牛磺酸对微囊化肝细胞生长的影响

目的：微胶囊中存在一定程度的高渗透压胁迫，可造成细胞生长代谢减慢，为改善微囊化肝细胞的生长，尝试应用抗渗透压胁迫物质牛磺酸，观察其对微囊化肝细胞生长的影响。方法：实验于2006-07／08在中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程实验室完成。将HepG2细胞悬液（非微囊化细胞）和微囊化HepG2分别接种于牛磺酸浓度为0，0．6，0．8和1．2mmol／L的MEM培养液中，在37℃体积分数为0．05的CO2中培养。MTT法测定非微囊化和微囊化HepG2细胞的生长活性，相差显微镜观察囊内细胞生长状态。结果：①非微囊化HepG2细胞：0．6，0．8和1．2mmol／L的牛磺酸对其生长无影响，吸光度值比较差异无显著意义（P〉0．05）。②微囊化HepG2细胞：0．6，0．8mmol／L牛磺酸对微囊化肝细胞的生长亦无影响（P〉0．05）：但1．2mmol／L牛磺酸町以显著改善微囊化肝细胞的生长，其吸光度值高于0mmol／L牛磺酸组（P〈0．05），并促进细胞的聚集。结论：1．2mmol／L牛磺酸可以改善微囊化肝细胞的生长并抵制微囊内的高渗透压胁迫对细胞的生长抑制作用。     

肝细胞微囊化技术理论进展与临床应用

肝细胞分离技术日趋成熟,肝细胞移植成为较热门的研究领域,但供体短缺和免疫排斥反应,制约了其广泛应用.肝细胞微囊化有助于为肝细胞移植的推广应用提供大量的具有高度活性和良好功能的肝细胞.文章就肝细胞微囊化技术及其应用进展进行综述,为肝细胞大规模、高活性体外培养及长期冻存提供了新的途径.     

微囊化肝细胞移植大鼠急性肝功能衰竭模型的哪

目的:对微囊化肝细胞体内外功能进行系统评测,探讨微囊化肝细胞异种移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的可行性.方法:以海藻酸-多聚赖氨酸-海藻酸(APA)微囊包裹大鼠肝细胞.体外测定微囊化肝细胞及游离肝细胞培养上清白蛋白水平.急性肝衰竭大鼠随机分为3组,分别为:生理盐水腹腔注射组(Ⅰ组)、游离肝细胞腹腔内移植组(Ⅱ组)、微囊化肝细胞腹腔内移植组(Ⅲ组).观察移植后大鼠存活率、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TB)、凝血酶原时间(PT)的改变.结果:体外微囊化肝细胞与裸肝细胞白蛋白分泌水平差异无显著性(P＞0.05).Ⅲ组存活率较Ⅰ、Ⅱ组有显著性差异(P＜0.05).移植后第1、2天Ⅰ组的AST、ALT、ALB、TB、PT水平较Ⅱ、Ⅲ组有显著性差异(P＜0.05),移植后第5天Ⅱ组的AST、ALT、ALB、TB、PT水平较Ⅲ组有显著性差异(P＜0.05).结论:APA微囊化肝细胞在体内外均具有良好的生物活性,微囊化肝细胞腹腔内移植可以提高急性肝衰竭鼠的存活率,改善急性肝衰鼠的肝脏功能.     

微囊化肝细胞移植大鼠急性肝功能衰竭模型的体内外功能评测

目的:对微囊化肝细胞体内外功能进行系统评测,探讨微囊化肝细胞异种移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的可行性。方法:以海藻酸-多聚赖氨酸-海藻酸(APA)微囊包裹大鼠肝细胞。体外测定微囊化肝细胞及游离肝细胞培养上清白蛋白水平。急性肝衰竭大鼠随机分为3组,分别为:生理盐水腹腔注射组(Ⅰ组)、游离肝细胞腹腔内移植组(Ⅱ组)、微囊化肝细胞腹腔内移植组(Ⅲ组)。观察移植后大鼠存活率、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TB)、凝血酶原时间(PT)的改变。结果:体外微囊化肝细胞与裸肝细胞白蛋白分泌水平差异无显著性(P>0.05)。Ⅲ组存活率较Ⅰ、Ⅱ组有显著性差异(P<0.05)。移植后第1、2天Ⅰ组的AST、ALT、ALB、TB、PT水平较Ⅱ、Ⅲ组有显著性差异(P<0.05),移植后第5天Ⅱ组的AST、ALT、ALB、TB、PT水平较Ⅲ组有显著性差异(P<0.05)。结论:APA微囊化肝细胞在体内外均具有良好的生物活性,微囊化肝细胞腹腔内移植可以提高急性肝衰竭鼠的存活率,改善急性肝衰鼠的肝脏功能。     

