鼠腹水中抗体的ELISA效价大于210×100、AGP效价大于1:4.抗体亚类鉴定1E1和4E3为IgG2a,2178和5G6为IgG2b.抗原捕获ELISA表明,2F8 wAb能与H5、H9亚型AIV发生特异性反应,而不能与鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)反应.IFA和免疫组化试验表明,2F8 mAb能够与感染了禽流感病毒的MDCK细胞以及鸡体组织细胞发生特异性结合.结论:本研究获得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效价高、特异性强,可作为检测AIV方法的核心试剂.     

H5N1流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体的研究

目的 制备抗人流感病毒H5N1株M1蛋白的单克隆抗体,为流感的快速诊断和研究提供新的工具.方法 应用在大肠埃希菌中表达的人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)株M1蛋白,以纯化的表达产物免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与sp2/0细胞系作细胞融合后,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并应用间接免疫荧光法对抗体的特异性进行鉴定.结果 获得3株能稳定分泌抗禽流感病毒M1抗原的McAb杂交瘤细胞株,交叉反应试验及间接免疫荧光检测表明,三株McAb具有型特异性.结论 用H5N1禽流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体,具有一定的交叉反应性,可用于多种亚型甲型流感病毒的检测.     

西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ特异性单克隆抗体的研制

目的研制针对西尼罗Ⅲ重组融合蛋白的特异性单克隆抗体。方法用西尼罗Ⅲ重组融合蛋白免疫BALB／c小鼠，用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，并用间接ELISA方法进行筛选，所获得的单抗经间接ELISA、免疫印迹和间接免疫荧光试验进行鉴定。结果共获得了3株能稳定分泌针对西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的特异性单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为4F7、6H3和8FA，其单抗亚类鉴定分别属于IgG1、IgG1和Ig2a。这3株单克隆抗体均能与重组西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ发生特异性反应，而与日本脑炎病毒无交叉反应，并且，8FA和6H3识别同一抗原位点，4F7识别西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的另一抗原位点。结论本实验成功研制出针对西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的特异性单克隆抗体，为我国建立西尼罗河病毒的病原学检测方法并与日本脑炎病毒进行鉴别诊断提供了技术贮备。     

Characterization of a panel of monoclonal antibodies to hepatitis C NS3 recombinant protein

Recombinant protein rNS3 imitating helicase region (1356-1459 amino acid residues) of hepatitis C virus (HCV) was expressed in E. coli cells and used for BALB/c mice immunization. Seven hybrydoma clones producing monoclonal antibodies (MAbs) to rHS3 were obtained. All MAbs reacted in ELISA with NS3 protein from Murex anti-HCV Version III and in immunoblotting from RIBA 3. These MAbs detect 5 individual epitopes, 4 of which were conformational and 1 discontinuous. All MAbs could compete for rNS3 binding with serum antibodies from patients with chronic hepatitis C, which suggests that these MAbs can recognize the natural HCV NS3 protein.     

Polymerase-related polypeptides associated with woodchuck hepatitis core antigen (WHcAg) particles

The woodchuck hepatitis virus (WHV) polymerase (pol)-encoded polypeptide(s), obtained from purified virus nucleocapsid particles, have been characterized by Western blotting. Peptide antibodies to amino-terminal (residues 32-45, WHV pol-6) and carboxy-terminal (residues 861-879, WHV pol-1) sequences were used, in addition to monoclonal antibodies made from purified woodchuck hepatitis core antigen (WHcAg) particles. One of the monoclonal antibodies, WC pol-11, specifically bound WHV pol-1. Both peptide and monoclonal anti-WHV pol-1 also bound a recombinant DNA-produced WHV polymerase polypeptide. These antibodies specifically detected WHcAg-associated polymerase polypeptides at 65,000 (p65) and 31,000 (p31) Da by Western blotting. These results support the conclusion that WHV pol-11 has anti-pol reactivity and that it binds the carboxyl-terminal sequences of the WHV polymerase. The finding that these reagents also specifically bind to corresponding sequences from the carboxy terminus of the hepatitis B virus polymerase suggests that these viral polymerases are cross reactive. Finally, anti-WHV pol-6 did not bind either WHcAg p65 or p31, suggesting that both of these polypeptides have different amino-terminal but the same carboxy-terminal sequences.     

