转染人TGF-β1基因对大鼠系膜细胞基质表达的影响

目的通过对大鼠系膜细胞(MsC)转染人TGF-β1基因，观察该基因对MsC表达细胞外基质成分的影响。方法采用脂质体介导法转染人TGF-β1基因至大鼠MsC，Western blot法鉴定；细胞爬片ABC免疫酶标法观察纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原、Ⅰ型胶原、层黏蛋白(LM)的表达，并对结果定量分析。结果重组质粒pcDNA3．0-TGF-β1成功转染至大鼠MsC，Western blot及免疫组化检测均证实TGF-β1蛋白表达增强；与正常的MsC相比，TGF-β1转染的MsC表达FN、Ⅳ型胶原增强，其差异有显著性意义；而Ⅰ型胶原、LM表达改变不明显。结论TGF-β1可通过对大鼠MsC ECM成分表达的影响，而在肾小球硬化的发生发展过程起着重要作用。     

血管内皮生长因子与转化生长因子的协同作用诱导兔骨髓间充质干细胞分化

目的 研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转化生长因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的协同作用对兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及其可能机制.方法 将细胞分为4组:对照组、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)-VEGF组、AAV-TGF-β1组和VEGF+ TGF-β1组.穿刺法抽取兔骨髓液,分离培养原代BMSCs,分别构建AAV-VEGF和AAV-TGF-β1腺病毒载体转染BMSCs,Western blot检测各组细胞中VEGF、TGF-β1的蛋白表达.流式细胞术检测细胞凋亡情况,CCK8法检测细胞增殖能力,Western blot检测髓核细胞标志SOX-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达,以及P38MAPK信号通路相关蛋白P38、MAPKAPK2和HSP27的表达.加入P38MAPK的特异阻滞剂SB203580预处理BMSCs,检测VEGF和TGF-β1对BMSCs增殖、凋亡、分化及相关蛋白表达的影响.结果 VEGF和TGF-β1可通过调节P38MAPK信号通路抑制BMSCs凋亡,促进BMSCs增殖,并向类髓核细胞分化,且在其协同作用下效果显著.抑制P38MAPK信号通路可反转VEGF和TGF-β1对BMSCs增殖分化能力的促进作用.结论 VEGF和TGF-β1的协同作用能增强BMSCs增殖和分化的能力,提高胶原蛋白和蛋白聚糖等细胞外基质的表达,从而促进退变椎间盘的修复和再生.     

重组hCDMP1腺病毒转染骨髓间充质干细胞对其向软骨分化的影响

目的探讨人软骨源性形态发生蛋白1(CDMP1)基因转染对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用腺病毒转染方法将重组人CDMP1(hCDMP1)基因转入体外培养的兔BMSCs,用免疫印迹法(Western blot)检测hCDMP1蛋白质的表达,并通过检测细胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)以及蛋白多糖的表达,分析转染hCDMP1对BMsCs增殖、分化的影响。结果 hCDMP1蛋白在基因转染细胞内得到正确表达;hCDMP1基因转染组和对照组相比,ColⅡ、蛋白多糖表达水平显著增高(P<0.05),而细胞增殖能力无明显变化(P>0.05)。结论外源基因转染可以使BMSCs表达有生物活性的hC-DMP1,高表达的hCDMP1可以促进BMSCs向软骨表型分化,但对细胞增殖无明显影响。     

脂质体介导转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的 脂质体介导TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞(MSC)，研究对MSC成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法 以梯度离心结合换液法获得并纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)，采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1转染MSCs，Rr-PCR和Western blot鉴定后，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原(ColⅡ)、纤维连接蛋白(FIN)的表达行RT-PCR和Western blot检测。结果 获得纯度较高的成年中国小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)；脂质体为介导将全长人TGF-β1目的基因导入MSC，经RT-PCR和Western blot鉴定转染成功，转染后的MSC较未转染MSC成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、FNmRNA和蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

