牙齿修复相关转基因研究:显微注射法获得pTet-on-CX转基因工具小鼠G0代的实验观察

目的为便于进行规模化的转基因研究,构建一种四环素调控性转基因体系中的工具小鼠系.方法实验于2002-06/10在上海南方模式生物研究中心完成.以cβ-actin启动子取代pTet-on-NSE质粒中的NSE启动子,构建转基因载体pTet-on-CX;将XhoI酶切线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核,移植到假孕母鼠的输卵管.仔鼠出生后,经PCR及Southern Blotting检测阳性小鼠.结果注射的受精卵共存活603枚,移卵后产仔64只,阳性6只.阳性鼠分别传代开始建系.结论通过显微注射的方法获得pTet-on-CX转基因工具小鼠的G0代,为规模化的转基因研究(包括与牙齿修复有关的基因,如牙本质涎磷蛋白基因)奠定了基础.     

过度表达突变核纤层蛋白A受精卵移植至假孕鼠体内的成活能力

目的:制备Hutchinson-Gilford早老症转基因小鼠模型,观察突变的核纤层蛋白A对小鼠受精卵着床和成活情况的影响。方法:实验于2004-09/2007-04在北京大学医学部医学遗传学系和中国农业大学生物技术国家重点实验室完成。①实验方法:将缺失了第11外显子末端150个碱基的LMNA基因cDNA克隆到pcDNA3.1载体,应用原核显微注射方法将线性化的pcDNA3.1-mutant LMNA注射到小鼠受精卵的雄原核,再将注射后的受精卵移植至假孕鼠的输卵管。②实验评估:观察受精卵的着床和成活情况。通过聚合酶链反应检测着床的胚胎,鉴定有无阳性转基因动物。结果:①178只注射pcDNA3.1-mutant LMNA后的存活受精卵移植至假孕鼠输卵管后,出生13只子代鼠,出生率只有7%;58只注射pcDNA3.1-mutant LMNA后的存活受精卵移植到假孕鼠输卵管后,在移植后12￣15d的受体母鼠子宫内收集到1只活胚和5只死胚。②聚合酶链反应方法检测所收集到的胚胎,没有得到pcDNA3.1-mutant LMNA阳性转基因鼠。在着床的胚胎中也没有检测到pcDNA3.1-mutant LMNA。结论:过量表达的突变核纤层蛋白A对小鼠受精卵有致死性,只有无目的基因整合的受精卵才能存活至出生。     

AML1-ETO转基因小鼠的建立及初步表型分析

目的:建立AM L1-ETO融合基因转基因小鼠,在整体动物水平研究AM L1-ETO融合蛋白在白血病发病中所起的作用。方法:构建hCG/AM L1-ETO转基因质粒,通过显微注射将该质粒转入小鼠受精卵中,植入假孕母鼠输卵管,获得G0代转基因小鼠;用聚合酶链反应(PCR)方法检测融合基因的整合情况,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测融合基因的表达情况和组织表达谱。结果:PCR法共检出10只G0代转基因阳性小鼠,其中8个系均产下F1代小鼠,由此建立了8个AM L1-ETO转基因小鼠系。RT-PCR法证实AM L1-ETO融合基因在22系中稳定表达,但血常规、肝脏、脾脏等组织未见异常变化;对该系小鼠的组织表达谱检测表明,融合基因在肝脏、脾脏、心脏和肌肉组织存在不同程度的表达,但在脑组织中不表达。结论:AM L1-ETO融合基因能在转基因小鼠的骨髓等组织中表达,但尚不足以引发白血病,推测其他致病基因在小鼠白血病的发生中也起一定作用。     

