乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异对病毒抗原表达的影响

目的为研究乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)20/21bp部分缺失(nt1748/1747至nt1767)及同时存在的A1896点变异对病毒抗原表达的影响。方法利用前期构建的HBV全基因的重组载体转染HepG2细胞后,对病毒抗原进行ELISA检测及Western-blotting分析。结果变异株分泌到细胞外的HBsAg、HBeAg及细胞内的HBcAg表达量较野毒株均明显减少。结论HBVCP20/21bp部分缺失株及同时存在的A1896点变异株的病毒抗原表达较野毒株显著下降。     

HBV核心启动子部分缺失重组质粒的构建

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）核心启动子（CP）部分失的真核表达质粒。方法：利用线性化的,从CP上游顺序列始且含完整转录单元的HBV基因克隆（P3．8I质粒）为工具,采用分子克隆,人工定点突变,PCR－PFLP鉴定和测序分析等技术构建目载体。结果：成功构建了HBV全基因CP20／21个bp缺失（nt1748/1747-1767)和CP20／21个bp缺失＋1896热点变异的重组真核质粒表达质粒,并经PCR－RFLP序列分析证实。结论：此重组真核表达质粒构建可为体外进一步研究上述变异的生物学意义奠定基础。     

HBV变异对乙肝病毒标志物和DNA定量的影响

目的：了解无锡地区HBV前C／C基因变异情况,探讨基因变异对乙肝病毒标志物（HBVM）及HBV DNA定量的影响。方法：HBVM用时间分辨荧光定量试剂检测;HBV DNA定量PCR以德国Roche Lightcycler荧光定量扩增仪检测;HBV DNA前C／C测序使用①德国Roche Mag NA Pure LC全自动核酸提取,加样系统;②美国Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System。结果：92例乙肝患者血清中有41例（44．6％）发生前C／C区nt1896位变异,41例中有34例HbeAg阴性,7例HbeAg仍为阳性;以nt1896位是否变异分组,变异组和未变异组HBV DNA定量无显著性差异。结论：nt1896位变异导致HBeAg转阴,HBV病毒变异对HBVM有决定性的影响,但该变异对HBV复制无影响。     

乙型肝炎肝硬化病人的乙型肝炎病毒C基因启动子和前C基因变异及其对e抗原系统的影响

目的研究乙型肝炎肝硬化病人血清的乙型肝炎病毒（HBV）C基因启动子（CP）和前C基因变异。方法通过DNA扩增、基因序列分析检测34例活动性肝硬化和75例慢性乙肝病人血清的HBV CP和前C基因序列,通过微粒子发光法定量检测血清中HBeAg的含量,及通过荧光定量PCR技术定量检测血清中的HBV DNA。结果（1）CP双变异（nt 1762A→T和1764G→A）在肝硬化（LC）组的发生率显著高于慢性乙型肝炎（CH）组（76．5％vs48．0％）;前C终止变异（nt1896G→A）则在LC组和CH组的发生率无显著差异（35.3％vs26．7％）。（2）CP双变异虽使HBeAg表达显著下降,但幅度较小;与对照组相比,CP双变异组的HBeAb阳性率也无明显升高;前C终止变异则大幅度影响HBeAg表达,显著增高HBeAg／HBeAb转换率;终止变异联合双变异组的HBeAg含量及HBeAb阳性率同终止变异组相似。（3）HBeAb阳性LC组的前C终止变异的发生率显著高于HBeAb阴性LC组（75．0％vs5．6％）;而CP双变异则在两组LC中无明显差异（75．0％vs77．8％）。结论CP双变异可能与乙型肝炎肝硬化发病机制有关;前C终止变异则与肝硬化病人的HBeAg／HBeAb转换有关。     

乙型肝炎病毒前C区变异对HepG2细胞HLA-Ⅰ表达的影响

目的 :研究乙型肝炎病毒 (HBV)前C区热点变异对宿主细胞HLA Ⅰ分子表达的影响 .方法 :构建HBV前C区野毒株及A83,A83/A86变异株真核表达质粒 ,转染HepG2细胞 ,鉴定目的基因在宿主细胞中的生物活性 ,流式细胞术检测HLA Ⅰ分子的表达 .结果 :PCR和ELISA法分析能检测到目的DNA片段和HBeAg ,转染细胞表达HLA Ⅰ分子的平均荧光强度不同 ,野毒株为 1.3,前C区变异后平均荧光强度增加 ,尤以A83变异表达增强显著 (17.6 ) ,A83/A86为 7.3.结论 :前C区热点变异后宿主细胞HLA Ⅰ分子的表达为上调乙型肝炎病毒前C区变异对HepG2细胞HLA…     