鹿茸Ⅰ型胶原对骨髓间充质干细胞增殖的影响及其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系

目的：观察鹿茸Ⅰ型胶原（VACTⅠ）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及细胞周期的影响，探讨其与Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达的关系。方法：选取健康雄性4周龄SD大鼠，差时贴壁法提取BMSCs并传代培养。实验分为空白对照组、转化生长因子β3（TGF-β3）（10μg·L^-1）组和不同浓度（1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 g ·L^-1）VACTⅠ组，CCK-8法检测各组BMSCs增殖率，ELISA法检测各组细胞上清液中骨形态生成蛋白4（BMP-4）和转录因子Sox9水平，流式细胞术检测各组不同细胞周期BMSCs百分率，RT-PCR法和Western blotting法分别检测各组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA和蛋白表达水平。结果：与空白对照组比较，2.50~20.00 g·L^-1 VACTⅠ组大鼠BMSCs增殖率明显降低（P<0.05或P<0.01）；ELISA法，与空白对照组比较，TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞上清液中BMP-4和Sox9水平明显升高（P<0.05或P<0.01）；流式细胞术，与空白对照组比较，TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组不同细胞周期BMSCs百分率差异无统计学意义（P>0.05）；RT-PCR法，与空白对照组比较，TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达水平明显升高（P<0.05）；Western blotting法，与空白对照组比较，TGF-β3组和不同浓度VACTⅠ组细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。结论：VACTⅠ可促进BMSCs释放BMP-4和Sox9，提高Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖表达水平，抑制BMSCs增殖，是一种潜在的成软骨分化诱导剂。     

可溶性转化生长因子βⅡ型受体对LOVO细胞体外增殖和抗肿瘤免疫的影响

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体细胞外区(sTGF-βRⅡ)基因的真核表达载体,初步探讨sTGF-βRⅡ对大肠癌LOVO细胞增殖及抗肿瘤免疫的影响。方法:采用DNA重组技术构建sTGF-βRⅡ的表达载体,用脂质体转染技术转染人大肠癌LOVO细胞,以RT-PCR、Western blot法检测目的基因及其蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和平板法集落形成实验检测sTGF-βRⅡ对LOVO细胞增殖的影响。用淋巴细胞提取液提取外周血淋巴细胞,并与转染了sTGF-βRⅡ的大肠癌LOVO细胞共同培养,用流式细胞仪检测各实验对照组T淋巴细胞亚群的表达。结果:sTGF-βRⅡ在LOVO细胞中获得表达,sTGF-βRⅡ可抑制TGF-β1作用下的LOVO细胞增殖(P<0.01),与淋巴细胞共同培养后的转染组T淋巴细胞亚群的CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞较其它实验组均显著增高(P<0.05)。结论:sTGF-βRⅡ可拮抗TGF-β1的信号传导,抑制TGF-β1作用下的LOVO细胞增殖,进而拮抗TGF-β1的抑制肿瘤免疫作用,使宿主T细胞的抗肿瘤免疫功能得到较大恢复,从而达到抗肿瘤的作用。     

转化生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1对兔退变髓核细胞生物学活性的影响

目的 观察在体外培养条件下转化生长因子-β1(TGF-β1)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对兔退变髓核细胞生物学活性的影响.方法 建立兔腰椎间盘退变模型及体外培养兔退变髓核细胞,台盼蓝染色法测定活细胞率.将每份髓核细胞样本分为空白组、TGF-β1组和TGF-β1+IGF-1组.TGF-β1和IGF-1干预后第0、2、4、6天,采用RT-PCR和Western blot方法测定细胞内Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达. 结果 体外培养兔退变髓核细胞的活细胞率为88%～95%.干预后第4天和第6天TGF-β1+IGF-1组与TGF-β1组、空白组比较细胞聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原均显著增加(P<0.05).结论 TGF-β1和IGF-1能够促进兔退变髓核细胞合成Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖,改善其生物学活性.     