牛磺酸对微囊化肝细胞生长的影响

目的:微胶囊中存在一定程度的高渗透压胁迫,可造成细胞生长代谢减慢,为改善微囊化肝细胞的生长,尝试应用抗渗透压胁迫物质牛磺酸,观察其对微囊化肝细胞生长的影响.方法: 实验于2006-07/08在中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程实验室完成.将HepG2细胞悬液(非微囊化细胞)和微囊化HepG2分别接种于牛磺酸浓度为0,0.6,0.8和1.2 mmol/L的MEM培养液中,在37 ℃体积分数为0.05的CO2中培养.MTT法测定非微囊化和微囊化HepG2细胞的生长活性,相差显微镜观察囊内细胞生长状态.结果:①非微囊化HepG2细胞:0.6,0.8和1.2 mmol/L的牛磺酸对其生长无影响,吸光度值比较差异无显著意义(P > 0.05).②微囊化HepG2细胞:0.6,0.8 mmol/L牛磺酸对微囊化肝细胞的生长亦无影响(P > 0.05);但1.2 mmol/L牛磺酸可以显著改善微囊化肝细胞的生长,其吸光度值高于0 mmol/L牛磺酸组(P < 0.05),并促进细胞的聚集.结论:1.2 mmol/L牛磺酸可以改善微囊化肝细胞的生长并抵制微囊内的高渗透压胁迫对细胞的生长抑制作用.     

微囊化成年兔许旺细胞的体外培养

背景:研究发现将体外培养扩增的大量许旺细胞种植到神经导管上来引导周围神经再生效果明显,而目前备受关注的微囊化免疫隔离技术,在克服免疫排斥问题上具有明显的优势与实用性.目的:微囊包裹兔许旺细胞并进行体外培养,观察许旺细胞形态及增殖变化.设计、时间及地点:体外细胞水平观察实验,于2005-09/2006-05在南昌大学第二附属医院分子实验室完成.材料:健康成年家兔由南昌大学医学院动物中心提供,微囊发生器由南昌大学医学院神经生物学研究室研制.方法:使双侧坐骨神经发生Wallerian变性,经改良后反复差速贴附法进行培养,快速分离纯化许旺细胞.海藻酸钠-氯化钡一步成囊法包裹生长良好的第3代许旺细胞.主要观察指标:倒置显微镜下观察培养过程中微囊化许旺细胞形态变化,MTT检测不同时期微囊化许旺细胞及游离许旺细胞的增殖改变.结果:在培养过程中可见微囊及其囊内许旺细胞形态均保持完整,微囊未见破损.微囊化后的许旺细胞总体呈现悬浮生长的趋势.培养0,1,3,5,7 d时MTT检测微囊许旺细胞组与游离许旺细胞组吸光度值差异有显著性意义(P＜0.05).结论:微囊包裹的许旺细胞体外可存活较长时间,微囊化许旺细胞相比游离许旺细胞增殖速度有所减慢.     

微囊化(APA)猪甲状腺组织治疗甲状腺功能减退大鼠前后甲状腺功能的变化

目的 用非微囊化猪甲状腺组织治疗甲减大鼠作对照，观察微囊化(APA)猪甲状腺组织治疗甲减大鼠前、后大鼠甲状腺功能的变化情况。方法 采用放免法。结果 移植后两组的T3、T4水平升高，其中对照组更为明显，但9w后明显下降，甚至低于移植前水平，实验组保持持续升高，超过40w；移植后两组的TSH水平均明显下降，以实验组为显著，而又持续降低超过40w，对照组持续时间较短，移植9w后开始回升。移植后微胶囊回收率为100％，回收的微囊化甲状腺组织存活率达80％。结论 微囊化猪甲状腺组织治疗甲状腺功能减退大鼠疗效显著，微囊化方法达到了免疫隔离的目的，延长了组织移植后的存活时间。     