利用染色质隔离子构建人基质金属蛋白酶-12转基因表达载体

目的：在构建巨噬细胞特异表达且带有染色质隔离子的人基质金属蛋白酶-12（hMMP-12）转基因表达载体的基础上构建hMMP-12转基因兔动物模型。方法：首先通过RT-PCR方法扩增hMMP-12基因．产物亚克隆到pGEM—T载体，测序后获得pGEM—T-hMMP-12，然后利用pJC13构建带有染色质隔离子和清道夫受体A增强子、启动子和人生长激素尾的亚克隆pJC13-SR，再利用pGEM-T-hMMP-12和pJC13-SR重组质粒，构建巨噬细胞特异性的转基因表达载体pJCl3-SR．hMMP-12，最后pJCl3-SR—hMMP-12表达载体线性化，显微注射家兔受精卵制备转基因兔，并进行PCR扩增及Southern Blot转基因效果分析鉴定。结果：（1）通过DNA测序和限制性核酸内切酶酶切鉴定证实，hMMP-12成功克隆到所需表达载体中；（2）转基因后获得仔兔36只，以PCR检测结果计算，转基因总效率为1．4％-3．4％，整合率为20％-50％；以Southern Blot检测结果计算，转基因总效率为0．5％．2．2％，整合率为13％～17％。结论：转基图表达载体的成功构建，为hMMP-12转基因兔动物模型的构建和研究MMP-12在动脉粥样硬化的形成和发展中的作用机制奠定了基础。     

FGF9转基因小鼠的功能及组织表达谱的研究

目的：研究突变昭朋转基因小鼠的功能变化，分析Fgf9及其受体Fgfr3的组织表达谱。方法：采用RT-PCR法克隆彤冈，在该基因296位引入点突变为（G→A）后插入pcDNA3．1（-）B载体，通过显微注射建立转基因小鼠；利用PCR法鉴定转基因小鼠基因型，RT-PCR及免疫组化鉴定转基因小鼠内源性Fgf9和Fgfr3的组织表达谱。结果：建立了12个系的转基因小鼠模型，虽未检测到转入基因的表达，但检测到内源性Vgf9和Fgfr3在心、脑、肾、肌肉和骨关节等组织中的表达情况。结论：获得rgf9和Fgfr3组织表达谱及在不同时期小鼠骨关节中的表达情况；推测转入基因未表达与FGF9转入后被沉默或抑制有关，为此正在建立特异点突变FGF9基因敲入小鼠模型。     

人bcl-xl转基因小鼠外源基因的复制及其传代稳定性

背景：近年的研究表明。在脑缺血再灌注损伤机制中，bcl-xl基因可能起着抗神经细胞凋亡的脑保护作用。 目的：观察转bcl-xl基因小鼠外源基因的复制及传代稳定性问题。 设计：以基因为观察对象。 单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科和湖北省农科院畜牧兽医研究所。 材料：实验于1999-10／2001-04在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。选取昆明种小鼠4只。 方法：通过显微注射法建立转人bcl-xl基因小鼠，将PCR及Southem-blot检测整合阳性的小鼠与正常鼠交配并传代，然后检测子代小鼠外源基因的表达情况。作Southern-blot检测，结果证实第10，13，5，6号小鼠为整合阳性小鼠。以4只整合阳性小鼠作为首建者，分别与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代，所生子代记为F1代，各系列的Fl～F4代均采用阳性转基因小鼠与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代方法，保持其杂合子形式。主要观察指标：检测外源基因的复制和传代的稳定性。 结果：10号小鼠传代过程中外源基因PCR检测阳性率保持稳定，符合盂德尔遗传规律，表明外源基因能够稳定遗传。6号小鼠PCR阳性率呈轻微下降趋势，但仍能够保持相对稳定遗传。13号和5号小鼠PCR阳性率均呈明显的下降趋势，表明这2只小鼠存在外源基因遗传丢失现象。 结论：应用基因组DNA做目的基因，可获得能够稳定遗传的转基因鼠系。     