兔骨髓基质干细胞的分离培养和鉴定及转化生长因子β1的基因瞬时转染研究

目的:通过研究兔骨髓基质干细胞(BMSC)的体外获取方法、生物学鉴定以及新型靶向性非病毒载体介导转化生长因子β1(TGF-β1)基因在BMSC中的瞬时转染和表达,为下一步的骨组织工程基因治疗研究奠定基础。方法:取4周龄新西兰大白兔骨髓,通过密度梯度离心法和全骨髓培养法获取BMSC,通过倒置相差显微镜、B rdU标记染色观察其形态学特征和生长状况,免疫组化观察其表面抗原表达情况。固相合成法合成含RGD肽K16GRGDSPC(K16-RGD)。以K16-RGD为载体介导TGF-β1基因转染兔BMSC,免疫组化检测其瞬时转染和表达效率。结果:分离培养的细胞在第10~12代以前生长性状稳定,增殖能力强。免疫组化检测兔BMSC表达CD90、CD44,但不表达CD34、CD45、CD11b和层黏连蛋白Lam in ine。与全血培养法相比较,密度梯度离心法获取的BMSC纯度更高。K16-RGD介导TGF-β1基因瞬时转染效率可达(21.6±4.3)%。结论:分离培养的细胞成分较为单一,具有干细胞特性;TGF-β1基因能在BMSC中转染和表达,为下一步利用BMSC、K16-RGD和TGF-β1基因进行骨组织工程基因治疗研究奠定了基础。     

脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后mRNA及其蛋白的表达.方法 采用脂质体介导的真核细胞转染技术,将含hBMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化及免疫印迹法(Western blot)等手段检测转染后hBMP-2 mRNA及其蛋白的表达.结果 通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔BMSCs,并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实,转染pcDNA3.1-hBMP-2 后的兔BMSCs内有大量hBMP-2 mRNA 的转录和蛋白的表达.结论 通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转染BMSCs,并使其获得较为稳定的表达.     

微小RNA-23a调控大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化的实验研究

目的:研究微小RNA-23a(microRNA-23a,miR-23a)调控大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的作用和分子机制。方法:分离大鼠BMSCs并转染miR-23a基因后,通过RT-PCR和番红O染色法检测miR-23a调控大鼠BMSCs成软骨分化的作用,并进一步利用Western blot研究番红O调控BMSCs成软骨分化的分子机制。结果:转染miR-23a组和未转染组相比,成软骨分化相关基因如Sox9、二型胶原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)发生明显上调,而软骨肥大相关基因十型胶原(CollagenⅩ)表达发生下调。番红O染色显示转染miR-23a组和未转染组相比,硫酸软骨素表达亦发生明显上调。Western blot检测显示转染miR-23a能明显促进大鼠BMSCs的Sox9蛋白表达而抑制其Runx2蛋白表达。结论:miR-23a可能通过上调Sox9表达及抑制Runx2表达来达到促进BMSCs成软骨分化并抑制其进一步肥大的作用。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的:寻找良好的软骨组织工程种子细胞.方法:抽取兔骨髓液,分离纯化骨髓液中的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)并传代扩增.将第3代BMSCs分成实验组和对照组,实验组用10%胎牛血清的LG-DMEM培养液加入转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和地塞米松联合诱导,对照组用10%胎牛血清的LG-DMEM培养液自然分化.在诱导4、7、14 d后,分别用甲苯胺蓝染色检测细胞蛋白多糖的表达,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测细胞Ⅱ型胶原的表达并计算阳性率.结果:BMSCs取材方便,体外培养生长稳定,细胞活性好.实验组BMSCs向软骨细胞分化,细胞甲苯胺蓝染色异染,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性率(72.51±9.49)%与对照组(2.15±1.88)%相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:BMSCs是软骨组织工程良好的种子细胞.     

Peroxiredoxin-1基因沉默对转化生长因子β1促进肺成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的影响

