60 mer长寡核苷酸微阵列构建的优化

目的　优化长寡核苷酸芯片方阵的构建。方法　采用4种不同玻片表面,4种点样液溶解经设计高度特异性探针,制备长寡核苷酸芯片。样品经RD -梯度PCR扩增标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析。结果　点样液3×SSC与丙烯酰胺聚合物表面(国产玻片)联合使用杂交效果最佳。结论　该研究优化了长寡核苷酸芯片微阵列的构建,为芯片的下游技术发展提供支持。     

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究,为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA,采用限制性显示技术标记,标记样品与芯片杂交后,用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号,而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显,在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号,反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。     

基因芯片在胃癌研究中的应用

基因芯片，又称DNA芯片、DNA微阵列，是指将大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于硅片、玻片、塑料片等固相支持物上制成的芯片。将此芯片与标记好的待测样品的基因按碱基配对的原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描。并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出检测和比较，即能迅速得出所要的信息。     

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的 对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究，为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法 根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针，人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA，采用限制性显示技术标记，标记样品与芯片杂交后，用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果 芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号，而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论 病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显，在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号，反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。     

用生物素化补骨脂素标记核酸探针的方法研究

补骨脂素在长波紫外光照射下与核酸分子的碱基发生共价结合。本实验对生物素化补骨脂素标记核酸的条件和效果进行了研究,发现该试剂不仅能标记双链DNA、单链DNA,更重要的是可以直接标记RNA及寡核苷酸。探针显色灵敏度可达1pg,杂交灵敏度可达2～5pg。     

三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响

目的 观察标记引物法、随机渗入标记法、末端转移标记法三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响。方法 将淋球菌gyrA基因91位密码子突变型探针倍比稀释成终浓度为1000／μmol／L～0．25μmol／L的梯度浓度点样并制作寡核苷酸芯片，PCR扩增荧光标记包含gyrA基因突变的目的DNA片段，与芯片杂交，分别记录三种标记方法的杂交信号强度。结果 标记引物法的荧光信号最强，随机渗入标记法的荧光信号强度次之，其Cy5—duTP最佳浓度为0．1mmol／L(dTTP：Cy5—dUTP=10：1)，末端转移标记法反应时间在60min和120min时荧光信号值相近。点样的探针浓度达到31μmol／L，以上，荧光信号为平台期。结论 明确了三种荧光标记法对寡核苷酸芯片杂交信号的影响，有助于选择寡核苷酸芯片的荧光标记方法。     

金黄色葡萄球菌nuc基因特异性核酸探针的制备及应用

目的　建立核酸探针检测实验动物金黄色葡萄球菌的方法。方法　将重组质粒pGEM NUC中金黄色葡萄球菌nuc基因特异性片段酶切回收 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验探针 ,对细菌菌株及临床样品进行了检测。结果　核酸探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌等其他细菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交检测的灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 32 2份SPF小鼠的临床样品进行了检测 ,检出率为 3 1% (10 /32 2 ) ,符合率为 10 0 % ,与细菌学检查的结果相一致。结论　建立的DNA探针检测金黄色葡萄球菌方法具有高度的特异性和敏感性 ,且较快速 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的监测。     

梅毒螺旋体寡核苷酸芯片探针的设计及筛选

【目的】设计梅毒螺旋体寡核苷酸探针,筛选出适合芯片检测的高敏感性和特异性寡核苷酸探针。【方法】根据梅毒螺旋体特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。提取梅毒螺旋体的DNA,采用通用引物联合标记法进行标记,标记样品与芯片杂交,用芯片扫描仪检测杂交结果。【结果】设计出23条50 mer梅毒螺旋体寡核苷酸探针。标记样品与芯片杂交部分探针有较强的杂交信号,并筛选出符合要求的9条梅毒螺旋体寡核苷酸探针。【结论】以上方法能设计和筛选出敏感性和特异性较高的梅毒螺旋体寡核苷酸探针,可用于制备梅毒螺旋体寡核苷酸芯片。     

Digoxigenin-11-dUTP标记寡核苷酸探针的方法及其初步应用(论著摘要)

