GST融合的人血浆蛋白S成熟肽的原核表达

目的：构建人蛋白S(protein S，PS)的原核表达载体并诱导其表达。方法：自行设计引物，通过PCR技术，以人PS真核表达载体为模板扩增PS成熟肽编码序列，PCR产物经EcoR1／BamHI双酶切后，将其克隆至GST融合表达载体pGEX—2T中，在E．coli BL21中诱导GST—PS融合蛋白的表达。结果：聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％SDS—PAEG)显示。在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达出一个分子量约为96kD产物，与预期大小相符，该产物可通过GST亲和层析柱纯化。对重组质粒的序列分析表明，插入片段的序列与Genebank登录的人PS基因编码序列完全一致。结论：人PS编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T，并在E．coli BL21中获得表达，为进一步研究奠定了基础。     

受精抗原-1基因的克隆和GST融合表达

目的：克隆和原核表达小鼠受精抗原-1(FA-1)基因。方法：自行设计引物，用RT-PCR从小鼠睾丸组织总RNA扩增FA-1基因的编码序列。将扩增产物克隆至GST融合表达载体pGEX-2T。以IPTG诱导GST融合FA-1的表达。结果：凝胶电泳显示PCR扩增产物的分子量与预期的508bp-致。重组质粒经BamHI／EcoR I双酶切后产生一个约500bp的片段。对重组质粒的序列测定表明，插入片段的序列与发表的FA-1基因编码序列相符。在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达出一个分子量与43kDa相近的产物(预期44.2kDa)。该产物可通过GST融合蛋白纯化试剂盒得到纯化。结论：小鼠FA-1编码序列已被成功地克隆至GST融合表达载体pGEX-2T。     

小鼠TSR2-3/TSP-1基因片段的克隆及其GST融合蛋白的表达和纯化

目的：获取小鼠TSR2—3／TSP-1基因片段，并高效表达和纯化GST—TSR2—3融合蛋白。方法：应用RT—PCR技术，从小鼠肺总RNA中，获得编码TSR2—3的基因片功能片段，测序后，通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2，构建重组表达载体，并导入E.coli BL21宿主菌中，IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白，亲和层析纯化表达产物，SDS—PAGE和Westem blot进行分析鉴定。结果：获得小鼠TSR2-3基因片段，测序结果与GenBank的基因序列一致，重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Westem blot分析，在相对分子量39kDa处，出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白。结论：成功克隆小鼠TSR2—3基因片段，并在Ecoli BL21中高效表达，亲和层析后获得高纯度GST—TSR2—3融合蛋白。     

人氨肽酶N基因克隆和原核表达

目的：构建人氨肽酶N(APN)-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(APN-GST)，并进行原核表达。方法：根据人APN mRNA序列设计合成特异性引物，从人肝组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链，RT-PCR扩增人APN基因，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T，转化宿主菌BL21(DE3)细胞，异丙基锍基半乳糖(IPTG)诱导表达APN蛋白。包涵体经尿素变性、重折叠和亲和层析纯化。结果：重组质粒测序和酶切结果显示：APN基因已正确插入pGEX-4T，重组蛋白及纯化产物SDS-PAGE在135000处有一条明显的蛋白表达条带。结论：人APN基因已被成功地克隆、表达和纯化。     

人MMP-11原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11的构建及其融合蛋白的表达和纯化

目的构建表达人基质金属蛋白酶-11(MMP-11)N-端肽段的重组原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,获得人源性MMP-11融合蛋白。方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从正常人子宫内膜组织扩增目的基因片段,利用体外基因重组技术将目的基因片段连接到原核表达载体pGEX-5X-3上构成重组的原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,并通过酶切和测序进行鉴定。将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,用异丙基硫代半乳糖苷诱导其融合蛋白的表达并进行纯化。结果RT-PCR获得预期大小的特异性DNA片段,经双酶切鉴定及测序证实已将人基质金属蛋白酶-11N-端肽段的cDNA片段正确插入原核表达载体中。融合表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,证实相对分子量大小为4550。结论成功构建了表达人MMP-11N-端肽段的重组原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,获得相对分子量为4550的GST-MMP-11融合蛋白,为进一步制备抗人MMP-11抗体及其在临床中进一步推广应用于恶性肿瘤的快速诊断及临床疗效的评价奠定了基础。     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