目的 探讨Peroxiredoxin-1 (Prx-1)基因沉默对转化生长因子β1(TGF-β1)促进肺成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原的影响及其作用机制.方法 体外培养肺成纤维细胞分为4组:对照组(0.4％血清),TGF-β1组(5 μg/L),TGF-β1+阴性转染组(5μg/L TGF-β1+阴性对照siRNA),TGF-β1+ Prx-1 siRNA转染组(5 μg/L TGF-β1 +Prx-1 siRNA).利用脂质体Lipo2000将阴性对照siRNA和Prx-1 siRNA分别转染到TGF-β1+阴性转染组和TGF-β1+Prx-1 siRNA转染组的肺成纤维细胞中,转染48 h后用于后续实验.实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测转染后各组的Prx-1 mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷酸化Akt(p-Akt)及Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白水平,2,7-二氯荧光素二乙酸检测活性氧(ROS)水平.结果 (1) Prx-1 siRNA转染肺成纤维细胞后,TGF-β1+ Prx-1 siRNA转染组的Prx-1 mRNA表达明显降低.(2)与对照组比较,TGF-β1组Ⅰ和Ⅲ型胶原、ROS及pAkt蛋白水平均明显增加(0.34±0.06 vs.0.58±0.06、0.42±0.05 vs.0.56±0.06、2 988±379 vs.4 315±580和0.29±0.05 vs.0.66±0.07,差异有统计学意义(P＜0.05).与TGF-β1组比较,TGF-β1+阴性转染组Ⅰ和Ⅲ型胶原、ROS及p-Akt水平无明显变化(P＞0.05),但TGF-β1+ Prx-1 siRNA转染组Ⅰ和Ⅲ型胶原、ROS及p-Akt蛋白水平均进一步增高(0.58±0.06 vs.0.79±0.09、0.56±0.06 vs.0.77±0.08、4 315±580 vs.5 841±782和0.66±0.07 vs.0.93±0.15,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TGF-β1能够诱导肺成纤维细胞生成ROS,并由此促进Akt的激活和肺成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原;而沉默Prx-1基因可激活ROS/Akt通路,从而有助于TGF-β1促进肺成纤维细胞合成胶原.     

TGF-β1/Smads信号通路在SIRT1抗心肌纤维化中的作用及机制研究

目的 观察沉默信息调节因子1(sirtuin 1,SIRT1)对压力超负荷致大鼠心肌纤维化及血管紧张素Ⅱ(angiotensin, AngⅡ)诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响,并探讨其分子机制。方法 在体实验通过不完全结扎大鼠腹主动脉,使压力负荷增加诱导心肌纤维化,给予SIRT1激活剂后,左室心肌组织行Masson染色,观察心肌间质纤维化并计算胶原容积分数,免疫组化染色检测心肌组织TGF-β1/Smads蛋白表达。提取新生大鼠心脏成纤维细胞,给予AngⅡ或AngⅡ加SIRT1激活剂后,采用MTT法检测细胞增殖,qRT-PCR和Western blot法检测心肌组织及成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原(collagenⅠ/Ⅲ,Col1α1/3α1)、SIRT1及TGF-β1/Smads mRNA及蛋白的表达。结果 与假手术组相比,压力超负荷模型组大鼠心肌间质出现显著的纤维化,心肌胶原容积分数增加,Col1α1/3α1、TGF-β1/Smads表达明显增多,SIRT1表达减少;给予SIRT1激活剂SRT1720干预后可改善压力超负荷诱导的心肌间质纤维化,下调Col1α1/3α1、TGF-β1/Sm...     

高表达PTEN抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化

目的 研究PTEN高表达对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的抑制及其信号传导机制.方法 脂质体介导含人全长PTEN基因或空载体转染人肾小管上皮细胞(HKC细胞)48 h,倒置荧光显微镜检测PTEN转染组及空载体转染组绿色荧光蛋白表达;Western blot检测正常组、PTEN转染组、空载体转染组中PTEN蛋白表达;RT-PCR检测3组中PTEN mRNA表达.然后将实验分为正常组、TGF-β1刺激组(给予TGF-β1刺激)、PTEN+TGF-β1组(PTEN基因转染后给予TGF-β1刺激)、空载体+TGF-β1组(空载体转染后给予TGF-β1刺激),Western blot检测各组细胞E-cad-herin、α-SMA、Akt、p-Akt表达水平.结果 FTEN基因及空载体转染HKC细胞48 h后可见明显绿色荧光蛋白表达;PTEN转染组PTEN蛋白及PTEN mRNA表达较正常组及空载体转染组细胞均显著上升(均P<0.05).在正常组、TGF-β1刺激组、PTEN+TGF-β1组、空载体+TGF-β1组中,TGF-β1刺激组及空载体+TGF-β1组较正常组E-cadherin表达明显下降(均P<0.05),而a-SMA及p-Akt表达显著上升(均P<0.05);PTEN+TGF-β1组较TGF-β1刺激组及空载体+TGF-β1组a-SMA及p-Akt表达明显下降(均P<0.05).而E-cadherin表达上升(均P<0.05);各组细胞Akt表达水平差异不明显(P>0.05).结论 PTEN通过阻止PI3K/Akt通路活化而抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化.     

