特定沉默胶质瘤U251细胞株的PDGF-B基因对细胞凋亡和增殖的影响研究

目的利用RNA干扰基因治疗技术,特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板衍生生长因子B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法用血清培养液(含10%胎牛血清DMEM培养基)体外培养人U251脑胶质瘤细胞系。随机分为3组,第1组为实验组:转染siRNA的细胞,第2组为阴性对照组:转染空白质粒的细胞;第3组为空白对照组:细胞常规培养不予以干预。利用脂质体将siRNA转染进入U251细胞,在细胞内形成双链siRNA,识别并降解PDGF-B mRNA。通过RT-PCR检测U251细胞中PDGF-B基因mRNA的表达水平,Western blot检测PDGF-B的蛋白表达,MTT法检测U251细胞的增殖情况,流式细胞学对比检测3组细胞的凋亡情况。结果利用脂质体将靶向PDGF-B基因siRNA转染进入U251细胞,48 h后利用RT-PCR检测PDGF-B基因mRNA的表达,结果显示与阴性对照组和空白对照组对比,转染组PDGF-B基因mRNA表达水平明显下降;转染72 h后,Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%);MTT结果显示siRNA转染组U25细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测显示,与阴性对照组和空对照组相比,转染siRNA的细胞的实验组中,G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达,能够使细胞周期阻滞在G1期,从而抑制胶质瘤细胞的增殖,并促进细胞的凋亡。结论构建靶向胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,通过体外试验观察可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,其所产生的RNA干扰效应对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长的抑制和促进凋亡作用。     

Livin和Survivin基因短发夹RNA真核表达载体的构建及其联合转染对肝癌细胞增殖和凋亡的影响

目的设计并构建能够有效干扰Livin和Survivin基因的表达,且能在胞内稳定转录的表达载体;研究Livin shRNA和Survivin shRNA的联合转染对肝癌细胞增殖活性及凋亡的影响。方法根据设计siRNA的原理,分别从Livin、Survivin基因序列中选取两段siRNA靶序列模板,以其为基础进行shRNA真核表达载体Pgenesil-1-Livin和Pgenesil-1-Survivin的构建。将传代培养的肝癌Hep G2细胞株分为五组:设阴性对照组(不转染)、空白质粒组(单独转染Pgenesil-1-NC)、Survivin组(单独转染Pgenesil-1-Survivin)、Livin组(单独转染Pgenesil-1-Livin)和共转染组(联合转染Pgenesil-1-Livin和Pgenesil-1-Survivin),对各组细胞进行单独或联合转染。为检测转染2 d后Livin和Survivin蛋白表达的情况、转染后三个不同时间点(48 h、60 h、72 h)的细胞增殖活性变化及转染后48 h的细胞凋亡率,分别采用了蛋白质印迹法、MTT法及TUNEL法。结果两种表达载体的测序结果与预期相同。与阴性对照组及空白质粒组相比,转染后2 d,Livin组、Survivin组和共转染组的蛋白表达均明显下降(P0.05),而与Livin组和Survivin组相比,共转染组蛋白表达的下降更为显著(P0.05);各组细胞在3个检测时间均表现出增殖活性的下降,且与Livin组和Survivin组相比,共转染组在三个检测时间的细胞生长抑制率(IR)值分别为28.541±0.842、21.644±0.129、15.532±1.12,明显高于前者(P0.05);转染后48 h,共转染组凋亡率为53.956%±4.332%,明显大于Livin组和Survivin组(P0.05)。结论成功设计并构建体内可稳定转录且能有效干扰目的基因表达的质粒载体。对肝癌细胞进行Livin shRNA和Survivin shRNA的联合转染,可更大程度下调相应基因的表达,降低Livin蛋白和Survivin蛋白的胞内含量,可更为有效地阻碍癌细胞的异常增殖,促进癌细胞的程序性凋亡。     

