宫颈组织中脆性组氨酸三联体基因和凋亡抑制蛋白的表达及临床意义

目的研究脆性组氨酸三联体基因（FHIT）蛋白和凋亡抑制蛋白（survivin）在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达情况,探讨两者在宫颈癌早期诊断和发生发展中的临床意义。方法采用免疫组织化学sP法检测20例正常宫颈组织;20例宫颈CINI级、25例CINⅡ／Ⅲ级;60例宫颈癌组织中的FHIT蛋白和凋亡抑制蛋白的表达。结果FHIT蛋白在正常宫颈组、宫颈CIN组、CINⅠ组、CINⅡ／Ⅲ组和宫颈癌组中的阴性率分别为0％（0／20）、24．4％（11／45）、10．0％（2／20）、36．0％（9／25）和66．7％（40／60）,各组间阴性率比较差异有统计学意义（P〈0．05）;凋亡抑制蛋白在正常宫颈组织、宫颈CIN组、宫颈癌组中的阳性率分别是20．0％（4／20）、31．1％（14／45）和95．0％（57／60）,各组间阳性率比较差异有统计学意义（P〈0．05）;在宫颈CIN和宫颈癌中,FHIT和凋亡抑制蛋白的表达有一定的相关性（P〈0．05）。结论检测宫颈CIN中的FHIT蛋白表达情况,可用作高级别的CIN筛查或预测。FHIT和凋亡抑制蛋白对于宫颈癌前期病变和宫颈癌的筛查和早期诊断具有一定的临床参考价值。     

DLL4基因对白血病细胞株K562细胞中YY1和c-Myc蛋白表达及细胞增殖的影响

本研究旨在探讨Notch的配体DLL4基因在白血病细胞株K562中对转录因子YY1和原癌基因c-Myc蛋白表达及细胞生长的影响。实验分正常对照组、阴性对照组(转染质粒pBudCE4.1)和实验组(转染质粒pBudCE4.1-DLL4)。转染后48小时,用免疫印迹法和免疫细胞化学法检测外源性DLL4瞬时转染表达水平及YY1和c-Myc蛋白的表达水平;用细胞计数试剂盒-8法检测各组细胞的增殖;转染后48小时用流式细胞仪检测各组细胞的周期分布和凋亡。结果表明,在各组K562细胞中均检测到DLL4、YY1和c-Myc蛋白的表达,实验组的DLL4、YY1和c-Myc蛋白表达量比两个对照组显著增多(p<0.05);实验组K562细胞的生长速度明显低于对照组;实验组较对照组G0/G1期细胞增多(p<0.001),凋亡率增加(p<0.001)。结论:DLL4基因能增加细胞转录因子YY1和原癌基因c-Myc蛋白的表达,诱导细胞生长速度减慢、细胞周期停滞于G0/G1期,并能增高凋亡率增加。     

脉冲电场联合野生型p53基因诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡

背景:在前期研究基础上,设想将基因电转染作为脉冲电场治疗恶性肿瘤的辅助方法。目的:探讨脉冲电场联合抑癌基因野生型p53基因诱导人宫颈癌hela细胞发生凋亡及相互作用。方法:采用空质粒及含有野生型p53的质粒转染Hela细胞得到Hela-vector、Hela-p53细胞,将Hela细胞、Hela-vector和Hela-p53细胞分别施加固定脉宽100μs、频率1Hz、脉冲数8个、电场强度为1500V/cm的脉冲电场处理。结果与结论:相同参数脉冲电场作用于各组细胞12h后,MTT结果显示Hela-p53组细胞吸光度明显低于Hela组(P<0.05);流式细胞仪及RT-PCR检测结果显示Hela-p53组的早期凋亡率和p53mRNA表达较Hela组明显增加;Westernbolt及激光共聚焦显微镜结果显示与Hela组比较,Hela-p53组细胞Bax蛋白表达明显上升,而Bcl-2蛋白则明显下降,Casepase-3相对荧光强度明显增强。表明野生型p53基因对宫颈癌Hela细胞生长有明显的抑制作用,野生型p53基因可以提高脉冲电场诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的作用。     