乙型肝炎病毒前C区1896点突变的检测

目的：探讨乙型肝炎病毒(HBV)前C区1896点突变的临床意义。方法：利用PCR-ELISA技术检测38倒HBeAg阴性而HBV DNA阳性的乙型肝炎病毒感染者HBV前C区1896点突变。结果：38例HBeAg阴性而HBV DNA阳性的乙型肝炎病毒感染者检出28例HBV前C区1896变异病毒株，检出率为73．7％。结论：临床HBeAg阴性，HBV DNA阳性感染者多数为HBV l896变异病毒株感染，这些感染者具有传染性，故HBeAg阴性不能作为排除HBV复制和传染性的唯一指标。     

持续感染乙肝病毒e抗原血清转换与基因变异的关系

目的：了解乙肝病毒慢性持续感染e抗原血清转换中前C基因及C基因启动子变异的关系。方法：HBV－DNA阳性且e抗原／或e抗体阳性的慢性乙型肝炎患者各30例，以PCR结合微板核酸杂交－ELISA方法检测乙肝病毒前C基因（nt1896,nt1899)及其基本核心启动子（BCP，nt1762,nt1764)变异。结果：不论前C基因还是BCP变异，均与e抗原血清转换相关（P＜0．05）；不论e抗体阳性组还是e抗原阳性组，BCP变异均高于前C基因变异（P＜0．05），但二者均不相关（P＞0．05）。结论：乙肝病毒C基因启动子与前C基因的变异是随机的，都可下调HBeAg的表达，前者更易于发生变异。     

乙型肝炎病毒拉米夫定耐药毒株的全基因质粒构建及其在HepG2细胞中复制与表达

目的 探讨拉米夫定耐药变异对病毒复制及抗原表达的影响.方法 通过定向点突变方法,成功的在模板质粒P3.8Ⅱ基础上构建成功3种P基因变异株质粒,并转染HepG2细胞,与HBV野毒株相比,分析变异毒株复制表达活性的差别.结果 经DNA测序证实,成功构建了rtG172E、rtG174C、rtG172E/rtG174C等3种变异株质粒,转染细胞系后发现上清均表达有HBsAg和HBeAg,证明转染质粒在细胞内成功表达并分泌HBsAg和HBeAg.通过检测细胞内复制产生的子代HBVDNA发现,rtG172E、rtG174C、rtG172E/rtG174C等3种变异株的复制活性均有明显减弱.结论 新发现的3种P基因变异株会影响HBV复制活性,对药物敏感性的影响需进一步研究.     

慢性乙型肝炎患者IFN治疗与HBV DNA前C区变异关系的研究

目的：通过检测慢性乙型肝炎患者干扰素（IFN）治疗前后HBVDNA前C区1896位变异,探讨其与IFN治疗之间的关系。方法：采用PCR—RFLP法检测慢性乙型肝炎患者前C区1896位变异,观察IFN治疗前后变异株的变化及IFN疗效。结果：200例慢性乙型肝炎患者IFN治疗前变异株检出率为19％,IFN治疗后未检出新出现的变异株;变异株、野毒株感染的慢性乙型肝炎患者IFN治疗有效率分别为60％与50％,均显著高于对照组（P=0．007,P〈0．001）,变异株、野毒株感染的慢性乙型肝炎患者IFN治疗有效率比较无差异（P〉0．05）。结论：IFN治疗无诱导前C区1896位变异的作用;干扰素治疗变异株病毒感染的慢性乙型肝炎有效,其近期疗效与野毒株感染的慢性乙型肝炎基本相同。     

乙型肝炎病毒前C区/BCP区突变及其临床意义

目的探讨利用基因芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)前C区/BCP区基因突变方法的临床价值及前C区/BCP区基因突变的临床意义。方法应用基因芯片技术检测95例慢性乙型肝炎患者的HBV前C区G1896A(nt1896G→A)、A1814C(nt1814A→C)及HBV C基因启动子(BCP)T1762A、G1764A(nt1762A→T、nt1764G→A)四位点突变,同时检测血清HBV DNA含量及ALT、AST水平。结果95份血清标本中,有91份分别检测到了HBV前C区/BCP区基因突变,阳性率95.8%,其中61896A突变33例(36.3%),A1762T G1764A联合突变64例(70.3%),G1896A A1762T G1764A联合突变22例(24.2%),未检测到A1814C突变毒株。抗-HBe阳性的慢性乙肝患者HBV前C区/BCP区突变率较HBeAg阳性的患者明显增高。G1896A突变后血清ALT水平与未变异组比较有显著性差异(P<0.05),而其他各组的肝功能无显著变化。G1896A A1762T G1764A联合突变后,血清HBV DNA水平较未变异组降低(P<0.05),其他各组间则无显著变化。结论应用基因芯片法测定HBV特定变异位点,可一次同时检测多个突变位点,具有一定的临床应用价值。HBV前C区/BCP区突变对血清HBVDNA水平和肝功能有一定的影响。     

