靶向卵巢癌HIF-1α基因siRNA真核表达载体的构建及鉴定

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是生物体内普遍存在于RNA水平上调节基因表达的方式,具有很强的转录后基因沉默作用,已广泛用于抗肿瘤的研究中。缺氧诱导因子-1α表达与肿瘤的耐药可能有密切关系,卵巢癌细胞中亦有HIF-1α蛋白的高表达,因此抑制卵巢癌细胞中HIF-1α基因的表达可能逆转肿瘤耐药。     

靶向人SSH1L的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向人SSH1L的siRNA真核表达载体（pSUPER-SSH1L）。方法将设计好的SSH1L的siRNA的寡聚脱氧核苷酸链与真核表达载体pSUPER连接,构建重组pSUPER-SSH1L真核表达载体。对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序;通过Westernblot检测SSH1L蛋白的表达。结果酶切鉴定、DNA测序以及Westernblot检测结果证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向人SSH1L基因表达的siRNA干扰质粒载体pStrPEn-SSH1L,为进一步运用RNA干扰技术进行SSH1L基因功能研究奠定了基础。     

MGMT基因siRNA质粒载体的构建及鉴定

目的 构建MGMT基因的siRNA（small interfering RNA）质粒载体pRNAT-H1.1/Neo-MGMT siRNA,为进一步研究siRNA对MGMT基因的抑制作用,探讨MGMT在胶质瘤的化疗耐药及逆转胶质瘤细胞耐药表型中的作用奠定基础.方法 针对MGMT的靶序列设计合成二三条shRNA（small hair RNA）的DNA模板单链,同时模板链两端分别设计BamHⅠ和Hind Ⅲ限制酶切位点.退火形成siRNA载体插入片断.用限制性内切酶将pRNAT-H1.1/Neo线性化,T4连接酶将插入片断插入pRNAT-H1.1/Neo中.重组质粒转化大肠杆菌DH5α后培养出阳性克隆,抽提质粒,经酶切、电泳和测序的方法鉴定质粒构建是否成功.结果 设计构建三条针对MGMT基因的siRNA质粒载体,经双酶切,在2%琼脂糖凝胶电泳结果显示：PCR产物大小76bp,产物大小与设计的完全相同.测序结果证明序列正确.结论 成功设计构建了三条针对MGMT基因的siRNA质粒载体,为研究RNA干扰逆转胶质瘤细胞的耐药表型提供了良好的实验材料.     

靶向survivin的siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的 构建靶向survivin的siRNA表达载体。方法 设计合成靶向Survivin的siRNA相应DNA模板单链,将其克隆入空质粒pRNAT-U6．1／Neo,模板链两端分别设计两个不同的酶切位点,退火形成siRNA载体插入片段。用限制性酶切将空载体线性化,T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中,对该重组表达载体进行鉴定,获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-sur-vivin。脂质体法将pRNAT-U6．1／Neo-survivin导入膀胱癌T24细胞株,实时定量PCR法检测对T24细胞survivin基因表达的抑制情况。结果 PCR、酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。重组载体能干扰T24细胞survivin基因的表达,并具有新霉素抗性。能够用G-418筛选稳定转化的细胞株。结论 成功构建了靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体pR-NAT-U6．1／Neo-survivin。并转染膀胱癌细胞株,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因siRNA表达载体构建及鉴定

目的:构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体及鉴定。方法:根据Genbank筛选甲状旁腺激素受体1基因3个阳性克隆及1个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至胰岛素-1细胞中,Westernblot观察甲状旁腺激素受体1基因表达,鉴定其转染效率。结果:菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确,并能成功转染到胰岛素-1细胞株中,Western blot筛选最佳抑制基因。结论:成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,为深入探讨大鼠甲状旁腺激素受体1基因的抗凋亡作用奠定了试验基础。     

靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定

本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体。根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化。结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率。分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因。结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础。     

利用siRNA靶向沉默Jeko-1细胞survivin mRNA基因的实验研究

本研究旨在探讨Survivin基因在淋巴瘤细胞中的生物学作用,为将来以Survivin为靶点治疗套细胞淋巴瘤提供实验室证据。体外化学合成针对survivin mRNA基因的siRNA片段,通过DMRIE-C转染Jeko-1细胞,以无关siRNA、未转染的细胞为对照,采用RT-PCR和Western blot方法检测siRNA的抑制效果,利用流式细胞术检测细胞的凋亡率,用CCK-8法检测转染24、48、72 h对细胞增殖的影响。结果表明,与未转染的空白组相比,siRNA转染Jeko-1细胞后24、48、72 h survivin mRNA的相对表达量分别为0.49±0.03、0.38±0.02和0.17±0.02;细胞增殖抑制率分别为(31.2±2.1)%、(43.3±3.4)%和(52.6±2.5)%;细胞凋亡率分别为(6.3±0.5)%、(13.5±1.1)%和(23.6±1.6)%;survivin蛋白表达水平逐步减低。结论:靶向survivin的siRNA能在体外特异性下调目的基因survivin mRNA和蛋白的表达,表现出抑制Jeko-1细胞增殖和促使其凋亡的生物学效应,survivin基因有望成为淋巴瘤治疗的一个药物靶点。     