用多聚酶链反应(PCR)将DNA序列进行特异性扩增,继而用序列特异性寡核苷酸(SSO)探针进行杂交,这一技术已成为详细分析基因变异的强有力手段。基因的传统检测方法是用a-~(32)p ATP在已知DNA片段5’末端进行磷酸化标记制成寡核苷酸探针进行杂交分析。但是,由于放射性同位素的半衰期短,价格昂贵,具有辐射损伤,且实验周期长,因而限制了杂交技术的应用。因此,建立一种不依赖于同位素而又具有相当高的灵敏度,操作简单、快速且稳定的非放射性基因检测方法十分必要。本实验以非同位素DIG-11-d UTP 3’末端酶促标记人工合成的18bp寡核苷酸。其25μl标记体系含SSO 30 pmol、1mmol/L DIG—11-dUTP 2.5μl、TDTase20U、5×TDT缓冲液5μl,37℃温育60min,以SephadexG-25纯化DIG标记物,终浓度1.2 pmol/μl,放-20℃备用。选择标准DNA样     

基因芯片与卫生微生物检验

基因芯片又称DNA微阵列，是采用原位合成或显微点样技术，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面，有序地集成一系列可寻址识别的基因片段，与标记的样品进行杂交后，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速检验或医学诊断，它具有高通量、可并行检测的特点。根据载体上核酸分子的不同，分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片等。它在临床微生物检测中的应用为其在卫生微生物检验中的应用奠定了良好的基础。     

The detection of HBV DNA with gold nanoparticle gene probes

Objective:Gold nanoparticle Hepatitis B virus (HBV) DNA probes were prepared, and their application for HBV DNA measurement was studied. Methods:Alkanethiol modified oligonucleotide was bound with self-made Au nanoparticles to form nanoparticle HBV DNA gene probes, through covalent binding of Au-S. By using a fluorescence-based method, the number of thiol-derivatized, single-stranded oligonucleotides and their hybridization efficiency with complementary oligonucleotides in solution was determined. With the aid of Au nanoparticle-supported mercapto-modified oligonucleotides serving as detection probes, and oligonucleotides immobilized on a nylon membrane surface acting as capturing probes,HBV DNA was detected visually by sandwich hybridization based on highly sensitive aggregation and silver staining. The modified nanoparticle HBV DNA gene probes were also used to detect the HBV DNA extracted from serum in patients with hepatitis B. Results:Compared with bare Au nanoparticles, oligonucleotide modified nanoparticles had a higher stability in NaCl solution or under high temperature environment and the absorbance peak of modified Au nanoparticles shifted from 520nm to 524nm. For Au nanoparticles, the maximal oligonucleotide surface coverage of hexaethiol 30-mer oligonucleotide was (132 ± 10) oligonucleotides per nanoparticle, and the percentage of hybridization strands on nanoparticles was (22 ± 3% ). Based on a two-probe sandwich hybridization/nanoparticle amplification/silver staining enhancement method, Au nanoparticle gene probes could detect as low as 10-11 mol/L composite HBV DNA molecules on a nylon membrane and the PCR products of HBV DNA visually. As made evident by transmission electron microscopy, the nanoparticles assembled into large network aggregates when nanoparticle HBV DNA gene probes were applied to detect HBV DNA molecules in liquid. Conclusion:Our results showed that successfully prepared Au nanoparticle HBV DNA gene probes could be used to detect HBV DNA directly. The detection-visuallized method has many advantages, including high sensitivity,simple operation and low cost. This technique has potential applications in many fields, especially in multi-gene detection chips.     

基因芯片及其在突变检测中的应用

基因芯片技术是近年兴起的一项重要的生物技术。作者介绍了基因芯片的起源、发展及其基本操作，并介绍了铺瓦式阵列、直接等位基因特异性荧光检测法、辅助寡核苷酸链、连接酶检测反应、肽核酸技术等几种不同芯片技术在突变检测中的应用，并探讨了基因芯片技术在合理用药中的应用前景。     

23S rDNA基因芯片对临床常见致病菌的检测

目的 建立含有10种细菌探针的检测用基因芯片模型。方法 使用合成的23S rDNA寡核苷酸探针，制备基因芯片。细菌核糖体DNA经过23S rDNA通用引物扩增后与芯片上的探针杂交，用荧光扫描仪检测信号。结果 基因芯片检测临床致病菌具有较高的特异性和灵敏性。结论 寡核苷酸探针基因芯片检测系统具有一定的种属鉴别能力，比常规培养法快速、准确。     

