腺病毒介导胸苷激酶基因对静脉平滑肌细胞增殖及内膜增生抑制作用的研究

目的探讨以腺病毒为载体介导胸苷激酶（tk）基因对静脉平滑肌细胞增殖及内膜增生的抑制作用。方法腺病毒载体携tk及β-半乳糖苷酶（lacZ）基因转染人的大隐静脉平滑肌细胞及大隐静脉片，以不同浓度的更昔洛韦（GCV）培养。通过X-gal染色观察标记基因lacZ的表达效率。将转染tk基因阳性与tk基因阴性的平滑肌细胞以不同的比例混合培养观察旁观者效应。将转染tk基因的静脉片在含有GCV的培养液中培养14d，取标本进行HE、VG染色，辅以计算机图像分析，观察内膜增生情况。结果腺病毒载体能有效地转染培养的平滑肌细胞和静脉片中的平滑肌细胞，外源基因表达持续14d。平滑肌细胞增殖受抑制程度与GCV的浓度和tk表达的水平呈正相关。转染lacZ的平滑肌细胞则不被GCV抑制。混合细胞培养（tk阳性及tk阴性细胞混合），当10％的细胞表达tk基因时，细胞生存率下降了55％。在静脉片培养实验中，tk／GcV组与对照组（lacZ／GcV和tk／GCV^-）比较，前者内膜增生60％受到抑制。结论tk基因合并GCV治疗具有抑制平滑肌细胞增殖和移植静脉内膜增生的作用，tk基因治疗具有旁观者效应。     

大鼠颈静脉分支-颈动脉间置模型新生内膜细胞来源研究

目的探讨大鼠颈静脉分支-颈动脉间置模型新生内膜细胞来源。方法建立SD大鼠颈静脉分支-颈动脉间置模型,分别于术后1、3、7、14和28d取静脉移植血管,定量分析新生内膜厚度,并进行α-SM—actin和CD34免疫组织化学分析。结果新生内膜增生在28d时最明显,血管吻合部位狭窄最严重,增生厚度近端（65．2±4．6）μm,远端（64．7±5．3）μm,中段（63．5±5．6）μm。新生内膜细胞主要来源于内皮细胞、相邻动脉血管平滑肌细胞或循环祖细胞,以新生内膜腔面为著。结论静脉移植血管新生内膜细胞主要来源于静脉移植血管本身内皮细胞、相邻动脉血管平滑肌细胞或循环祖细胞,提示可于血管吻合完成后进行局部干预或术后尽早全身用药,以防止移植血管狭窄。     

人arresten重组蛋白对移植物动脉硬化的抑制作用

目的观察人arresten重组蛋白对移植物动脉硬化的抑制作用。方法用pRSET原核表达系统表达并纯化人arresten重组蛋白。建立腹主动脉移植大鼠模型，将受体鼠分为同系动脉移植组、异系移植对照组和异系移植实验组。自术后第3天起，皮下给予arresten重组蛋白（每日5mg／kg体重）处理。8周后取移植动脉组织标本，进行病理组织学观察与免疫组织化学染色，分析移植动脉新生内膜增生及新生内膜细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和PCNA的表达。结果异系移植组移植动脉新生内膜中α-SMA表达阳性平滑肌细胞大量增生，致动脉内膜增厚，管腔狭窄。异系移植实验组移植动脉内膜增生受到明显抑制，新生内膜面积（0．14±0．03）mm^2。及新生内膜／中膜面积比（0．807±0．073）均显著低于异系移植对照组[（0．33±0．07）mm^2，（1．794±0．089），P〈0．01]；并且异系移植实验组移植动脉新生内膜细胞PCNA标记指数（31．72±5．26）％显著低于异系移植对照组（69．53±4．38）％（P〈0．01）。结论人arresten重组蛋白能有效抑制移植物动脉硬化的发生发展，在抗移植物慢性排斥反应方面显示出良好的应用前景。     

p27kip1基因表达对大鼠移植静脉内膜平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的观察以聚乳酸聚乙醇酸（PLGA）纳米粒子为载体的人p27^kip1基因局部转染自体移植静脉后，对大鼠静脉内膜平滑肌细胞增殖及凋亡的影响。方法Wistar大鼠120只建立自体静脉移植模型，随机分成3组。转基因组：移植静脉转染以PLGA纳米粒子为载体的p27^kip1基因；空白对照组：转染不含有p27^kip1基因的单纯PLGA纳米粒子；单纯静脉移植组：使用生理盐水。分别于术后3、7、14、28d取材，常规HE、Verhoeff弹力纤维染色，Western blot检测p27^kip1蛋白的表达，免疫组化（SABC）法检测增殖细胞核抗原（PCNA）的表达、TUNEL法观察内膜平滑肌细胞凋亡的动态变化。结果转基因组内膜中p27^kip1蛋白表达水平高于其他组；内膜平均厚度7、14、28d低于其他2组（P〈0．01）；转基因组内膜PCNA的表达7、14d明显受到抑制（P〈0．01），平滑肌细胞的凋亡细胞百分比于7、14d较对照组明显增加（P〈0．01），单纯静脉移植组与空白对照组之间各项监测指标差异无统计学意义。结论p27^kip1基因的过表达能够有效抑制自体静脉移植后的内膜增生（IH），促进平滑肌细胞的凋亡。     