应用RNA干扰技术沉默vegfr-2基因的实验研究

为了探讨恶性肿瘤基因治疗的新靶点,本研究以vegfr-2的mRNA为靶点,设计、构建vegfr-2 shRNA的真核表达载体,用脂质体法将重组质粒转染人非小细胞肺癌A549细胞,用RT-PCR法及Western blot分别检测重组质粒对该基因mRNA和蛋白表达的抑制效果,应用CCK-8法检测细胞增殖、抑制情况,Hoechst染色法检测细胞凋亡形态学变化。结果表明:与空白对照、空质粒对照及scramble对照相比,干扰组shRNA能有效地降解vegfr-2mRNA,尤其转染pGenesil-1-vegfr-2-shRNA-1质粒组内源性vegfr-2 mRNA及蛋白减少更显著;在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低,转染后72小时抑制率最高,干扰组与空质粒组和空白对照组相比,对细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(p0.01);Hoechst荧光染色显示,转染48小时后在荧光显微镜下干扰组细胞呈典型的细胞凋亡形态。结论:vegfr-2 shRNA真核表达载体可序列特异性下调A549细胞的基因转录和表达,有效抑制细胞增殖和诱导凋亡,提示VEGF/VEGFR-2信号通路可作为恶性肿瘤基因治疗和功能研究的理想靶点。     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株筛选

背景:有研究表明富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,LRIG1)基因在神经胶质瘤细胞中呈低表达,LRIG1基因过表达后对神经胶质瘤细胞的 LRIG1 mRNA和蛋白表达均明显增强和抑制其生物学行为,但却很少有研究从阻断LRIG1基因的表达的角度进行论证.目的:构建针对LRIG1基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人脑胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响.方法:根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1和LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negative shRNA.合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列.用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15细胞的筛选浓度.将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株.Western blot检测LRIG1蛋白的表达.结果与结论:构建的重组pGenesil2-LRIG1- shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明其序列插入正确.转染pGenesil2- LRIG1-shRNA1(LRIG11)细胞和pGenesil2- LRIG1-shRNA2(LRIG12)细胞LRIG1蛋白表达水平较阴性对照组pGenesil2-negative shRNA分别下降47.9%(P < 0.01)和32.8% (P > 0.05).结果证实,实验成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体pGenesil2-LRIG1-shRNA1,其转染GL15细胞后可抑制LRIG1的表达.     

重组腺病毒p53 上调凋亡调控因子通过凋亡通路增强胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的体外研究

目的 探讨转染p53 上调凋亡调控因子(PUMA)的人脑胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性增强的作用机制.方法 将人脑胶质瘤细胞U87MG 分为正常对照组、空载体组和实验组进行培养,分别将感染复数(MOI) ＝50 的空载体腺病毒(Ad-△ BH3)和携带PUMA 的重组腺病毒(Ad-PUMA)转染U87MG 细胞,转染后用MTT 比色法测定各组细胞的存活率并计算替莫唑胺(TMZ)IC50,流式细胞仪检测细胞周期的变化,应用TUNEL 法检测细胞的凋亡情况.Western blot 检测凋亡相关蛋白p53、Bax 的表达.结果 外源性PUMA 基因在Ad-PUMA 转染U87MG 48 h 后,随着时间延长,PUMA 表达使U87MG 细胞的增殖能力降低并诱导凋亡,转染24 h、48 h、72 h 的生长抑制率分别为17.3%、35.6%、43.3%,凋亡率分别为20.3%、31.4%、45.4%.正常对照组、Ad-PUMA、Ad-△BH3 组细胞的TMZ IC50分别为(15.0 ±1.9)μmol/L、(2.3 ±0.1)μmol/L 和(14.4 ±1.6)μmol/L.PUMA 表达的U87MG 细胞DNA 合成受到抑制,周期阻滞在G2 期;Western blot 检测显示p53 表达在各组中差异无统计学意义(P ＞0.05)、PUMA 和Bax 在实验组中表达较对照组强,差异有统计学意义(P ＜0.01).结论 Ad-PU-MA 转染可有效增强人脑胶质瘤细胞U87MG 对TMZ 的敏感性,抑制人脑胶质瘤细胞U87MG 的增殖,通过诱导细胞G2 期阻滞促进其凋亡,促凋亡机制不依赖于p53.     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株筛选