GST-HDAC4融合蛋白载体的构建及其蛋白表达

 目的构建人HDAC4蛋白与谷胱甘肽转移酶（GST）重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达和纯化。方法用Eco RI单酶切pcDNA3.1-HDAC4质粒,得到hHDAC4全长编码序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-5X-1构建成新载体GST-HDAC4,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌BL21,通过异丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并纯化获得目的蛋白。Western blot检测重组质粒的表达。结果酶切鉴定和测序结果显示, GST-HDAC4融合蛋白原核表达载体构建成功。考马斯亮蓝染色和Western blot结果显示,成功获得有生物活性的GST-HDAC4融合蛋白。结论成功构建了HDAC4原核表达载体,获得有生物活性的GST-HDAC4蛋白。     

抗菌肽GLL-37在大肠杆菌中的高效融合表达及纯化

目的:研究抗菌肽GLL-37的原核表达及产物纯化。方法:将人工合成的编码2个串联GLL-37的基因片段克隆入原核表达载体pGEX-2T中,构建表达载体pGEX-2T/GLL-37,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-GLL-37-M-GLL-37,产物经Glutathione Sepharose4B亲和层析分离纯化后,再经CNBr切割,阳离子交换层析,得到纯化的重组GLL-37。并采用微量稀释法测定重组GLL-37对6种革兰氏阴性和阳性菌的最低抑菌浓度。结果:在大肠杆菌中成功表达和纯化了具有完全抗菌活性的重组GLL-37,其产量为8.5mg/L的培养物。结论:通过原核表达可高效、低成本地获得具有生物活性的重组GLL-37。     

小鼠CD36基因片段合成、表达及GST融合蛋白的表达和纯化

目的获取小鼠CD36基因片段,并高效表达和纯化GST-CD36融合蛋白。方法设计合成CD36的基因功能片段,测序后,通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2,构建重组表达载体,并导入E.coli BL21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果获得小鼠CD36基因片段,测序结果与GenBank的基因序列一致,重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量28.5kDa处,出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论合成小鼠CD36基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST-CD36融合蛋白。     

h-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定

 目的 构建GST/-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法 提取人结肠癌细胞SW480的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增h?-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将h?-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X-1-?-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入E.coli BL21 中,异丙基硫代β-D 半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST/?-arrestin1A、B, SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力。结果 酶切及测序结果证明,成功构建了?-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实：经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/?-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组?-arrestin1A、B蛋白亚型的结合能力结论 成功构建pGEX-5X-1-?-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示?-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究?-arrestin1的生物学功能奠定了基础。     

GST-hCAP融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的人c-Cbl相关蛋白(GST-hCAP)融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达.方法:从COS-1细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hCAP基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hCAP,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-hCAP构建成功,用Western blot方法也证实了GST-hCAP融合蛋白的表达.结论:成功地构建了GST-hCAP原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化CAP及研究其结构与功能提供了前提基础.     

GST融合蛋白制备表皮生长因子受体抗体

目的：探讨制备大量表皮生长因子受体(EGFR)特异性抗体的方法。方法：将编码EGFR的N端肽段的cDNA克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后,经亲和层析柱纯化,用该GST融合蛋白免疫BALB／C小鼠,获得免疫血清,以ELISA和Western Blot检测抗体滴度。结果：获得GST—PTB融合蛋白纯度大于95％;经免疫小鼠抗血清滴度1：38827～1：190602,得到大量高滴度的EGFR特异性抗体。结论：用原核系统表达GST融合蛋白直接免疫小鼠可以快速、大量地制备EGFR特异性抗体。     