铜绿假单胞菌lasR基因反义肽核酸序列筛选及其抑制生物被膜形成的研究

目的 筛选靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸序列,探讨其对铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力的影响.方法 针对铜绿假单胞菌lasR基因设计4条反义寡核苷酸序列,利用斑点杂交筛选出与lasR基因结合最佳的反义寡核苷酸序列,以此合成与穿膜肽连接的肽-肽核酸序列.分别用不同浓度的肽-肽核酸导入铜绿假单胞菌生物被膜模式菌PAO1中,测定不同时相点细菌生长光密度[D(600)]值并进行菌落计数,观察肽-肽核酸对其生长的抑制作用.利用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜形成情况.qPCR方法检测lasR mRNA表达.结果 斑点杂交实验结果显示:4条反义寡核苷酸序列中3条有杂交信号产生,其中第1条序列信号最强,以此为基础合成反义肽核酸.不同浓度的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌表现出不同程度的体外抗菌活性,且随着浓度增加,抗菌活性增强.结论 有效筛选出高效反义核苷酸序列,经筛选出的靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸对铜绿假单胞菌的生长及生物被膜形成能力有明显抑制作用,同时抑制lasR mRNA的表达.     

探针的纯化与否对基因芯片重复利用的影响

目的 观察探针的纯度对基因芯片重复利用的影响。方法 将探针为未纯化、纯化两部分并分别与基因芯片杂交，扫描芯片后，用探针剥脱液洗涤芯片；同等条件成像后，进行下一轮杂交。结果 未纯化的探针杂交结果背景高，阳性信号界限不清楚；经探针剥脱洗涤后，仍留有较高强度的背景和原与靶基因片段杂交的阳性信号，即使洗脱4次后，仍有背景和阳性信号存在。纯化的探针杂交结果显示背景低，一般经2次探针剥脱液洗后，可以完全去除信号并进行下一轮杂交。结论 未纯化的探针与基因芯片杂交后，此芯片不能应用于下一轮的杂交；而纯化的探针杂交后，芯片可以再次利用。由此说明探针的纯化是基因芯片重复利用的前提条件。     

血栓性疾病个体化用药指导基因芯片试剂盒的制备和效果评价

目的：探讨血栓性疾病（TD）个体化用药指导基因芯片的制备过程,阐明一种快速、高通量检测氯吡格雷和华法林药物代谢基因的方法。方法：根据氯吡格雷药物代谢基因位点（CYP3A4、CYP2C19*17、CYP2C19*2和CYP2C19*3）和华法林药物代谢基因位点（CYP4F2*3、GGCX、VKORC1-2、VKORC1-1、CYP2C9*2和CYP2C9*3）设计相应的探针和引物,制备TD个体化用药指导的基因芯片检测试剂盒。经过DNA提取、PCR扩增、杂交、洗脱和扫描等步骤对基因芯片的灵敏性、重复性和稳定性进行评价。收集3个地区的150例TD受试者样本并进行药物代谢基因检测,以受试者在临床中接受的用药指导及6个月后患者的疾病恢复情况为依据,评价基因芯片试剂盒的有效率。结果：基因芯片检测2种药物的代谢基因均出现良好的杂交信号;芯片检测PCR扩增产物的最低检测浓度为10³ copies·mL^-1;对不同批次的3张芯片及同一批次的10张芯片进行平行测定,符合率为100%;芯片具有稳定性,有效期长达6个月;来源于3个地区的150例TD样本验证基因芯片检测试剂盒的有效率在90%以上。结论：成功制备了高通量检测氯吡格雷和华法林药物代谢基因的TD个体化用药指导基因芯片试剂盒,该方法灵敏度高,重复性好,稳定性强,制备效果优良。     

血清乙肝病毒DNA的快速提取及定量 PCR测定中应用的探讨

目的寻找简单、快速地提取血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA并能应用于定量PCP,测定的方法.方法使用碱裂解法、酚氯仿法和煮沸裂解法同时提取血清HBV DNA,比较荧光定量PCP测定的重复性和测定值的差异.结果碱裂解法所得HBV DNA量高于酚氯仿法和煮沸裂解法(P＜0.05),并且碱裂解法所得结果的重复性好于酚氯仿法和煮沸裂解法(CV分别为0.21,0.28和0.33).结论碱裂解法提取HBV DNA简单、快速,适用于HBV DNA荧光定量测定.     