背景：有研究表明富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains1,LRIG1）基因在神经胶质瘤细胞中呈低表达,LRIG1基因过表达后对神经胶质瘤细胞的LRIG1mRNA和蛋白表达均明显增强和抑制其生物学行为,但却很少有研究从阻断LRIG1基因的表达的角度进行论证。目的：构建针对LRIG1基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人脑胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响。方法：根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1和LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negativeshRNA。合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列。用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15细胞的筛选浓度。将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株。Western blot检测LRIG1蛋白的表达。结果与结论：构建的重组pGenesil2-LRIG1-shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明其序列插入正确。转染pGenesil2-LRIG1-shRNA1（LRIG11）细胞和pGenesil2-LRIG1-shRNA2（LRIG12）细胞LRIG1蛋白表达水平较阴性对照组pGenesil2-negativeshRNA分别下降47.9%（P〈0.01）和32.8%（P〉0.05）。结果证实,实验成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体pGenesil2-LRIG1-shRNA1,其转染GL15细胞后可抑制LRIG1的表达。     

神经突触核蛋白-γ质粒转染胶质瘤细胞及其过表达对紫杉醇耐药性的影响

目的探讨胶质瘤细胞U87中神经突触核蛋白-γ(synuclein-γ,SNGG)过度表达对紫杉醇耐药的影响。方法 U87/SNCG组采用pIRES2-EGFP-SNCG真核表达载体转染U87胶质瘤细胞,构建稳定转染SNCG的U87/SNCG细胞系,U87/neo对照组采用pIRES2-EGFP空载质粒转染U87胶质瘤细胞,构建U87/neo细胞系。采用G418选择培养稳定转染的U87/neo和U87/SNCG细胞系,采用反转录实时定量聚合酶链反应和免疫荧光染色技术鉴定成功后,2组分别于紫杉醇作用6、12、18、24h时检测细胞增殖抑制率,采用流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡细胞比例,采用免疫荧光染色法观察细胞形态学变化。结果成功构建U87/SNCG细胞系;U87/SNCG组SNCG mRNA表达较U87/neo对照组上调9.06倍;紫杉醇作用24h时,U87U/SNCG组细胞增殖抑制率[(25.49±2.44)%]和凋亡细胞比例[(7.02±0.26)%]明显低于U87/neo对照组[(34.36±2.95)%、(14.93±1.53)%](P<0.05);紫杉醇作用6h时,U87/SNCG组细胞G2/M期比例[(22.87±0.60)%]低于U87/neo对照组[(26.75±2.70)%](P<0.01);随着紫杉醇作用时间延长,与U87/SNCG组比较,U87/neo对照组细胞总数减少,细胞散落浮于培养液中,出现透明空泡、崩解细胞,并可见大量核固缩、核碎裂之凋亡现象。结论 SNCG过表达可降低抗微管药物诱导的U87细胞有丝分裂期阻滞,增强胶质瘤细胞的增殖能力和抗凋亡能力。     

c-Met siRNA对U87-EGFRvⅢ胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响

目的:合成针对c-Met的小干扰RNA(siRNA),研究其对U87-EGFRvⅢ(表皮生长因子受体Ⅲ型突变体)胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响.方法:用脂质体转染合成的c-Met siRNA入U87-EGFRvⅢ细胞,未转染组为对照组,荧光实时定量PCR和Western blotting分别检测c-Met基因和蛋白的表达,MTT和AnnexinV-FITC/PI法检测细胞增殖和凋亡情况.结果:c-Met siRNA明显抑制c-Met表达(P＜ 0.05);明显增加细胞凋亡率(P＜0.05).同时,c-Met siRNA单独或协同EGFRvⅢsiRNA可抑制胶质瘤细胞增殖(P＜0.05).结论:c-Met siRNA可抑制U87-EGFRvⅢ胶质瘤细胞增殖、诱导其凋亡,为研究c-Met基因在胶质瘤中的作用及其靶向联合治疗提供了理论基础.     