原代小型猪肝细胞微载体培养及其功能特性

目的 研究原代小型猪肝细胞微载体培养方法的建立及肝细胞功能特性。方法将3.20×107个的肝细胞及2g/L cytodexTM 3微载体连同40ml含100ml/L Hyclone小牛血清及其他辅助因子的RPMI 1640培养基加入250ml已硅化的方瓶中培养。对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察。同时测定不同培养时期肝细胞生物合成及生物转化功能。结果肝细胞产量为6.8×109～8.1×109(7.58±0.57)×109/肝细胞;肝细胞活率为92.0%～99.0％(96.25％±3.10％);肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;接种培养后肝细胞呈明显的朝CytodexTM 3聚集,二者易相粘贴,粘附在微载体上的肝细胞增殖生长旺盛;当肝细胞数为3.20×107个时,接种后24h肝细胞尿素及白蛋白合成量分别为1.22mmol/L及0.075g/L;随着时间的延长,利多卡因的转化率逐渐增加,在24h时即达到100％。结论 使用微载体培养的小型猪肝细胞具有较旺盛的增殖生长能力、良好的生物转化及生物合成功能,可作为体外生物人工肝较为理想的细胞来源。     

培养微囊化牛肾上腺嗜铬细胞分泌镇痛物质能力的实验研究

目的：了解培养的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊化牛肾上腺嗜铬细胞(BCCs)的儿茶酚胺(CA)和亮氨酸脑啡肽(L-EK)的分泌状态。方法：在非囊化BCCs与囊化BCCs(APA-BCCs)的孵育液中加或不加尼古丁，用高效液相色谱-电化学法检测孵育液中去甲肾上腺素和肾上腺素的含量、用放射免疫法检测孵育液中L-EK的含量。结果：培养1，3，5，7，9和11d时，在非刺激条件下，APA-BCCs与BCCs均能稳定地分泌CA和L-EK；尼古丁刺激时可显著增加BCCs和APA-BCCs分泌CA和L-EK的水平(P&;lt;0．05)；APA-BCCs与BCCs的基础及刺激分泌水平差异无显著性意义。结论：体外培养的BCCs及APA微囊化BCCs均具有儿茶酚胺类和脑啡肽类的基础及刺激分泌功能。     

微囊化技术在医学领域中的应用与进展

背景:微囊的免疫隔离保护和可控缓释的特性得到了医学领域的重视,并已广泛应用于糖尿病、帕金森症、肝衰竭、镇痛、肿瘤等疾病治疗过程中.目的:综述微囊化技术的特性以及在医学研究领域中的应用.方法:由第一作者检索 1964/2009PubMed数据库(网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed),2000/2009万方数据库(网址http://www.wanfangdata com.cn)有关微囊化移植,微囊化可控缓释,微囊化技术在医学应用方面的应用方面的文献,英文关键词为microencapsulated,transplantation,controlled release.中文关键词为微囊化.结果与结论:微囊作为一种载体,为细胞提供了一个三维培养基质,改善细胞间的作用,提高细胞的功能;为异体细胞提供了免疫屏障,阻挡免疫细胞的识别,但又不妨碍营养物质、氧气及代谢产物运输;为机体提供可控的长期稳定缓释有效成分治疗疾病.微囊化技术在糖尿病方面研究比较多,在帕金森症、肝衰竭、脊髓损伤、甲状旁腺功能低下、骨科领域、肿瘤癌症等方面也有一定的探索,但微囊化技术从个别动物试验成功到真正临床广泛应用还有很漫长的历程,在拓宽微囊化技术在医学领域运用的同时,需进一步加强理想刚性结构、良好生物相容性和可控半透膜性的探索.     