Improved DNA hybridization parameters by Twisted Intercalating Nucleic Acid (TINA)

This thesis establishes oligonucleotide design rules and applications of a novel group of DNA stabilizing molecules collectively called Twisted Intercalating Nucleic Acid - TINA. Three peer-reviewed publications form the basis for the thesis. One publication describes an improved and rapid method for determination of DNA melting points and two publications describe the effects of positioning TINA molecules in parallel triplex helix and antiparallel duplex helix forming DNA structures. The third publication establishes that TINA molecules containing oligonucleotides improve an antiparallel duplex hybridization based capture assay's analytical sensitivity compared to conventionel DNA oligonucleotides. Clinical microbiology is traditionally based on pathogenic microorganisms' culture and serological tests. The introduction of DNA target amplification methods like PCR has improved the analytical sensitivity and total turn around time involved in clinical diagnostics of infections. Due to the relatively weak hybridization between the two strands of double stranded DNA, a number of nucleic acid stabilizing molecules have been developed to improve the sensitivity of DNA based diagnostics through superior binding properties. A short introduction is given to Watson-Crick and Hoogsteen based DNA binding and the derived DNA structures. A number of other nucleic acid stabilizing molecules are described. The stabilizing effect of TINA molecules on different DNA structures is discussed and considered in relation to other nucleic acid stabilizing molecules and in relation to future use of TINA containing oligonucleotides in clinical diagnostics and therapy. In conclusion, design of TINA modified oligonucleotides for antiparallel duplex helixes and parallel triplex helixes follows simple purpose dependent rules. TINA molecules are well suited for improving multiplex PCR assays and can be used as part of novel technologies. Future research should test whether combinations of TINA molecules and other nucleic acid stabilizing molecules can increase analytical sensitivity whilst maintaining nucleobase mismatch discrimination in triplex helix based diagnostic assays.     

改良组织芯片技术在胃癌研究中的应用及体会

目的:改良组织芯片制作过程以及探讨其在胃癌研究中的应用价值。方法:利用组织芯片仪制备胃癌组织芯片13枚,采用免疫组化SP法对1枚组织芯片88例胃癌组织及其对应的普通切片检测P16蛋白表达。结果:用改良组织芯片制作方法成功制备胃癌组织芯片13枚,共包含1 235例胃癌患者胃癌组织,组织芯片与普通切片上胃癌组织P16蛋白的阳性表达率分别为35.2%(31/88)、31.8%(28/88),统计学无显著差异(P>0.05),即组织芯片与普通切片免疫组化检测的结果基本一致。结论:改良组织芯片制作方法简单、快捷,组织芯片在胃癌研究中具有高效、快速、方便、经济、等效等特点。     

基于核酸杂交-酶联桥接的悬浮芯片技术同时定量反义寡核苷酸药物原型及其代谢物方法的初步建立

目的 利用悬浮芯片技术,建立基于核酸杂交-酶联桥接的悬浮芯片技术对反义寡核苷酸药物原型及其代谢产物同时定量的分析方法。方法 本研究在确证探针与微球偶联的基础上,考察生物基质效应、偶联微球浓度、检测探针浓度、S1核酸酶用量以及荧光显色液浓度等因素对方法定量的影响。最终在同一生物样品中对反义寡核苷酸原型及其代谢产物进行同时定量分析。结果 通过考察生物基质效应,确定稀释10倍的PBS作为条件优化及样品定量分析的生物学基质;微球浓度为150个/μl,检测探针浓度为400 nmol/L,S1核酸酶用量为1 U/孔,荧光显色液浓度为1 μg/ml。在猕猴血浆基质中该方法针对原型与代谢产物序列的定量范围均为7.81～2000 nmol/L。在同时含有低浓度（20 nmol/L）和高浓度（1500 nmol/L）AI-ON1原型（Ai）与AI-ON1缩短代谢产物（Am）的混合血浆样品中,该方法可同时特异性地定量分析Ai与Am。结论 本研究成功建立基于核酸杂交-酶联桥接的悬浮芯片定量分析方法,可在微量生物样品中实现对反义寡核苷酸药物原型及其代谢产物的同时定量分析。