NOB1影响胶质瘤细胞增殖、凋亡的实验研究

目的 利用RNA干扰（RNAi）在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中沉默NOB1基因的表达,探讨NOB1对恶性胶质瘤细胞增殖以及凋亡的影响.方法 构建NOB1基因的短发卡（shRNA）慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒并感染人胶质瘤U251和U87-MG细胞,采用实时定量聚合酶链反应检测NOB1在恶性胶质瘤细胞系中的表达.采用甲基噻唑基四唑（MTT）比色法和克隆形成实验检测细胞增殖和克隆形成能力情况;同时利用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡情况,观察NOB1基因对U251和U87-MG细胞增殖、凋亡的影响.结果 NOB1基因在人胶质瘤U251、U87-MG细胞系中均明显高表达.NOB1-shRNA慢病毒能有效感染胶质瘤细胞,实验结果显示感染后U251和U87-MG细胞的增殖能力明显下降;U251克隆形成能力明显受到抑制;细胞周期在G0/G1停滞,而且细胞出现显著性凋亡;上述差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 NOB1在人胶质瘤U251和U87-MG细胞中高表达;降低NOB1基因的表达,可以显著降低胶质瘤细胞的增殖,并促进胶质瘤细胞凋亡;NOB1基因在体外对胶质瘤细胞的发生发展可能具有癌基因的调节作用.     

OTUB1基因的siRNA转染对脑胶质瘤细胞凋亡及STAT3信号通路的影响研究

目的探讨卵巢肿瘤相关蛋白酶B1(OTUB1)基因的siRNA转染对脑胶质瘤细胞活力、凋亡及STAT3信号通路的影响。方法 Western blotting检测OTUB1在人脑恶性胶质瘤U251、U87、BT325和M17细胞中的蛋白表达;U87细胞分为空白组(不做任何处理)、NC组(转染Control siRNA)和si-OTUB1组(转染OTUB1 siRNA),参照Lip2000转染试剂盒说明转染siRNA。Western blotting检测转染OTUB1-siRNA后OTUB1的蛋白表达,并选择抑制效果好的siRNA作为研究对象;MTT检测OTUB1-siRNA转染后的24~72 h细胞活力;流式细胞仪检测OTUB1-siRNA转染的48 h细胞凋亡率;Western blotting检测STAT3、磷酸化的STAT3及STAT3信号通路下游相关基因cyclin D1和Bcl-2的蛋白表达。结果 OTUB1在U251、U87、BT325和M17细胞中均呈现出阳性表达,在U87细胞中呈现出较高水平表达;OTUB1-siRNA转染后的U87细胞OTUB1的蛋白表达显著低于空白组和NC组(P0.05);与NC组比较,si-OTUB1转染U87细胞24-72h的细胞活力均显著降低,转染48 h的细胞凋亡率显著升高,p-STAT3、cyclin D1和Bcl-2的蛋白表达均显著降低(P0.05),而三组间STAT3的蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。结论 OTUB1在人脑恶性胶质瘤细胞高表达,抑制OTUB1表达后可明显降低脑胶质瘤细胞活力,诱导细胞凋亡,机制可能是通过下调STAT3信号通路实现的。     

慢病毒介导的Cullin3沉默对人胶质瘤细胞的影响

目的:探讨慢病毒介导特异性短发夹RNA(sh RNA)干扰Cullin3表达对人胶质瘤细胞的影响。方法:RT-q PCR及Western blot检测Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中的表达;构建靶向Cullin3的sh RNA重组慢病毒,转染U251和U87MG细胞并测定转染效率。实验分为3组:Blank组(阴性对照组)、NC-sh RNA组(空载慢病毒组)及Cullin3-sh RNA组(慢病毒介导Cullin组)。MTT法和Brd U实验检测细胞活力和增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:与正常人星形胶质细胞相比,Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中高表达。Cullin3-sh RNA转染U251和U87MG细胞后,与Blank组及NC-sh RNA组相比,Cullin3-sh RNA组Cullin3表达水平下降(P<0.05),细胞活力和细胞增殖能力显著降低,侵袭能力下降,细胞周期被阻滞于G0/G1期。结论:Cullin3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示Cullin3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