日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及亚单位疫苗的构建和分析

目的 构建日本血吸虫大陆株Sj-Rho GTPase-like真核及原核表达重组质粒，并进行鉴定分析。方法 用PCR法将Sj-Rho GTPase-like基因从已剪切阳性克隆中扩增出来，亚克隆至pcDNA3.1和pGEX-5X-3中，分别经PCR、双酶切、测序、SDS-PAGE和Western blot等方法鉴定。结果 PCR和测序均证明Sj-Rho GTPase-like基因疫苗构建成功，重组蛋白经SDS-PAGE电泳可观察到与预期分子量相应的条带，转印后可被水牛感染血清识别。结论 成功构建了Sj-Rho GTPase-like基因的两种重组载体，为保护性免疫研究打下基础。     

GST-LMO1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

 目的构建GST-LMO1 融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌（Ecoli ）中诱导表达。方法以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA 序列测定正确后,转入Ecoli BL21中,经异丙基硫代茁-D 半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE 和Western blot 鉴定。结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,并用Western blot 方法证实了GST-LMO1 全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了LMO1 全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LMO1 结构与功能的研究提供了前提基础。     

人tau融合蛋白的原核表达及纯化

目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE染色及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。分别使用His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白结合来纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pET28a-tau和pGEX-5X-1-tau并在大肠杆菌BL21中诱导其大量表达。经His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B纯化后,可以得到较纯化的His-tau和GST-tau融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗tau单克隆抗体(tau-5)所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。结论构建了人tau两种原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该蛋白,为进一步的tau与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌16KD蛋白的基因克隆及表达与纯化

目的:通过构建结核分枝杆菌(MTB)16KD蛋白的表达载体,在大肠杆菌(E.coli)中表达MTB16KD蛋白,并获得大量纯化的16KD蛋白。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出16KD蛋白的编码基因,用限制性内切酶消化后插入载体pGEX-4T-2中,测序结果证实后,将重组质粒转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达GST-16融合蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析融合蛋白的相对分子质量及表达形式。Western blot鉴定16KD蛋白活性。经GST亲和层析柱过柱,得到纯化的16KD蛋白。结果:构建了具有正确基因序列的表达载体,在E.coli DH5α中诱导表达的融合蛋白GST-16占菌体总蛋白的42%。Wstern Blot结果证明:融合蛋白GST-16能与抗结核分枝杆菌的抗体发生特异性结合。紫外分光光度仪测量纯化16KD蛋白的浓度为688mg/L。结论:结核分枝杆菌16KD蛋白在E.coli DH5α能高效表达,该蛋白具有特异的免疫学活性。     

高GC hTwist表达载体构建及其表达条件优化

 目的 构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法 以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx 加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实：我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论 上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定了基础。     

高GChTwist融合蛋白载体构建及其表达条件优化

目的 构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备.从而进一步研究其生物学功能.方法 以胃癌细胞系SGM7901cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物.本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X- 1-Twist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Westem blot鉴定.结果 通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist.诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白.结论 上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础.     

pGEX-5X-1-hLMO4原核质粒构建及重组蛋白表达

目的:构建hLMO4的原核表达载体并诱导、纯化和鉴定其表达。方法:hLMO4全长编码基因经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)在BL21大肠杆菌中诱导GST-hLMO4融合蛋白表达,利用Glutathione Sepharose 4B纯化诱导的融合蛋白,并经Western blot鉴定结果。结果:hLMO4编码序列克隆至pGEX-5X-1载体中,双酶切鉴定片段大小为500 bp,在E.coli BL21中IPTG诱导融合蛋白的表达,分子质量约为49 000 Da,成功纯化出GST及GST-hLMO4蛋白,Western blot检测到蛋白表达。结论:构建了hLMO4基因原核表达载体,鉴定了GST-hLMO4融合蛋白表达。     

人源MAP3K7克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

 目的构建MAP3K7 蛋白GST 的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7 融合蛋白,为GST Pulldown 实验做准
备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-
5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21 宿主菌中,IPTG 诱导表达融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达
产物,SDS-PAGE 和Western blot 分析鉴定。结果经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,诱导后的
GST 融合蛋白经SDS-PAGE 和Western blot 检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论
成功构建了MAP3K7全长的GST 重组表达载体,确定了GST-MAP3K7 融合蛋白表达的最佳条件,诱导成功并得到了高纯度的
融合蛋白,为进一步研究MAP3K7 蛋白的生物学功能奠定了基础。