微囊化兔嗅球组织移植对脊髓损伤大鼠细胞凋亡的影响

目的:观察微囊化兔嗅球组织细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤后细胞凋亡及功能恢复的影响,并探讨其对脊髓继发性损伤的保护作用及其机制。方法:实验于2004-10/2005-07在南昌大学基础医学院应用解剖研究室完成。选择清洁级SD大白鼠120只,按随机数字表法分为4组:正常对照组、损伤对照组、单纯细胞悬液移植组、微囊化移植组,每组30只。制作T10节段脊髓全横断损伤模型。正常对照组仅打开椎管,暴露脊髓不作移植;损伤对照组仅用明胶海绵填塞脊髓损伤腔隙;单纯细胞悬液移植组植入吸附细胞悬液的明胶海绵块;微囊化移植组用与断端腔隙大小相吻合的明胶海绵块吸附10μL的微囊化细胞,植入洞腔。分别于术后12h,1,3,7,21d5个时间点对动物进行BBB评分后处死。取损伤区1cm范围脊髓节段,常规石蜡包埋,水平切片进行苏木精-伊红染色、TUNEL染色,观察凋亡细胞的数量及分布变化。按BBB评分法对大鼠术后运动功能的恢复情况进行评分,共分22级,最低分0分,最高分21分,分数越高,运动功能恢复越完善。结果:纳入大鼠120只,存活96只,存活率为80%。其中以损伤对照组及单纯细胞悬液移植组死亡率较高,损伤对照组大鼠死亡的主要原因可能是脊髓损伤导致损伤平面以下神经功能的丧失所引起的一系列并发症所导致的;而单纯细胞悬液移植组是因为免疫排斥反应所导致。①术后3d内各组间BBB评分差异无显著性意义(P>0.05);术后7,21d微囊化移植组和单纯细胞悬液移植组大鼠BBB评分高于损伤对照组,差异均有显著性意义[分别为(7.25±1.17),(4.58±0.38),(2.67±0.61)分;(10.42±1.63),(6.08±0.80),(3.33±0.68)分,F=4.528,3.821,P<0.05],且经微囊化处理后比单纯兔嗅球组织细胞悬液移植运动功能恢复更好(F=4.112,P<0.05);而损伤对照组大鼠后肢运动功能恢复均较差。②光镜下损伤对照组、单纯细胞悬液移植组脊髓损伤后,脊髓内空洞增大,损伤范围基本确定,周围有炎性细胞浸润;在微囊化移植组脊髓损伤明显减轻,细胞皱缩不明显、胞质、胞核较清晰。③术后1,3,7d微囊化移植组TUNEL阳性细胞数及凋亡指数低于损伤对照组,差异有显著性意义(以术后3d为例,TUNEL阳性细胞数分别为(8.83±1.33),(14.50±1.05)个/视野,P<0.01;凋亡指数分别为10.45±1.58,17.06±1.23,P<0.01)。结论:微囊化兔嗅球组织细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤后细胞凋亡具有保护作用,能促进脊髓功能的恢复。     

微囊化肾上腺细胞移植与生物可降解材料的临床应用

肾上腺细胞移植是治疗肾上腺皮质功能不全的一种新方法,但免疫排斥反应是限制细胞移植广泛应用的主要问题,微囊免疫隔离技术是克服免疫排斥反应的有效方法之一.微囊化细胞一方面有较好的免疫隔离作用,另一方面其半透膜表面可以容许小分子物质的通过,保证了囊内移植物的存活.海藻酸钙-聚赖氨酸海藻酸钙是应用比较成熟的微囊材料,具有较好的生物相容性和机械稳定性,能提高细胞的生物活性和分泌功能.微囊的外径大小是影响其强度的主要因素,一股认为体积小且表面光滑的微囊比体积大的微囊强度高,不易破裂.但海藻酸钙聚赖氨酸-海藻酸钙作为膜材料随着时间的延长,其囊本身有降解的可能,易引起囊周纤维化反应,选择合适的膜材料成为目前研究的焦点.随着组织工程技术的发展,以生物可降解材料聚β-羟基丁酸酯为载体的肾上腺细胞移植已经进入实验研究,研究发现该材是一种较好的细胞载体,可以促进移植细胞的生存、功能的恢复,有着广阔的应用前景.     

长期体外培养条件下海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的变化

目的:了解在体外长期培养的条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的形态及其细胞活率的变化。方法:实验于2003-09/2004-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学室完成。①材料:细胞为牛肾上腺嗜铬细胞;海藻酸钠和多聚赖氨酸由SIGMA公司提供;DMEM-H培养液由GIBCO公司提供;加强型小牛血清由HYCLONE公司提供。②方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微胶囊包裹牛肾上腺嗜铬细胞,以含有体积分数为0.1的小牛血清的DMEM-H培养基培养于CO2孵箱中,定期换液。③观察指标:在光学显微镜下观察微囊及囊内细胞的形态;以锥虫蓝染色法计数囊内细胞的数量和存活率,观察时间为8个月以上。结果:①微囊包裹后1d时,光镜下见微囊呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内为单个细胞,均匀散在分布。体外培养35d时,微囊仍呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内细胞聚集成体积较小的团块。体外培养240d时,微囊形态无明显变化;囊内大部分细胞已聚集成多个体积较大的团块,少数微囊内的细胞聚集成一个大的细胞团。②随着培养时间的延长,囊内细胞数量逐渐减少,从最初的(54±10)个/囊减少到培养243d时的(35±7)个/囊,但差异无显著性意义(P>0.05);囊内细胞的活率无明显改变,开始为95%,到培养243d时仍有93%的细胞存活。结论:在体外培养条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞可较长时间地保持良好状态。     