短发夹RNA诱导survivin基因缄默对Jurkat细胞凋亡和增殖的影响

目的研究应用载体表达短发夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术抑制人 T 淋巴细胞白血病细胞株 Jurkat 细胞 survivin 基因的表达,探讨 survivin 基因表达缄默对 Jurkat 细胞凋亡和增殖的影响。方法构建针对 survivin 基因的 shRNA 重组质粒并转染至 Jurkat 细胞,分别用多重 PCR和 Western blot 法检测瞬时转染和稳定转染细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白表达水平的变化;流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞凋亡指数的变化,绘制细胞生长曲线,探讨 survivin shRNA 转染对细胞生长和增殖的影响。结果多重 PCR 结果示与无功能(对照组)shRNA 处理组和磷酸盐缓冲液处理组比较,survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞 surivivin 基因 mRNA 表达均显著下降,抑制率分别为66.675% 和60.69%(P<0.05);Western blot 结果显示 survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞survivin 蛋白表达水平亦显著降低,抑制率分别为63.41% 和60.18%(P<0.05)。流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞的凋亡率显著增加,分别为(22.41±2.83)% 和(20.73±2.56)%(与对照组比较,P均<0.05),细胞倍增时间显著延长。生长曲线显示稳定转染细胞的生长显著减慢。结论shRNA 重组质粒介导的 RNA 干扰能明显抑制 Jurkat 细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白产物的表达,诱导细胞凋亡和生长抑制。     

PLK1基因缄默在K562细胞凋亡中的作用

目的观察缄默PLK1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对K562细胞内PLK1表达和细胞凋亡的影响,探讨PLK1在白血病发病中的作用,寻找更为有效的白血病治疗途径。方法设计合成针对PLK1基因1416~1436位点的shRNA片段,并将其克隆于绿色荧光蛋白的表达载体pEGFP-H1中,命名为pEGFP-H1/PLK1。通过电穿孔转染法将其导入K562细胞中,分为对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-H1/PLK1shRNA重组质粒转染组,转染后24,48h,分别通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因和蛋白水平的变化,以MTT方法测各组细胞的增殖活性,比色法检测各组细胞的半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白酶活性,并通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和G2/M期转变情况。结果PLK1mRNA相对水平(与内参的灰度比值)对照组为1.25±0.07,空载体转染24,48h组分别为1.21±0.08和1.23±0.09,shRNA重组质粒转染24,48h组分别为0.52±0.04和0.25±0.02,shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P<0.01)。各组细胞PLK1的蛋白水平变化趋势与PLK1mRNA表达相似。相应地,对照组、空载体转染48h组、shRNA重组质粒转染24,48h组的凋亡率分别为(8.3±0.6)%、(8.7±0.7)%、(49.7±3.8)%和(82.3±6.9)%,后两者与前两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。此外,与对照组和空载体转染组相比,shRNA重组质粒转染组的细胞增殖能力明显下降(P<0.05),且位于G2/M期的细胞较对照组和空载体转染组显著增加。以上结果均于转染后48h时较明显(P<0.05)。结论构建的shRNA能明显抑制转染细胞PLK1的表达和增殖,并可促进转染细胞的凋亡,并使停留于G2/M期的细胞显著增加。     

青蒿素对MCF-7乳腺癌细胞Akt及survivin蛋白表达影响的研究

目的研究青蒿素对MCF-7乳腺癌细胞Akt及survivin蛋白表达的影响。方法体外培养人乳腺癌细胞系MCF-7细胞株,采用MTT法检测青蒿素对细胞的抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡的影响,Western blot分析Akt与survivin蛋白表达的改变,多组均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较用LSD检验。结果青蒿素对MCF-7乳腺癌细胞体外生长具有明显的抑制作用,并呈时间和剂量依赖性;青蒿素对MCF-7细胞出现G0/G1期阻滞;与对照组比较,青蒿素明显抑制Akt与survivin蛋白的表达。结论青蒿素可以通过抑制Akt与survivin蛋白表达及对细胞周期的影响而诱导乳腺癌细胞的凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的探讨生存素反义寡核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞SGC7901凋亡的诱导作用。方法设计合成特异性靶向survivin ASODN。胃癌细胞株SGC901分为4组：空白对照组（Sham）、单纯脂质体对照组（Lip）、正义链转染对照组（LipSODN）、ASODN转染组（Lip-AKSODN）。作用12、24、48h后收获各组细胞。Westernblot法检测各组细胞survivin表达情况,倒置显微镜观察细胞生长形态变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中Ki67表达。结果脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞出现survivin蛋白表达明显下降;形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、凋亡小体形成;细胞凋亡率明显高于各对照组（P〈0．05）;细胞中Ki67表达水平明显降低。结论survivin反义寡核苷酸转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。     