Dysbindin转基因小鼠心肌肥厚模型中基因变化

目的 探讨Dysbindin转基因小鼠不同心肌肥厚模型心肌肥厚标志基因的表达。方法 构建cTNT-Dysbindin-IRES-EGFP-polyA质粒,受精卵原核显微注射C57BL/6小鼠,建立Dysbindin转基因小鼠。采用异丙肾上腺素（Isoproternol,ISO）和胸主动脉缩窄（Thoracic aorta constriction,TAC）诱导心肌肥厚。造模结束,称取小鼠体重、心脏重量,计算心脏重量指数（HW/BW）;采用qRT-PCR检测心肌肥厚标志基因表达。结果 应用PCR扩增产物和GFP阳性验证Dysbindin转基因小鼠特异性表达在心肌。ISO组和TAC组转基因小鼠和野生型小鼠的HW/BW和心肌肥厚标志基因升高,与野生型小鼠比较,转基因小鼠心房利钠肽（ANP）和-肌球蛋白重链（-MHC）基因表达水平降低。结论 Dysbindin转基因小鼠对于ISO和TAC诱导心肌肥厚有减轻作用,ANP和-MHC降低优于脑钠钛（BNP）。     

精子载体介导的人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达

利用精子载体技术通过人工授精观察人凝血因子Ⅷ基因在转基因小鼠体内的表达，将含有人FⅧBD（B-domain deleted)cDNA的质粒pRC/RSV-hFⅧBDl转染至小鼠精子，通过人工授精使母鼠受孕，新生小鼠出生后第4周，应用PCR筛查hFⅧBDcDNA阳性转基因幼鼠，取转有人FⅧBDcDNA幼鼠的血液检测血浆中的人FⅧ抗原和抗体，分别用Northern印迹和Western印迹检测脾，肝，肺和肾组织中人FⅧBDcDNA的转录和表达。结果发现，人工授精后20只受体母鼠7只受孕，共产下11只仔鼠，存活9只，PCR筛检出3只转有人FⅧBDcDNA的阳性鼠，3只阳性鼠血浆中的人FⅧ抗原量分别为8.65ng/ml,7.84ng/ml和8.44ng/ml，人FⅧ的抗体均为阴性。Northern印迹和Western印迹检测显示3只F1代阳性幼鼠的脾，肝，肺和肾组织中均有人FⅧBDcDNA的转录和表达。结论提示，利用精子载体法可以制备转有人凝血因子Ⅷ基因的转基因小鼠，并表达人FⅧ蛋白，这为用精子载体技术生产转基因动物并将之作为生物反应器生产人凝血因子Ⅷ提供了实验依据。     

NUP98-HOXA9融合基因转基因小鼠的建立及乙烷亚硝基脲诱变的研究

目的从整体动物水平阐明NUP98 HOXA9融合蛋白在白血病发病机制中的作用。方法采用分子克隆技术构建含有NUP98 HOXA9的转基因质粒 ,经显微注射建立含有该融合基因的转基因小鼠 ,并对其细胞表型进行分析 ;采用PCR、RT PCR等技术进行转基因整合和表达检测 ;对表型正常的转基因小鼠用乙烷亚硝基脲 (ENU)诱变 ,观察转基因小鼠的表型变化。结果 5个单系的转基因小鼠在骨髓细胞中检出NUP98 HOXA9融合基因的稳定表达 ,但血常规、骨髓象及肝、脾等未见异常改变。ENU诱变后部分转基因阳性小鼠出现类似人类慢性髓系白血病的表现。结论NUP98 HOXA9融合基因产物能在转基因小鼠中表达 ,但不足以诱发白血病 ;ENU诱变结果提示转基因小鼠对ENU造成的第二次打击可提高白血病的易感性     

乙型肝炎病毒转基因小鼠中外源基因整合的检测

目的了解乙型肝炎病毒DNA序列在乙型肝炎病毒转基因小鼠中的整合情况。方法用头尾相接的乙型肝炎病毒全序列基因,通过原核显微注射法产生转基因小鼠,用C区特异性引物扩增鼠尾DNA检测整合,对其中10只阳性鼠的扩增产物测序。结果128只仔鼠中,14只整合阳性。对10只阳性鼠测序,9只与所转基因序列完全相同,1只在1739、1740位缺失两个碱基。结论外源乙型肝炎病毒基因确定整合至小鼠基因组,多数为正常整合,但也存在缺失整合。     