Ezrin影响胶质瘤在裸鼠脑内的浸润性生长

目的应用RNAi沉默Ezrin基因或表达载体使其过表达以探讨Ezrin基因对脑胶质瘤生长的影响。方法根据GenBank中Ezrin的基因序列,应用Designer3.0（Genepharma）软件设计以Ezrin基因4个位点为靶的shRNADNA oligo,合成并克隆至shRNA载体pGPU6/GFP/Neo;构建其shRNA载体。经BamHⅠ、PstⅠ酶切鉴定和测序分析,再以脂质体LipofectimineTM2000介导转染U87细胞,48h后用RT-PCR和Western blot检测Ezrin mRNA和蛋白的表达,以筛选有效shRNA载体。将转染Ezrin基因有效shRNA载体和表达载体的U87细胞接种裸鼠脑,制备脑瘤动物模型,激光共聚焦显微镜下观察U87细胞在裸鼠脑内的迁移情况。结果经限制性内切酶切和测序鉴定分析所构建的shRNA-Ezrin正确;RT-PCR和Western blot检测结果表明,shRNA-Ezrin-2可沉默Ezrin表达,使其mRNA和蛋白表达量降低,确定为有效shRNA载体。激光共聚焦显微镜下可见shRNA-Ezrin-2转染的U87细胞在裸鼠脑内迁移数少于对照组,pEGFP-C1/Ezrin转染的U87细胞的迁移数相对较多。结论成功构建Ezrin基因的shRNA载体并筛选出有效shRNA载体。Ezrin基因参与U87细胞在裸鼠脑内的浸润性生长。     

靶向wnt-1基因的RNA干涉质粒构建及抑制U251细胞增殖的实验研究

目的构建靶向wnt-1基因的RNA干涉表达载体,转染人胶质瘤细胞U251中,研究该质粒的抑瘤效果。方法根据siRNA设计原则,通过软件设计,选取含有21个核苷酸(21nt)靶序列,形成siRNA的DNA模板并克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,获得靶向抑制wnt-1基因表达的siRNA表达载体,并经酶切测序鉴定。用该干涉质粒转染U251细胞,通过逆转录PCR、Western blotting方法检测wnt-1基因mRNA和蛋白表达水平,用MTT法、流式细胞术初步评价对U251细胞的增生、细胞周期影响。结果成功构建针对靶向wnt-1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒,可显著抑制U251细胞wnt-1基因的mRNA和蛋白表达。MTT法分析转染细胞增生明显抑制,流式细胞仪分析细胞周期证实转染后比空白对照组受到阻滞。结论靶向wnt-1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒构建成功,并可特异性的沉默wnt-1基因蛋白表达,使细胞增长减慢,细胞周期阻滞,本实验通过wnt-1的RNA干涉,为由wnt-1介导的wnt信号通路在胶质瘤发病机制中的抑瘤作用提供了依据,并为进一步该基因的基因治疗临床实验提供了可靠基础。     

整合蛋白β_1 shRNA表达质粒的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的应用RNAi技术,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒,诱导肝癌细胞中整合蛋白β1基因沉默,并观察其对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响。方法设计整合蛋白β1 shRNA序列,与载体pSilencer 2.0连接,构建整合蛋白β1 shRNA表达质粒。经测序鉴定后,转染肝癌细胞SMMC-7721,Western blot检测整合蛋白β1及p27的蛋白表达,MTT方法测定转染后细胞的增殖能力。结果成功构建了整合蛋白β1 shRNA表达质粒,转染肝癌细胞SMMC-7721后,整合蛋白β1的蛋白表达被明显抑制,p27的蛋白表达也随之减少。MTT实验结果发现转染细胞的增殖能力明显提高。结论应用RNAi技术,可特异性阻断整合蛋白β1的蛋白表达。整合蛋白β1可调节肝癌细胞的增殖,并可能与p27的表达相关。     

ShRNA靶向沉默VEGFR1基因对U937细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的 探讨慢病毒载体介导shRNA(short harpin RNA,siRNA前体)靶向沉默血管内皮生长因子受体1(VEGFR-1)基因对U937细胞增殖、迁移和凋亡的影响.方法 构建针对VEGFR-1基因干扰序列和无关序列的shRNA慢病毒载体,与慢病毒包装质粒通过脂质体转染293T细胞,包装产生的病毒液感染U937细胞(U937-shVEGFR-1 KD组).采用实时荧光定量PCR、Western blot法检测RNA干扰对U937细胞VEGFR-1 mRNA和蛋白表达的影响;ELISA法检测细胞培养上清液VEGF表达水平的变化;CCK-8法检测常规培养条件下和不同浓度阿糖胞苷(Ara-C)作用下细胞增殖率和抑制率变化;流式细胞术检测经Ara-C作用后细胞凋亡率变化;Transwell小室检测不同条件下细胞迁移数量的变化.结果 成功构建VEGFR-1基因shRNA慢病毒载体,转染U937细胞后,U937-shVEGFR-1 KD组细胞VEGFR-1 mRNA和蛋白表达均显著下降;细胞培养上清液VEGF表达水平明显下降,细胞增殖速度减慢;Ara-C作用下,U937-shVEGFR-1 KD组细胞增殖抑制率及凋亡率较U937无关序列shRNA阴性对照(NC)组和U937空白对照(CON)组细胞明显增高.无药物及VEGF作用下,U937-shVEGFR-1 KD组细胞迁移数量均低于U937 NC组和U937 CON组细胞;Bevacizumab作用下,U937 NC组和U937 CON组细胞迁移数量降低,而U937-shVEGFR-1 KD组细胞迁移数量无明显变化.结论 慢病毒载体介导的shRNA干扰VEGFR-1基因可有效抑制U937细胞增殖、迁移,并能够增强U937细胞对Ara-C的敏感性.     