沉默Rho GDIα抑制矽肺上皮间质转化及其作用机制

目的探讨沉默Rho GDP解离抑制因子α(Rho GDP dissociation inhibitorα,Rho GDIα)对矽肺上皮间质转化的作用及机制。方法转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549,分为空载体慢病毒组(LEV)、沉默Rho GDIα慢病毒感染组(Lv-Rho GDIα-inhibition)、TGF-β1诱导LEV组(LEV+TGF-β1)、TGF-β1诱导Lv-Rho GDIα-inhibition组(Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1)。采用Western blot法、免疫细胞化学染色检测Rho GDIα、RhoA、Rho激酶(Rho kinase,ROCK)、E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和I型胶原(collagen-I)蛋白表达,采用Western blot法及CCK-8检测细胞增殖能力。结果 Western blot法及免疫细胞化学染色结果显示,与LEV对照组相比,Lv-Rho GDIα-inhibition组Rho GDIα、RhoA、ROCK蛋白表达下降,E-cad蛋白表达上调,α-SMA和collagen-I蛋白表达下降; LEV+TGF-β1组Rho GDIα、RhoA、ROCK蛋白表达上升,E-cad蛋白表达下调,α-SMA和collagen-I蛋白表达上升。与LEV+TGF-β1组相比,Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1组Rho GDIα、RhoA、ROCK蛋白表达下降,E-cad蛋白表达上调,α-SMA和collagen-I蛋白表达下降。CCK-8及cyclin D1蛋白检测结果显示,与LEV对照组相比,Lv-Rho GDIα-inhibition组细胞增殖受到抑制,LEV+TGF-β1组细胞增殖增强,与LEV+TGF-β1组相比,Lv-Rho GDIα-inhibition+TGF-β1组细胞增殖受到抑制。结论沉默Rho GDIα可通过调控RhoA/ROCK信号通路抑制上皮间质转化发挥抗矽肺纤维化作用。     

炎性微环境下TGF-β1通过TGF-β1/Smad3 通路促进BMSCs成骨分化

目的 研究炎性微环境下转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响及作用机制。方法 应用肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)体外模拟炎性微环境,检测不同浓度TGF-β1对BMSC增殖活性的影响。实验分为对照组[BMSC+成骨诱导液(osteogenic medium,OM)]、实验组(BMSC+TGF-β1+OM)和抑制组[BMSC+SB431542 (TGF-β1拮抗剂)+OM]。应用ALP染色、茜素红染色、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)及Western blot法对BMSCs成骨分化能力和TGF-β信号通路因子Smad2、Smad3进行检测并比较3组间的差异。结果 低浓度TGF-β1作用下BMSCs增殖活性较高,高浓度(50ng/ml)抑制BMSCs增殖活性;成骨诱导7天和10天时,实验组与其他两组比较,ALP染色较深、面积最大;茜素红染色结果显示,实验组体外矿化结节形成均高于其他两组;RT-qPCR检测结果显示,实验组成骨分化基因OPN、RUNX2与ALP表达均增高,TGF-β信号通路中Smad3在实验组表达最高,抑制组表达最低,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot法检测结果显示,实验组内OPN、RUNX2与ALP蛋白表达水平增高,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β信号通路中Smad3蛋白表达在3组中差异不明显,而p-Smad3在实验组中表达明显增高、抑制组中明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 炎性微环境中TGF-β1通过激活TGF-β/Smad3信号通路促进了BMSCs成骨分化。     

脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

转化生长因子β1对L929细胞增殖转分化及细胞外基质代谢的影响

目的 探讨转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对L929细胞增殖的影响,为体外研究预防食管内镜黏膜下剥离术(endoscopic submucosal dissection,ESD)术后狭窄提供理论基础.方法 实验分为两组,①空白对照组:L929细胞不做处理;②TGF-β1组,用10 ng/mL TGF-β1 持续刺激L929细胞,依据刺激时间不同又分为24、48、72、96、120 h 5个亚组.观察各组对细胞增殖的影响.用CCK-8法检测细胞增殖,qPCR检测α-SMA及Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原、MMP1、TIMP1 mRNA 表达,Western blot检测α-SMA、MMP1、TIMP1蛋白水平,ELISA检测Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原合成.结果 与空白对照组比较,TGF-β1组细胞增殖能力显著增高(P＜0.05),TGF-β1组α-SMA、Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原、MMP1、TIMP1 mRNA表达均显著升高(P＜0.05);TGF-β1刺激24 h组Ⅰ型前胶原合成增加(P＜0.05),TGF-β1组Ⅲ型前胶原合成增加(P＜0.05);TGF-β1组MMP1、TIMP1蛋白表达增加(P＜0.05).结论 TGF-β1能促进L929细胞增殖,并诱导L929细胞向肌成纤维细胞转分化,同时促进Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原以及MMP1、TIMP1合成.     

糜酶抑制剂在体外对肝星状细胞增殖及肝纤维化相关基因表达的影响

[目的]探讨糜酶抑制剂(Chy-I)在体外对肝星状细胞(HSC)增殖及肝纤维化相关基因表达的影响及作用机制.[方法]取HSC-T6细胞,分为对照组(DMEM)、模型组(TGF-β1)和Chy-I大、中、小剂量(TGF-β1+100 g/L Chy-I,TGF-β1+10 g/L Chy-I,TGF-β1+1 g/L Chy-I)组,检测Chy-I对HSC-T6细胞的增殖抑制率,采用Western blot法检测纤维化相关因子α-SMA及TGF-β1蛋白表达水平,应用实时定量PCR法检测α-SMA及I型胶原mRNA的表达情况.[结果]与模型组比较,Chy-I各剂量组HSC-T6细胞增殖明显受到抑制(P<0.05,P<0.01),且呈剂量依赖性;Western blot法检测结果显示,与模型组比较,Chy-I各剂量组HSC-T6细胞中α-SMA及TGF-β1蛋白表达明显受到抑制,亦呈剂量依赖性,Chy-I各组HSC-T6细胞内α-SMA及I型胶原mRNA表达水平明显降低.[结论] Chy-I在体外对HSC发挥抗肝纤维化作用,其机制认为可能与抑制HSC增殖水平及肝纤维化相关因子的表达有关系.     

骨髓干细胞动员抑制TGF-β非经典通路对抗大鼠心肌纤维化的研究

  目的  探讨骨髓干细胞动员抑制大鼠心肌纤维化的机制与转化生长因子（TGF-β）介导的非经典通路的关系。  方法  22只Wistar大鼠通过皮下注射异丙肾上腺素（isoproterenol,Iso)建立心肌纤维化模型后,随机分为对照组（Con组）和动员组（GT组）,GT组大鼠皮下注射重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF),连续注射5 d,对照组同期皮下注射生理盐水。末次注射4周后,行HE和Masson染色观察两组大鼠心肌结构,ELISA法检测血清B型利钠肽（BNP）质量浓度,免疫组化染色观察心肌组织中Ⅲ型胶原表达,Western blot检测组织Ⅰ型胶原、TGF-β、转化生长因子激酶1( TAK1 )、丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的蛋白水平。  结果  与对照组相比,GT组大鼠血清BNP质量浓度降低(P<0.01);Masson染色胶原沉积减少,胶原面积比值下降(P<0.01);Western blot检测Ⅰ型胶原、TGF-β、TAK1、MKK3、p38MAPK表达较对照组均降低（P<0.05）。  结论  骨髓干细胞动员可改善大鼠心肌纤维化的程度,这种抗心肌纤维化的作用与抑制TGF-β/TAK1/MKK/p38MAPK通路有关。