MYCN转基因斑马鱼对造血调控因子的影响

目的:通过热激活启动子条件性过表达鼠源性MYCN基因,建立生殖系稳定转染的斑马鱼系,以研究MYCN基因对造血调控因子转录的影响。方法:构建携绿色荧光蛋白"报告基因"的MYCN质粒,显微注射到斑马鱼胚胎单细胞期,通过荧光筛选出F0代,继而建立生殖系稳定转染的转基因鱼系。通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative PCR,RFQ-PCR)及血涂片论证MYCN基因的过表达及其对造血调控因子的影响。结果:在256条嵌合表达的性成熟F0代斑马鱼中,鉴定发现有18条(7.0%)显示转基因阳性,其中雄鱼8条,雌鱼10条。同时,RFQ-PCR及外周血涂片均显示,转基因斑马鱼F1和F2代均发生明显的造血分化障碍,造血关键调控因子scl、mpo、gata1基因表达量明显下降。结论:斑马鱼在基因研究中具有直观及规模化优势,特别适用于单一基因的研究,MYCN基因产物可显著抑制红系生成和造血分化。     

人bcl-xl转基因小鼠外源基因的复制及其传代稳定性

背景:近年的研究表明,在脑缺血再灌注损伤机制中,bcl-xl基因可能起着抗神经细胞凋亡的脑保护作用。目的:观察转bcl-xl基因小鼠外源基因的复制及传代稳定性问题。设计:以基因为观察对象。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院神经科和湖北省农科院畜牧兽医研究所。材料:实验于1999-10/2001-04在华中科技大学同济医学院附属同济医院完成。选取昆明种小鼠4只。方法:通过显微注射法建立转人bcl-xl基因小鼠,将PCR及Southern-blot检测整合阳性的小鼠与正常鼠交配并传代,然后检测子代小鼠外源基因的表达情况。作Southern-blot检测,结果证实第10,13,5,6号小鼠为整合阳性小鼠。以4只整合阳性小鼠作为首建者,分别与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代,所生子代记为F1代,各系列的F1～F4代均采用阳性转基因小鼠与正常的昆明白小鼠交配繁殖传代方法,保持其杂合子形式。主要观察指标:检测外源基因的复制和传代的稳定性。结果:10号小鼠传代过程中外源基因PCR检测阳性率保持稳定,符合孟德尔遗传规律,表明外源基因能够稳定遗传。6号小鼠PCR阳性率呈轻微下降趋势,但仍能够保持相对稳定遗传。13号和5号小鼠PCR阳性率均呈明显的下降趋势,表明这2只小鼠存在外源基因遗传丢失现象。结论:应用基因组DNA做目的基因,可获得能够稳定遗传的转基因鼠系。     

载脂蛋白转基因小鼠的研究进展

转基因小鼠是当代生命科学尖端技术之一，也是研究基因结构与功能之间的关系等问题最有产的实验体系之一。本文综述了转脂蛋白转基因小鼠的制备方法，载脂蛋白转基因小鼠在脂质代谢异常和动脉粥样硬化病因和发病机理研究中的应用。     

猪苓多糖对HBV转基因小鼠HBsAg表达的影响

目的：探讨乙型肝炎病毒转基因小鼠在抗病毒免疫调节剂研究中的应用价值。方法：ＨＢＶ转基因小鼠腹腔注射猪苓多糖０．２５ｍｇ／只,隔日一次,连续治疗２０天,用ＥＬＩＳＡ的方法检测小鼠血清ＨＢｓＡｇ,Ｎ ｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ方法检测肝组织中ＨＢＶｍＲＮＡ。结果：用药组小鼠血甭ＨＢｓＡｇ水平明显降低,肝组织中的ＨＢＶｍＲＮＡ明显减少,结论：猪苓多糖对ＨＢＶ转基因小鼠中ＨＢｓＡｇ的表达有一定抑制作用,ＨＢＶ     