MiR-195对人脑胶质瘤细胞 U251和 SHG-44增殖的抑制作用

目的探讨 miR-195过表达对体外培养的人脑胶质瘤细胞U251和 SHG-44增殖的影响。方法通过脂质体将miR-195 mimics转染至U251和SHG-44细胞,同时设立空白对照组和阴性对照组,实时荧光定量PCR检测转染前后miR-195的表达水平;用CCK-8法评价细胞的增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期。结果胶质瘤细胞转染miR-195 mimics后,发现U251细胞和SHG-44细胞中miR-195的表达分别为5.93＆#177;0.43和6.43＆#177;0.48,较空白对照组和阴性对照组均增高约6倍左右。与空白对照组和阴性对照组相比,转染miR-195 mimics后的胶质瘤细胞的增殖能力明显受到抑制,细胞周期阻滞于G0/G1期,S期细胞减少。结论过表达miR-195可以阻滞胶质瘤细胞周期进展,从而抑制其增殖,为胶质瘤的基因治疗提供新的策略。     

雷公藤内酯醇对神经胶质瘤U87细胞侵袭性抑制的体外研究

目的 研究雷公藤内酯醇（triptolide）对体外培养的胶质瘤U87细胞侵袭性的抑制作用,并探讨其作用分子机制. 方法 使用MTT法检测雷公藤内酯醇对胶质瘤U87细胞增殖抑制作用, Transwell实验检测雷公藤内酯醇处理后细胞侵袭能力的变化,进一步通过Real-Time PCR和Western印迹法检测雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞的组织蛋白酶B（Cathepsins B,CB）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达的影响. 结果 雷公藤内酯醇以剂量-效应方式抑制胶质瘤细胞增殖,同时可减弱U87胶质瘤细胞的侵袭能力,下调其CB、MMP-9表达水平. 结论 在体外实验中雷公藤内酯醇抑制U87胶质瘤细胞侵袭性生长的机制与下调CB及MMP-9的表达,降低胶质瘤细胞水解细胞外基质的能力有关.     

应用RNA干扰技术抑制白血病细胞血管内皮生长因子基因表达及功能的研究

目的探讨用RNA干扰技术下调血管内皮生长因子(VEGF)基因表达对白血病细胞生长的影响。方法设计3段分别针对VEGF第3~5外显子的短发夹状RNA(shRNA)并构建其表达载体,分别转染人白血病细胞株NB4,用实时定量PCR及Western blot方法观察3段shRNA对细胞内VEGF基因表达的影响。抗性筛选稳定抑制VEGF表达的永久细胞克隆,应用MTT法、甲基纤维素半固体培养法及细胞周期动力学检测了解VEGF基因缄默对白血病细胞生长的影响。结果成功构建分别携带3段shRNA及对照随机片段的重组质粒pGenesil-VR1,2,3和pGenesil-con,3种shRNA重组质粒中pGenesil-VR3可明显降低细胞内VEGF mRNA的丰度及VEGF蛋白表达,筛选出的NB4-VR3细胞株增殖能力明显下降,细胞集落形成率为(13.3±3.8)%,与NB4-con的(21.3±6.4)%和NB4组的(24.5±5.2)%相比,差异有统计学意义(P<0.05),细胞周期阻滞于G1期,3组细胞G1期比例分别为(53.2±4.6)%、(42.7±5.9)%和(40.5±5.3)%。结论应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断VEGF基因表达及功能的shRNA,VEGF基因表达下调能明显抑制白血病细胞生长。