HBV全基因C区突变株在永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达

目的 构建携带V60、G87和L97突变位点的HBV全基因组真核表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系（LCLs）。方法 用定点突变技术将HBVp3．8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60、G87、L97进行突变（p3．8Ⅱ-V60,G87,L97）,转化E．coli．XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶Sac I和Kpn I分别将野生型和突变型p3．8Ⅱ质粒进行双酶切,插入EBV-plpp真核细胞表达载体,转染LCLs,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞能够稳定表达。结果与结论 DNA序列分析表明,野型HBV DNA核心区第60、87、97位氨基酸发生了预期的突变,Western Blotting和微粒子免疫荧光法证明转染的LCLs能稳定表达HBV抗原,证实成功构建了预期细胞模型。     

乙型肝炎病毒X基因变异和慢性乙型肝炎患者临床与组织病理学指标的相关性

 目的 探讨慢性乙型肝炎患者肝组织内乙型肝炎病毒（HBV）X基因部分区段的变异与HBV相关各临床与组织病理学指标的关系。方法 以83例慢性乙型肝炎肝穿刺活检标本作为研究对象，20例HBV相关性肝细胞癌作为对照；HBV X基因变异的研究采用PCR扩增和直接双向测序。免疫组化二步法显示肝组织内四种病毒蛋白的表达；荧光实时定量PCR检测肝组织内HBV DNA含量。结果 HBV X基因nt1583～1793区段错义突变主要出现在对应的X蛋白aa87（nt1632、1633）、88（nt1635、1636）、116（nt1719）、118（nt1726、1727）、119（nt1730）、127（nt1752）、130（nt1762）和131（nt1764）位氨基酸。nt1725～1730（aa118/119）突变与肝组织内HBcAg显著低表达（P=0.006），和HBV DNA低拷贝数（P=0.004）明显相关，尤以ACTGAC（TD）型突变最为明显；相反，nt1762/1764（aa130/131）位点突变则伴肝组织内HBcAg显著高表达（P=0.005）和高水平的HBV DNA含量（P=0.006）。同时，肝癌组中nt1725～1730 野生型所占比率明显高于慢性肝炎（P<0.05），而nt1762/1764 突变型所占比率肝癌组与肝炎组相比显著增高（P<0.01）。结论 肝组织内，在nt1725～1730突变能显著降低HBcAg 的表达和HBV DNA水平，nt1762/1764突变则相反。肝组织内HBV的高负载可能与肝细胞癌的发生有关     

乙型肝炎病毒C基因启动子和前C基因变异对HBeAg含量和HBVDNA定量及肝炎病情的影响

目的　研究乙型肝炎病毒 (HBV)C基因启动子 (CP)和前C基因变异对HBeAg含量和HBVDNA定量及肝炎病情的影响。方法　通过DNA扩增、基因序列分析检测 75例慢性乙肝、 14例慢性重型乙肝和 34例肝硬化患者的血清HBVCP和前C基因序列 ,通过微粒子发光法定量检测血清中HBeAg的含量 ,通过荧光定量PCR技术检测血清HBVDNA含量。结果　 (1)中度和重度慢性乙型肝炎 (CH)患者CP双变异 (nt176 2A→T和 176 4G→A)的发生率同轻度CH组比较显著升高 (分别为 6 1 3%和 6 1 1%VS 2 3 1% ) ;肝硬化组患者CP双变异发生率同CH组比较显著升高(76 5 %VS 4 8 0 % )。前C基因终止变异 (nt1896G→A)在重型乙型肝炎患者中的发生率显著升高 (71 4 % )。 (2 )双变异组和终止变异组患者HBeAg含量均显著下降 ,但后者下降更明显。双变异组的HBeAb阳性率和对照组比较无明显差异 ,但终止变异组的HBeAb阳性率同双变异组和对照组比较差异显著。终止变异联合双变异组的HBeAg含量及HBeAb阳性率同终止变异组相似。 (3)双变异组和对照组患者HBVDNA含量间无明显差异。结论　CP双变异和前C基因终止变异均影响HBeAg表达 ,但后者影响更大 ;在对病情影响上 ,前者与肝硬化发病有关 ,后者则与重型乙肝发病有关。     