海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化大鼠卵巢激素分泌细胞异体移植对垂体形态学的影响

目的:已有研究证实海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊对机体无明显毒副作用且生物相容性好,应用这一技术包裹细胞,可明显延长异体内移植物的存活时间.将海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化大鼠卵巢细胞体外培养后进行异体移植,观察其治疗卵巢功能丧失模型大鼠的可行性及垂体形态学变化.方法:实验于2006-03/2007-09在首都医科大学生殖医学研究中心完成.①实验动物:30只Wistar雌性大鼠,随机分为正常对照组,卵巢摘除组,微囊移植组,每组10只.实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求.②实验方法:卵巢摘除组:无菌条件下切除双侧卵巢:微囊移植组:海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠生物膜包裹传至P2代的大鼠卵巢细胞,制成微囊体外培养,收集24 h培养液以检测雌二醇分泌状态;将微囊化的卵巢细胞移植入已行双侧卵巢切除术的大鼠腹腔.用阴道涂片观察大鼠动情周期恢复情况.术后40 d麻醉后处死动物,放射免疫法检测血清雌二醇质量浓度,垂体组织常规石蜡包埋,连续切片,分别进行苏木精-伊红染色和雌、孕激素受体免疫组织化学染色.LEICA Q500IW自动图像分析仪对垂体细胞的面积,雌、孕激素受体吸光度值进行定量测定.结果:①放射免疫法检测培养液显示,微囊化的卵巢激素分泌细胞具有继续合成和分泌雌二醇的功能.②检测血清中雌二醇质量浓度结果显示,卵巢摘除组明显低于正常对照组和微囊移植组,差异具有显著性意义,正常对照组和微囊移植组之间差异无显著性.⑤动情周期未恢复.④苏木精-伊红染色可见卵巢摘除组大鼠垂体中有大量阉割细胞,平均面积＞180 μm2,与卵巢摘除组比较,微囊移植组大鼠垂体中细胞平均面积和阉割细胞数目均显著减少.⑤垂体雌、孕激素受体免疫组织化学吸光度值结果显示,卵巢摘除组明显低于正常对照组和微囊移植组,差异具有显著性意义.结论:微囊化大鼠卵巢细胞异体移植后,可在受体大鼠体内继续合成和分泌雌二醇,并可以减少垂体内阉割细胞的形态和数目,提高垂体细胞雌激素受体和孕激素受体的表达,提示移植后细胞对垂体有反馈调节作用.     

多种细胞因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化

背景:肝细胞移植是治疗终末期肝功能衰竭的有效方法之一,却面临细胞来源缺乏、体外难以大量增殖、传代后无法保持其原有特性、免疫排斥等因素的限制,寻找新的肝细胞来源尤为迫切.目的:探讨肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子及抑瘤素M诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞的能力.设计、时间及地点:细胞对照观察,于2006-0612007-03在泸州医学院附属医院实验室完成.材料:清洁级雄性Wistar大鼠24只用于制备骨髓间充质干细胞.红细胞裂解液由泸州医学院附属医院传染免疫实验室配制重组鼠肝细胞生长因子、抑瘤素M为美国R&D产品,酸性成纤维细胞生长因子由美国Peprotech生产.方法:采用红细胞裂解+贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶消化后传代.传至第4代,以5×107 L-1接种,设立6组向肝细胞诱导分化:第1组作为对照,不加任何细胞因子;第2组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子;第3组加入肝细胞生长因子、抑瘤素M;第4组加入酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M;第5组加入肝细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、抑瘤素M;第6组于1～9d加入肝细胞生长因子,9～18d加入酸性成纤维细胞生长因子,9～21d加入抑瘤素M.每组所加入的各种细胞因子终末浓度均为20μg/L.主要观察指标:采用溴甲酚绿法、化学发光法、RT-PCR法检测肝细胞特异性标志物白蛋白、甲胎蛋白的表达.采用谷氨酸脱氢酶法检测尿素含量.结果:诱导0,7,14,21d,未加入诱导因子的对照组及酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组无白蛋白、尿素表达,肝细胞生长因子+酸性成纤维细胞生长因子+抑瘤素M组培养基上清液中甲胎蛋白、白蛋白、尿素含量均显著高于其余因子组(P<0.05).结论:酸性成纤维细胞生长因子与抑瘤素M共同作用无法诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化,二者联合肝细胞生长因子可成功诱导骨髓间充质干细胞分化为肝细胞.分时段加入此三种细胞因子,可能影响了细胞因子间的相互作用而导致分化率降低.