纳米粒子包载反义雷帕霉素靶蛋白基因转染对移植静脉内膜增生的影响

目的观察纳米粒子包载的反义雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因局部转染对移植静脉内膜增生的影响。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）和聚乙烯醇（PVA）包载mTOR基因。建立自体静脉移植模型，随机分成转基因组、空载体组、对照组。转基因组移植静脉转染纳米粒子包载的反义mTOR基因，空载体组单纯转染纳米粒子包载的空载体，对照组不予特殊处理。分别于移植3、7、14、28d取材，常规苏木素．伊红（HE）、Verhoeff染色，检测mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达的变化，TUNEL法观察血管平滑肌细胞（VSMC）凋亡的动态变化。结果转基因组内膜中mTOR基因的mRNA及蛋白产物表达明显减少（P〈0．01）；转基因组内膜增生程度在术后7、14、28d较其他组明显减少（P〈0．01）；转基因组凋亡细胞明显增多（P〈0．01）。结论纳米粒子可以作为基因载体，反义mTOR基因的表达能够抑制移植静脉内膜的增生，促进VSMC凋亡。     

去抗原血管移植建立血液透析血管通路的临床研究

目的探讨甲醛处理尸体股动脉应用于血液透析（HD）血管通路的临床效果。方法双向琼脂扩散沉淀反应（DADPR）测定甲醛处理后血管的抗原性。46例71次血管移植术前未行组织配型,未使用免疫抑制剂;观察移植血管排异反应、血流量、通畅率和并发症。普通光镜和免疫组织化学观察血管保存效果和血管内膜增生情况。结果DADPR反复3次均无沉淀线。术后1月移植血管平均血流量（702±293）ml／min,其1、2、3年的初始和二次通畅率分别是（74．6％±6．5％）／（90．4％±5．5％）、（53．7％±7．2％）／（73．5％±7．2％）、（42．3％±7．2％）／（62．5％±9．2％）。术后6月、24月光镜显示移植血管各层结构完整。增生内膜最表层CD34、vWf阳性染色,表层下增生内膜为actin阳性表达的平滑肌细胞,弹力纤维结构完整;移植血管术后不同阶段发生血栓形成27例次（38％）、血管瘤2例、穿刺部位感染1例,无排异反应发生。结论甲醛处理血管可有效去除血管的抗原性,血流量和通畅率满意,并发症少;增生的血管内膜表达actin抗原,最表层有CD34、vWf阳性表达。该方法处理血管可应用于临床血管移植。     

32 P局部照射对移植静脉内膜平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的 研究β射线局部照射对自体移植静脉内膜平滑肌细胞（VSMC）增生与凋亡的影响及可能机制。方法 建立80只大鼠自体静脉移植模型,随机分成^32P局部照射组、对照组,每组按3、7、14、28d随机分成4个亚组、每亚组10只。取材固定,弹力纤维染色,增殖细胞核抗原、p53、bcl-2、bax免疫组化测定,TUNEL法检测静脉平滑肌细胞的凋亡,计算机图象分析仪测量移植血管内膜厚度,计算细胞增殖及凋亡百分化。结果 术后2组移植静脉段的内膜平均厚度：7、14、28d,照射组明显 于对照组（t＝15．694,P＜0．05）;7、14d照射组VSMC增殖较对照组受到明显抑制（t＝60．157,P＜0．01）。凋亡指数14d照射组高于对照组（t＝56．176,P＜0．01）。p53的表达,2组间差异无显著性意义（t＝0．473,P＞0．05）,bax与bcl－2的表达,14d照射组高于对照组（t＝9．783,P＜0．05）。结论 ^32P局部照射可以抑制自体移植静脉的内膜增生及VSMC的增殖,促进VSMC的凋亡,可能是通过bax、bcl－2基因的表达实现的。     