乙型肝炎病毒C基因启动子变异与基因型和肝硬化的关系

目的 研究HBV C基因启动子(CP)和前C基因变异与HBV基因型和病情的关系。方法 通过DNA扩增、基因序列分析检测44例慢性乙型肝炎(CH)，29例肝硬化(LC)患者的血清HBV S基因序列以确定其基因型，测定HBVCP和前C区序列以确定其变异状况。结果 (1)CP双变异(nt 1762A→T和1764G→A)的发生率肝硬化组为75．9％，慢性乙型肝炎组为45.5%，两组间差别有显著性意义(P＜0.05)。(2)LC患者的C基因型检出率为69．0%，CH患者的C基因型检出率为43.2％，二者间差别有显著性意义(P＜0.05)。(3)C基因型HBV感染者CP双变异发生率为69.2％，B基因型HBV感染者CP双变异发生率为44．1％，二者间差别有显著性意义(P＜0.05)。结论 CP双变异与C基因型密切相关，并且导致病情向肝硬化发展。     

酒精对慢性乙型肝炎患者乙肝病毒多位点基因突变影响研究

目的：探讨酒精对HBV DNA多位点基因变异的影响,为慢性乙型肝炎的临床诊断和治疗提供依据。方法:选取45例慢性乙肝患者为研究对象,分为嗜酒组和非嗜酒组,采用DNA芯片技术, 检测HBV DNA前C区1896及1814位点、BCP区1762及1764位点、P区528及552位点的基因变异。结果:嗜酒组在BCP区1762 、1764位点的变异率明显高于非嗜酒组(P均＜0.05)。在前C区1896、1814位点,P区528、552位点变异率差异无统计学意义（P均＞0.05）。结论:酒精可导致乙肝病毒BCP区1762 、1764位点发生基因突变,BCP区基因变异可促进HBV在人体内的复制表达,加重慢性乙型肝炎患者的病情。     

深圳市乙肝疫苗免疫失败者S基因分析

目的了解乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因的变异情况。方法采用流行病学、ELISA与分子生物学方法,筛选乙肝疫苗免疫失败者。采用聚合酶链反应（PCR）、基因克隆和测序的方法,对乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因进行分析,并与HBV参考序列s基因进行比较,分析其变异情况。结果从2564份受检者中．筛选出2例（0．78％e）HBsAg（-）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）乙肝疫苗免疫失败者（HBsl、HBs2）,经HBVDNA荧光定量PCR检测和HBVS基因PCR扩增,结果均为阳性,为B基因型。其S基因序列与参考序列（JX429908．1）相比,同源性为98．57％,且乙肝疫苗免疫失败者s基因在第363位和第467位分别由野生型的C变为A、G变为A,HBsAg121位和156位氨基酸C和w缺失。结论乙肝疫苗免疫失败者HBVS基因上第363位和第467位碱基存在错义突变（C→A和G→A）,改变了HBsAg的结构和抗原性。     

非抗病毒治疗相关的慢性乙型肝炎患者YMDD变异研究

目的：了解未经抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患乙型肝炎病毒基因YMDD变异及其与前C区变异、HBV基因型的相关性，HBV DNA水平与变异发生的关系。方法：从126例均未接受拉米夫定治疗和近一年内未经任何抗病毒治疗的慢性乙肝患随机抽取25例为研究对象。血清YMDD变异检测运用微板核酸杂交—核酸定量法，HBV基因型采用PCR微板核酸杂交—ELISA技术，HBVDNA定量采用荧光定量PCR分析系统，HBV—M采用ELISA法。结果：7例存在YMDD变异，变异HBeAg全部阳性，不同的HBV基因型形式存在不同的YMDD变异率，HBVDNA水平与YMDD变异的发生不呈正相关。结论：HBV存在YMDD野生变异株，并非完全由抗病毒治疗引起，变异株与前C区变异和HBV基因型的相关性以及HBV DNA水平和变异发生的关系有待进一步研究。     

乙型肝炎病毒核心基因启动子变异对HBeAg表达及病情的影响

目的:研究乙型肝炎病毒核心基因启动子(HBVBCP)变异对HBeAg表达及病情的影响。方法:采用PCR微板核酸杂交结合ELISA检测显示技术,对176例HBV慢性感染者血清进行检测HBVBCP区核苷酸(nt)1762碱基A→T和1764G→A联合突变。采用ELISA检测技术,检测患者血清HBV标志物。结果:在176例HBV慢性感染者中检出HBVBCP区T1762A1764G变异者73例,HBVBCP变异的阳性率为41.5%,HBVBCP变异在HBeAg阴性病例的阳性率为49.4%,显著高于HBeAg阳性病例的阳性率33.3%。HBVBCP双变异在慢性乙型肝炎轻、中、重度组,肝炎肝硬化组,慢性重症肝炎组和原发性肝癌组的阳性率分别为28.0%、31.4%、34.2%、39.4%、60.0%和70.0%。各型肝病与HBVBCP变异的阳性或阴性进行相关分析,结果有显著性差异。结论:本组病例HBVBCP变异的阳性率为41.5%,变异可引起HBV感染者的HBeAg阴转。HBVBCP变异与HBV慢性感染的临床类型呈正相关,随着病情加重,BCP变异的阳性率有增高趋势。