高危型人乳头瘤病毒E2在宫颈癌中的表达及其生物学意义

目的探讨高危型人乳头瘤病毒(HPV)E2在宫颈癌中的表达及其生物学意义。方法采用基因芯片技术对56例宫颈炎性组织、55例宫颈上皮内瘤变(CIN)组织、58例宫颈鳞癌组织进行HPV分型检测;免疫印迹技术对宫颈组织中高危型HPV E2蛋白表达水平的检测;流式细胞技术进行宫颈癌细胞凋亡的检测及Transwell试验进行细胞侵袭能力的检测。结果基因芯片技术结果显示,与宫颈炎性组比较,宫颈鳞癌组的HPV16、HPV18感染阳性率明显增高,而CIN组的HPV16、HPV18感染阳性率无明显变化。免疫印迹结果显示,与宫颈炎性组比较,宫颈鳞癌组高危型HPV E2蛋白的水平明显降低,而CIN组中HPV E2蛋白水平无明显变化。与空载体组比较,高危型HPV E2质粒组宫颈癌细胞凋亡率明显增加,宫颈癌细胞侵袭能力明显下降。结论高危型HPV E2蛋白具有诱导宫颈鳞癌细胞凋亡的作用,有望成为宫颈癌防治的有效靶标。     

KLF4过表达对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响

目的:建立稳定过表达人锌指转录因子Krüppel样因子4(Krüppe-like factor 4,KLF4)基因的K562细胞株,研究KLF4过表达对白血病K562细胞增殖、凋亡的影响。方法:将过表达KLF4的重组质粒p EGFP-KLF4电穿孔转染白血病K562细胞,G418压力筛选出稳定转染细胞克隆并扩大培养(K562/p EGFP-KLF4组),设p EGFP-C1空质粒转染K562细胞(K562/p EGFP-C1组)及空白K562细胞对照组。应用荧光显微镜观察EGFP-KLF4融合蛋白的表达,Western blot法检测各组细胞中KLF4蛋白表达水平,MTT比色法检测各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。结果:p EGFP-KLF4重组质粒转染K562细胞后,经G418压力筛选,获得了表达绿色荧光蛋白的稳定细胞株;与对照组相比,K562/p EGFP-KLF4组细胞KLF4的蛋白表达水平明显升高,其过表达率为74.07%(P0.05);过表达KLF4的K562细胞增殖活力被显著抑制(P0.05);过表达KLF4的K562细胞凋亡显著增加(P0.05)。结论:KLF4过表达可抑制K562细胞的增殖,促进其凋亡。     

超声辐照联合微泡转染短发卡状重组质粒诱导裸鼠宫颈癌移植瘤凋亡的研究

目的探讨超声辐照联合微泡对靶向存活素的短发卡状重组质粒（survivin—shRNA）的转染增效作用及其安全性,分析其凋亡诱导效应和增殖抑制作用。方法将荷人宫颈癌（Hela）裸鼠18只随机分为3组,每组6只。1组：质粒＋超声辐照组,注入质粒溶液后予以超声辐照;2组：质粒＋微泡＋超声辐照组,注入质粒及微泡复合物后辐照;对照组：不予任何处理。对组织样本行冰冻切片、组织学检查、转染率检测。采用免疫组化SABC法检测移植瘤增殖细胞核抗原（PCNA）及survivin蛋白在各组肿瘤标本中的表达,测定凋亡指数（AI）和增殖指数（PI）。结果2组的移植瘤内荧光表达率显著高于对照组、1组（P〈0．01）;裸鼠其他器官组织中未观察到基因表达,且未观察到明显的组织损伤;PCNA及survivin蛋白表达下降,AI明显升高,PI明显减少,与对照组及1组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论超声辐照联合微泡能显著增强基因转染效率,无明显副作用,联合Survivin—shRNA能明显诱导裸鼠体内肿瘤凋亡,抑制细胞增殖。     

肝癌中Survivin表达与PCNA和AFP的关系及意义

目的 :探讨Survivin在原发性肝细胞癌 (HCC)组织中的表达及与PCNA和AFP的关系。方法 :采用Westernblot和RT -PCR检测 4 3例肝癌组织、2 0例癌旁组织和 11例正常肝组织中Survivin蛋白和mRNA的表达情况。免疫组化 (SP法 )检测Sur vivin、PCNA和AFP蛋白的表达情况。结果 :4 3例HCC标本中分别有 30例表达Survivin蛋白 (6 9.8% ) ,除 1例癌旁组织外 ,其它癌旁组织和正常肝组织中未见Survivin蛋白表达。Survivin表达与肝癌的病理分级、临床分期和AFP的表达等无明显相关。Survivin表达与肝癌细胞增殖活性 (PCNA -LI)显著相关 (P <0 .0 5 )。结论 :Survivin在肝癌组织中高表达 ,提示Survivin在肝癌的发生、发展过程中起重要作用 ;Survivin的表达与肝癌细胞增殖活性 (PCNA -LI)显著相关 ,提示Survivin可能促进肝癌细胞的恶性增殖     