野生型p53基因转染和低能量激光照射防治移植静脉再狭窄的实验研究

目的：探索转基因疗法和激光疗法防治移植静脉远期再狭窄的可行性及作用机制。方法：建立兔颈外静脉颈总动脉移植模型，分为（1）对照组，（2）绿色荧光蛋白（GFP）基因转染组，（3）p53基因转染组，（4）低能量激光照射组，（5）p53基因转染并低能量激光照射组。术后4周，免疫组织化学方法检测外源p53基因的表达及增殖细胞核抗原（PCNA），应用DNA片段末端标记法（TUNEL）标记凋亡细胞。HE、Masson及维多利亚兰染色后，应用计算机图像分析系统检测移植静脉内膜、中膜增生情况。结果：术后4周，与对照组相比，GFP基因转染组移植静脉血管平滑肌细胞（VSMC）增殖率、凋亡率差异无显著性，移植静脉内膜和中膜厚度无明显变化；p53基因转染组VSMC增殖率降低61％，凋亡率增加25％，移植静脉内膜和中膜厚度分别减少60％、33％，内膜厚度/中膜厚度比值(I/M)减少37％；应用低能量激光照射组VSMC增殖率降低41.5％，细胞凋亡率增加40.9％，移植静脉内膜和中膜厚度分别减少了58.5％、18.0％，I/M比值减少47.2％；转染p53基因同时应用低能量激光照射组VSMC增殖率较对照组降低61.7％，细胞凋亡率增高47.0％，移植静脉内膜和中膜厚度分别减少69.7％、44.4％，I/M比值减少44.5％。结论：转染野生型p53基因和低能量激光血管外照射可以抑制静脉VSMC增殖，促进移植静脉VSMC凋亡，使移植静脉内膜和中膜的增生减轻，具有防治移植静脉远期再狭窄的作用。     

经外膜缓释雷公藤内酯醇抑制自体移植静脉内膜增生

目的:探讨经外膜缓释雷公藤内酯醇（triptolide）对自体移植静脉内膜增生的抑制作用。方法:健康雄性新西兰大白兔24只，建立颈外静脉-颈总动脉移植模型。随机将动物等分为3组。空白组移植血管不给任何处理， F-127多聚凝胶对照组在移植血管外膜喷洒20 %F-127多聚凝胶0.5 mL，实验组在移植血管外膜喷洒携带雷公藤内酯醇300μg的F-127多聚凝胶0.5 mL。术后2周取标本。用组织形态学方法检测血管内膜增生程度，免疫组化检测标本中bcl-2和Fas的表达，TUNEL法检测标本中血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的水平。结果:静脉移植2周后，与空白组和F-127对照组比较，实验组血管内膜增生明显受抑制（P<0.05），bcl-2的表达［（18.2±8.4） %］显著减少，而Fas的表达［（21.4±8.9） %］显著增加，凋亡细胞［（28.4±7.6） %］也显著增加（P<0.05）。结论:经外膜缓释雷公藤内酯醇可有效抑制移植静脉内膜增生，这一作用可能系通过促进VSMC凋亡而实现的。     

hTERT基因短发夹状RNA表达载体对肾癌细胞生长的抑制作用

目的观察针对hTERT基因的短发夹状RNA（shRNA）表达载体pSilencer-hTERT对人肾癌细胞及移植瘤生长的抑制作用。方法（1）pSilencer-hTERT转染人肾癌Kerr-3细胞，1、3、5、7d后逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印迹技术检测hTERTmRNA、蛋白表达，MTT法检测细胞增殖，原位末端标记法检测凋亡。（2）BALB／C-nu裸鼠接种Ketr-3细胞成瘤，瘤内分别注射pSilencer-hTERT（50μg）、空质粒pSilencer1．0-U6（50μg）及等体积（100μg）生理盐水，隔日1次，共7次。治疗结束后第3天处死小鼠，取瘤组织检测肿瘤体积，免疫组织化学染色检测hTERT表达。结果（1）pSilencer-hTERT转染3d后Ketr-3细胞hTERTmRNA表达（43．2±4．4）％、蛋白表达（42．6±5．6）％最低，细胞增殖抑制率（37．3±6．6）％、凋亡细胞阳性率（30．5±4．7）％最高，分别与空质粒对照组[（98．8±4．7）％、（98．0±3．7）％、（3．3±0．9）％、（10．4±2．4）％]比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。（2）pSilencer-hTERT处理组小鼠肿瘤体积（62．4±36．5）mm^3减小，hTERT表达率（65．7±4．7）％降低，分别与空质粒对照组（83．2±38．7）、（90．7±4．2）％比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论pSilencer-hTERT能有效、持续抑制人肾癌Ketr-3细胞及裸鼠肾癌移植瘤生长。     

膝关节后交叉韧带断裂治疗临床分析

目的 对35例膝关节后交叉韧带断裂治疗进行临床分析,重点探讨了有关交叉韧带断裂的治疗问题。方法 经明确诊断后,分析采用胫骨附着处撕脱骨折复位固定手术治疗26例、早期髌韧带中1／3移植重建3例、单纯长腿石膏固定6例。结果 本组病例全部进行随访,随访时间13个月－5年,胫骨附着处撕脱骨折复位固定及髋韧带中1／3移植重建29例为优良、单纯长腿石膏固定6例为差。结论 后交叉韧带断裂后应该及时给予手术修复;膝后外侧手术入路,操作简单,暴露充分;少于3个月的陈旧性病例仍适应手术治疗。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。