Monoclonal antibodies to Ebola virus: isolation, characteristics, and study of cross reactivity with Marburg virus

Thirteen hybridoma strains producing monoclonal antibodies (Mabs) to Ebola virus were prepared by fusion of NS-O mouse myeloma cells with splenocytes of BALB/c mice immunized with purified and inactivated Ebola virus (Mayinga strain). Mabs directed against viral proteins were selected and tested by ELISA. Protein specificity of 13 Mabs was determined by immunoblotting with SDS-PAGE proteins of Ebola virus. Of these, 11 hybridoma Mabs reacted with 116 kDa protein (NP) and 2 with Ebola virus VP35. Antigenic cross-reactivity between Ebola and Marburg viruses was examined in ELISA and immunoblotting with polyclonal and monoclonal antibodies. In ELISA, polyclonal antibodies of immune sera to Ebola or Marburg viruses reacted with heterologous filoviruses, and two anti-NP Ebola antibodies (Mabs 7E1 and 6G8) cross-reacted with both viruses. Target proteins for cross-reactivity, Ebola NP (116 kDa) and Marburg NP (96 kDa), and VP35 of both filoviruses were detected by immunoblotting with polyclonal and monoclonal antibodies (6G8) to Ebola virus.     

呼吸道合胞病毒 L 蛋白单克隆抗体的制备

目的：制备人呼吸道合胞病毒L蛋白单克隆抗体，并对其进行性质鉴定。方法：选取RSV-A2 L蛋白上具有亲水性可能的loop区段，将这些目的片段展示在HBc149上进行原核表达并纯化。重组蛋白免疫6~8周BALB/c雌性小鼠，根据免疫后血清的ELISA和WB分析结果选择L3935和L4099组小鼠进行脾脏免疫。融合后，用间接ELISA法筛选和多次克隆化，获得稳定分泌抗L蛋白单克隆抗体细胞株，并结合ELISA、免疫荧光和免疫印迹对所获得的单抗进行鉴定。结果：获得11株L蛋白特异性单克隆抗体，亚类鉴定结果IgG1、IgG2a和IgG3单抗各3株，IgG2b单抗2株。结论：成功制备了L蛋白特异性单克隆抗体，也为RSV感染的免疫和发病机制研究奠定基础。     

人精子蛋白17单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗精子蛋白17(Sp17)的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:克隆人Sp17cDNA,表达带有6His标记的重组Sp17,用纯化的重组Sp17免疫BALB/c小鼠制备mAb。用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆。用免疫组化染色法及阻断试验鉴定mAb的特异性。结果:获得2株杂交瘤细胞系3C12和3D6,其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG1和IgM(κ),杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶64和1∶32;腹水mAb的效价分别为1∶1×105和1∶5×104。用人和大鼠睾丸组织以及人精液精子免疫组化染色及阻断试验证明,抗Sp17mAb具有良好的特异性。抗Sp17mAb也可识别卵巢癌组织中异常表达的Sp17。结论:成功地制备特异性的抗Sp17mAb,为研究该蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础。     

抗HSPC238单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗HSPC238的单克隆抗体，为HSPC238的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原，免疫BALB／c小鼠，运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体，并用间接ELISA法和Western—blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗HSPC238的单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别命名为E001和E002。ELISA检测抗HSPC238单克隆抗体的腹水效价为1：12800和1：25600。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。通过Western—blot实验证实，两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性HSPC238蛋白。结论成功制备了两株效价高、特异性好的抗HSPC238单克隆抗体，制备的抗HSPC238单克隆抗体可用于HSPC238蛋白的鉴定，为HSPC238蛋白的生物学功能研究奠定了基础。