结肠癌组织中差异表达基因的筛选和鉴定

目的 筛选和克隆结肠癌和正常结肠组织差异表达的基因片段,为探讨结肠癌的发病机制提供线索。方法 应用基因差异显示技术（DD—PCR）,比较结肠癌和正常结肠组织基因表达的差异,对其中一条有明显差异的基因片段进行克隆、测序,测序结果提交GenBank数据库中进行同源性分析,并用半定量RT—PCR进行初步鉴定。结果 同源性分析表明,该片段与已知基因DDX32高度同源（99％）。RT—PCR结果显示,在结肠癌组织中该基因mRNA的表达水平显著高于正常结肠组织（P〈0．05）。结论 DD—PCR是筛选差异表达基因的有效手段;在结肠癌组织中DDX32基因的表达显著高于正常结肠组织,此结果为研究DDX32基因在结肠癌发病中的作用提供了线索。     

沉默Survivin基因对鼻咽癌CNE1细胞增殖和凋亡的研究

目的：探讨 Survivin表达降低时,对鼻咽癌细胞的增殖及凋亡的影响。方法运用 RNA 干扰技术,结合 RT-PCR,Western blot技术,观察干扰 Survivin效果。干扰 Survivn后用 MTT法和 TUNEL法检测鼻咽癌细胞增殖,凋亡的情况。用 Western-blot方法检测凋亡相关蛋白 PARP,Bcl-2和Bax的表达。结果 RT-PCR检测显示 Survivin-siRNA干扰组,Survivin mRNA表达明显下调,其相对表达量为0.26±0.02,抑制率为43.7％,与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）;Western blot检测显示 Survivin-siRNA组蛋白表达下调,其蛋白相对表达量下降了57％,与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT检测显示 Survivin-siRNA组对细胞增殖有明显抑制作用,在24,48和72 h的抑制率分别为21.9％,37.1％和29.6％,与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）;Tunel染色结果显示 Survivin-siRNA组细胞凋亡数明显增高。Western blot结果显示Survivin-siRNA组凋亡蛋白PARP（89KD）显著升高,为对照组的3.9倍,抑制凋亡蛋白Bcl-2降低,降低了70％,促进凋亡蛋白Bax升高,为对照组的2.4倍;同时也抑制AKT的磷酸化,磷酸化水平降低了57％,与对照组相比以上结果差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论干扰 Survivin表达,抑制鼻咽癌细胞增殖,促进细胞凋亡。Survivin基因可成为鼻咽癌基因治疗的一个潜在靶点。     

Survivin在宫颈鳞癌中的表达及临床意义

目的 探讨宫颈鳞癌组织中survivin基因表达的特征及临床意义。方法 采用免疫组织化学方法（PV法）检测54例宫颈鳞癌，16例正常官颈组织中Survivin基因的表达，并分析其临床病理特征。结果 Survivin在正常宫颈组织中不表达，在官颈鳞癌组织中阳性表达率与年龄、临床分期及淋巴结转移有关。结论 Survivin基因在官颈鳞癌组织中的稳定表达。预示肿瘤有较高的侵袭性和不良预后，可能成为有效的预测官颈鳞癌侵袭性的监测指标及判断预后的指标，对指导临床治疗具有重要意义。     

Survivin在卵巢癌中表达的研究

目的：探讨凋亡抑制基因Survivin在卵巢癌中的表达及其与临床病理资料的关系。方法：采用RT-PCR和Western blot检测20例卵巢癌及正常卵巢组织中survivivn基因的表达情况。结果：通过统计分析，发现Survivin在卵巢癌组织中表达明显高于正常组织。结论：Survivin可能在卵巢癌的发生发展中起一定的作用。     