TEC启动子介导BCR/ABL基因在BaF3细胞中的表达

转P210bcr/abl基因小鼠是研究慢性髓系白血病的理想模型,但广泛表达的启动子容易引起转基因小鼠的胚胎致死,所以应用在造血细胞中特异表达的启动子是成功建立转P210bcr/abl基因小鼠模型的关键。本研究探讨TEC启动子介导BCR/ABL基因在BF3细胞中的表达。从小鼠的基因组中克隆TEC启动子的-364至+22区域,并替换掉IRES2-eGFP载体的CMVie启动子,同时在该载体的EcorⅠ酶切位点插入7.2 kb的P210bcr/abl基因,再将构建好的载体分别转染BaF3细胞和293细胞,观察eGFP基因与P210bcr/abl基因在2种细胞中的表达情况。结果通过荧光显微镜和流式细胞仪检测发现,eGFP基因在BaF3细胞成功表达,表达率在转染后6、24、72 h分别为7.10%、23.35%和64.61%,而在293细胞中未见eG FP基因表达。RT-PCR在BaF3细胞中扩增出BCR/ABL mRNA中372 bp的片段,而在293细胞中未扩增出任何片段。结论:TEC启动子的-364至+22区域能介导相关基因在造血细胞中高效特异性表达,适合于构建转P210bcr/abl基因小鼠模型。     

NUP98-PMX1转基因小鼠发生髓系白血病样表型

目的　在整体动物水平研究NUP98 PMX1融合蛋白的致白血病作用。方法　采用分子克隆技术构建含有NUP98 PMX1的转基因质粒 ,显微注射法建立转NUP98 PMX1基因的小鼠 ,以PCR、RT PCR方法检测融合基因的表达 ;用流式细胞仪检测骨髓细胞表型。结果　转染NUP98 PMX1融合基因的NIH3T3细胞生长加快 ,软琼脂上可形成集落 ,并使裸鼠致瘤。出现病态的 8只NUP98 PMX1转基因小鼠中有 4只发生粒细胞白血病样表型 ,其中 3只表现为人类慢性髓系白血病样表型。结论　NUP98 PMX1融合基因具有致瘤性 ,其表达在髓系白血病的发生中起着极为重要的作用。     

载脂蛋白转基因小鼠的研究进展

转基因小鼠是当代生命科学尖端技术之一，也是研究基因结构与功能之间的关系等问题最有效的实验体系之一。本文综述了载脂蛋白转基因小鼠的制备方法，载脂蛋白转基因小鼠在脂质代谢异常和动脉粥样硬化病因和发病机理研究中的应用。     

阿尔茨海默病APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠脑区中老年斑的分布

目的:观察老年斑在不同月龄的APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠脑区中的分布。方法:将雄性的杂合子小鼠与C57BL/6J雌鼠交配,所生的小鼠提取鼠尾DNA,PCR扩增目的基因。取鉴定为阳性的2.5、4.5、8月龄的杂和子小鼠各3只,进行Thioflavine S和Aβ免疫组织化学染色,观察老年斑的沉积。结果:共生产小鼠F1代39只,鉴定为阳性的有17只,阳性率为43.6%。组织学染色发现2.5月龄小鼠的脑区未见老年斑沉积,而4.5月龄及8月龄小鼠的皮质及海马可见老年斑沉积,并且随着月龄的增加,老年斑的数目增多,面积增大。结论:APP-swe/PS1ΔE9双转基因小鼠在4月龄时已有老年斑的沉积,为研究AD提供了很好的载体。     

阿尔茨海默病APPswe/PS1△E9双转基因小鼠脑区中老年斑的分布

目的:观察老年斑在不同月龄的APPswe/PS1△E9双转基因小鼠脑区中的分布.方法:将雄性的杂合子小鼠与C57BL/6J雌鼠交配,所生的小鼠提取鼠尾DNA,PCR扩增目的基因.取鉴定为阳性的2.5、4.5、8月龄的杂和子小鼠各3只,进行Thioflavine S和Aβ免疫组织化学染色,观察老年斑的沉积.结果:共生产小鼠F1代39只,鉴定为阳性的有17只,阳性率为43.6%.组织学染色发现2.5月龄小鼠的脑区未见老年斑沉积,而4.5月龄及8月龄小鼠的皮质及海马可见老年斑沉积,并且随着月龄的增加,老年斑的数目增多,面积增大.结论:APP-swe/PS1△E9双转基因小鼠在4月龄时已有老年斑的沉积,为研究AD提供了很好的载体.