Vpr抑制人大肠癌细胞株HT-29增殖及调节存活素表达的研究

目的观察I型人类免疫缺陷病毒蛋白R(Viral protein R、Vpr)在体外对大肠癌细胞HT-29增殖抑制及探索Vpr对HT-29细胞存活素(Survivin)表达的调节作用。方法应用腺病毒转染系统将Vpr基因以不同感染复数转染至HT-29细胞。MTT法检测Vpr对HT-29细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡变化。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(western blot)法检测mRNA水平和蛋白水平上Survivin的表达。结果实验组可见Vpr蛋白的表达;实验组大肠癌细胞HT-29增殖受到抑制(MOI=200),从转染72h开始,实验组MTT值与对照组及空载体组比较差异均具有有统计学意义(P0.05),随着时间的延长,抑制逐渐增强;转染72h后(MOI=200),实验组细胞凋亡率与对照组及空载体组比较均差异具有显著统计学意义(P0.01);实验组处于G2/M期细胞比例与对照组及空载体组比较均差异具有统计学意义(P0.05);转染72h后,实验组(MOI=50)Survivin基因的mRNA水平及蛋白表达水平与对照组及空载体组(MOI=200)比较均差异具有统计学意义(P0.05或P0.01),并且survivin的表达随着MOI的增加而减弱。结论 Vpr体外可以诱导细胞HT-29G2/M期阻滞及凋亡从而有效抑制细胞HT-29增殖,其机制可能与Vpr下调Survivin基因的表达有关。Vpr在大肠癌的治疗中具有潜在的应用前景。     

Survivin siRNA沉默对非小细胞肺癌细胞生物学的影响

目的探讨凋亡抑制蛋白(Survivin)对非小细胞肺癌(NSCLC)H1299细胞株的生物学影响。方法通过脂质体介导将Survivin基因siRNA瞬时转染H1299细胞。采用RT-PCR及Western blot检测转染后H1299细胞内Survivin基因的表达水平。MTT比色法、流式细胞术(FCM)及Western blot观察细胞增殖、凋亡、周期及Caspase-9蛋白表达变化情况。结果 RT-PCR及Western blot证实,siRNA沉默的H1299细胞中Survivin mRNA、蛋白的表达水平较未转染组明显降低(t=10.970,P=0.000;t=9.192,P=0.003)。MTT、细胞凋亡及周期结果表明,siRNA沉默的H1299细胞其增殖能力明显减弱、细胞凋亡明显升高,G2/M期阻滞,Caspase-9蛋白表达增加(t=8.162,P=0.001;t=10.800,P=0.000;t=9.192,P=0.003)。结论 Survivin参与NSCLC细胞增殖、凋亡、周期这一生物学过程。     

Survivin在白血病细胞中的表达及GM-CSF对其影响的研究

本研究旨在探讨凋亡存活蛋白survivin在白血病的原代细胞和白血病细胞系中的表达情况，并观察粒-巨噬细胞细胞集落刺激因子（GM-CSF）对其的影响。用RT-PCR方法检测37例白血病患者、10例正常成人骨髓和3种白血病细胞系（K562、HL-60、U937）中survivin的表达。以HL-60细胞为对象，加入合适浓度的GM-CSF，用RT-PCR和Western blot分别检测加药前后surivin mRNA和蛋白水平的变化。结果显示：37例白血病患者中有25例表达survivin，阳性率为67．6％，其中急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞中survivin mRNA表达阳性率为73．3％，高于急性髓系白血病（AML），但均高于正常对照组（20．0％）（P〈0．05）。3种细胞系K562、HL-60和U937全部表达survivin。合适浓度的GM-CSF作用2天后，HL-60细胞中survivin的表达明显升高，其中mRNA水平升高了26％，蛋白水平升高了49％。结论：suvivin在白血病的原代细胞和细胞系中均有较高表达，而GM-CSF能显著提高HL-60细胞中survivin的水平。     

没食子酸对人宫颈癌细胞株Hela细胞生物学行为的影响

目的探究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人宫颈癌细胞株Hela细胞生物学行为及血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达的影响。方法取人宫颈癌Hela细胞进行培养分别给予0μmol、10μmol、20μmol、30μmol、40μmol EGCG进行处理。采用CCK8法、流式细胞法、Transwell法分别检测不同剂量EGCG处理下细胞增殖、凋亡、侵袭力;采用RT-PCR、Western Blot法检测细胞VEGF、MMP-9基因表达情况。结果①EGCG处理后,Hela细胞增殖抑制率、凋亡率升高,侵袭细胞数减少(P <0.05);随着EGCG剂量的升高,Hela细胞增殖抑制率、凋亡率、侵袭细胞数升高或降低幅度升高(P <0.05)。②未经EGCG(处理浓度=0)组别Hela细胞VEGF、MMP-9基因mRNA、蛋白呈高表达,处理组别细胞VEGF、MMP-9基因mRNA、蛋白表达量降低,随着处理浓度的升高,其表达量降低幅度更大(P <0.05)。结论 EGCG可呈剂量依赖性抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖及侵袭,促使其凋亡,对于恶性生物学行为有较好的抑制效果,VEGF、MMP-9等基因表达的抑制可能是其机制之一。