FUT3基因靶向miRNA表达载体的构建及鉴定

背景：研究发现，Lewis血型抗原与多种恶性肿瘤关系密切，岩藻糖基转移酶（fucosyltransfemse，FUTs）是参与合成Lewis抗原的关键酶，FUT3是其中之一。目的：设计并构建靶向FUT3基因的miRNA干扰质粒，为探索肿瘤基因治疗新途径奠定基础。设计、时间及地点：单一样本观察，于2007-05，10在济南市中心医院医学实验诊断中心完成。材料：BLOCK-iT^TM Pol II miR RNAi Expression Vector Kits（含荧光基因GFP）、T4DNA连接酶购自invitmgen公司；大肠杆菌菌株One Shot TOP10购自invitrogen公司。方法：根据Gen Bank中FUT3的序列，应用www．invitrogen．com网站的设计软件设计、合成针对FUT3miRNA的相应Oligo DNA，退火后与BLOCK-iT^TM Pol II miR RNAi Expression Vector相连接，转化感受态Ecoli TOP10。主要观察指标：①重组质粒DNA序列分析。②质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。③紫外分光光度计检测。④聚合酶链反应鉴定。结果：经测序鉴定和聚合酶链反应鉴定证实成功构建针对人FuT3基因的miRNA干扰质粒pcDNA^TM 6．2-GW／Em GFP-FuT3-miR；质粒DNA的琼脂凝胶电泳检测和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高，可以用于后续试验。结论：FUT3靶向miRNA表达载体构建成功。     

siRNA特异性抑制HEL细胞evi1基因的实验研究

本研究探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默人红白细胞白血病细胞（HEL）的evi1基因后对细胞evi1基因表达的抑制作用及细胞生物学特征变化及其作用机制。体外合成3条evi1基因特异性的siRNA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3）并转染HEL细胞,并设对照。用四甲基偶氮唑蓝法评价细胞增殖抑制情况,半定量逆转录聚合酶链反应（semiquantitative RT-PCR）检测evi1基因mRNA的表达,台盼蓝染色试验测定细胞活性的变化,流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡率。结果显示,细胞转染24、48、72小时后,以siRNA-1作用最强,转染后48小时抑制作用最明显。siRNA浓度为120nmol/L时,抑制率达到最大。转染48小时后siRNA-1对HEL细胞的增殖抑制率为（72.22±2.80）%,evi1-mRNA相对表达率为（27.31±1.11）%,HEL细胞活率为（26.05±2.49）%,与其他各组相比有显著性差异（p〈0.001）。siRNA可使细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,凋亡率明显增高（p〈0.01）。结论：evi1基因特异性siRNA可抑制HEL细胞增殖,使evi1-mRNA表达水平降低,细胞活性下降,HEL细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞的有丝分裂,促进细胞凋亡。     

PIAS-1基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建PIAS-1 siRNA干扰载体Plko.1、PIAS-1。方法 设计以PIAS-1基因为靶标的siRNA序列,并克隆人载体Plko.1,用基因测序进行重组克隆验证。结果 PCR检测证实siRNA插入Plko.1质粒,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建PIAS-1基因的siRNA载体,为研究PIAS-1基因对宫颈癌细胞增殖凋亡的影响提供了稳定转染的骨架载体。     

HLA-G基因siRNA真核表达质粒的构建及其对转染JEG-3细胞株HLA-G表达的抑制作用

目的:构建针对人类白细胞抗原-G基因(human leukocyte antigen-G,HLA-G)基因siRNA表达质粒,观察其对转染JEG-3细胞的HLA-G基因表达的抑制作用。方法:选择RNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,通过与线性化pSuppressor-U6-neo连接、转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。将重组真核表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株。应用RT-PCR、Western-blot方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平。结果:双酶切鉴定及测序图显示,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。RT-PCR和Western-blot结果均表明瞬时转染重组pSuppressor-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达。结论:本试验成功构建了针对HLA-G基因的siRNAs表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G,瞬时转染JEG-3细胞后可以明显抑制HLA-G基因的表达。     

慢病毒载体介导survivin基因siRNA对裸鼠移植人肺腺癌的体内抗癌机制研究

目的探讨慢病毒载体介导survivin基因小片段干扰RNA(siRNA)对裸鼠移植人肺腺癌的体内抑瘤活性。方法制备表达survivin-siRNA的慢病毒载体,构建裸鼠移植人肺腺癌模型,将裸鼠分为空白组(PC组)、空白载体组(NC组)、实验组(RNAi组)3组,分别给予生理盐水、空白病毒载体和siRNA;siRNA组肿瘤组织局部注射表达survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤体积及其随时间的生长变化曲线;分别采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测各组裸鼠肿瘤组织中survivin基因的信史RNA(mRNA)及其表达的蛋白水平变化;采用流式细胞术检测肿瘤细胞周期组方图变化。结果慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠肺腺癌的抑瘤率为46.07%;siRNA组瘤重与NC组和PC组比较,差异有统计学意义(P0.05),而NC组与PC组瘤重比较差异无统计学意义(P0.05);siRNA组survivin基因mRNA及蛋白表达较NC组和PC组明显降低,抑制率分别为72.00%、53.00%;G1期细胞百分比明显增加,S期细胞百分比则明显减少。结论慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡。     

靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒，为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并连接入pGenesil-2载体，并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中，经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体，为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

体外合成特异siRNA及其对Hela细胞端粒酶基因表达抑制的研究

目的 针对端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因不同片断合成2条siRNA,比较其对Hela细胞端粒酶基因表达干扰作用的强弱,从而选择出更好的干扰靶位点.方法 用T7RNA聚合酶在体外转录合成siRNA,将合成的2段siRNA转染Hela细胞,对其干扰作用进行分析、鉴定.结果 用2段合成的特异siRNA转染Hela细胞...     

应用siRNA技术抑制产肠毒素大肠杆菌LT基因表达的研究

目的应用小干扰RNA(siRNA)技术抑制产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因的表达。方法针对LT基因设计siRNAs序列,在ETEC培养过程中,将针对LT的siRNA、非特异性对照siRNA、阴性对照siRNA和LB培养基分别加入siRNA组(siRNA-LT1组、siRNA-LT2组)、siRNA-coa3组、siRNA-NC组和空白对照组,分3个时间点加入,每次1nmol。在首次加入siRNA后45min(A时间点)、90min(B时间点)、135min(C时间点)留取菌液,应用实时荧光定量PCR检测上述3个时间点5组LT mRNA的表达水平。应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测siRNA-LT1组、siRNA-LT2组和空白对照组在3个时间点的LT蛋白表达水平。结果实时荧光定量PCR结果显示,siRNA-LT1在A、B、C 3个时间点对LT mRNA表达的抑制率分别为70.9%、70.1%、72.5%,siRNA-LT2在A、B、C 3个时间点对LT mRNA表达的抑制率分别为70.1%、69.2%、70.5%,siRNALT1组、siRNA-LT2组对LT mRNA表达的抑制率与相应处理时间的siRNA-NC组、siRNA-coa3组、空白对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。Western Blot结果显示,siRNA-LT1和siRNA-LT2在A、B、C 3个时间点对LT蛋白表达的抑制率分别为43.1%、18.4%、5.0%和38.2%、15.4%、30.1%。结论针对LT基因设计合成的siRNA在体外能有效地抑制LT基因的表达。     

增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.     

HABP1基因慢病毒干扰和表达载体的构建及表达

摘要：目的：构建慢病毒介导的透明质酸结合蛋白1基因（HABP1）干扰载体及表达载体,建立HABP1降表达及过表达的稳定肾癌细胞系786-0。 方法：合成人HABP1基因短发夹RNA(shRNA)干扰序列,与慢病毒载体pLKO.1-TRC连接产生重组质粒pLKO.1-shHABP1;双酶切质粒pCDNA3.1(-)-HABP1-Flag,将目的基因片段连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上,组成重组表达载体pCDH-HABP1;酶切鉴定及DNA测序后,转染293T细胞,收集慢病毒颗粒感染786-0细胞,嘌呤霉素筛选稳定细胞系,western blot验证HABP1蛋白的表达水平。 结果：构建成干扰载体pLKO.1-shHABP1及表达载体pCDH-HABP1;与随机序列对照组比较pLKO.1-shHABP1转染的786-0细胞HABP1表达水平(0.30±0.01)明显降低(t=25.98,P<0.05),pCDH-HABP1转染786-0细胞后,HABP1的表达水平（3.20±0.40）明显升高(t=10.34,P<0.05)。 结论：成功构建HABP1基因的干扰载体及表达载体,且786-0细胞可稳定降表达及过表达HABP1。     

新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体的构建

目的：构建4个新靶点的人CyclinE干扰RNA真核表达载体,转染人脑胶质细胞瘤U251细胞,经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测mRNA表达,获得干扰效果最好的真核表达载体,为CyclinE成为人脑肿瘤标志物提供有价值的资料。方法（1）构建4个新靶点CyclinE干扰RNA的真核表达载体后,用双酶切和碱基序列测定的方法鉴定载体构建成功与否;（2）用Lipofectamine 2000转染4个成功构建的载体到胶质瘤 U251细胞株;（3）通过 RT-PCR的结果检测转染后CyclinEmRNA表达量,选出干扰效果最好的1个。结果（1）成功构建了4个新靶点的CyclinE干扰RNA真核表达载体即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4。（2）CyclinEmRNA 表达明显受到抑制,并获得效果最好的CyclinE干扰RNA真核表达载体。结论成功构建并筛选出效果最好的新靶点Cy-clinE干扰RNA真核表达载体,使U251细胞的CyclinE mRNA表达明显降低。     

多发性骨髓瘤特异APE1siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建多发性骨髓瘤(MM)特异的 APE1siRNA 表达载体 pSilencer K-IE-IgP-APE1siRNA,观察其对 MM 细胞 APE1蛋白表达的特异性敲除作用。方法设计合成的 APE1siRNAcDNA 序列与线性化 pSilencer2.0-U6母本质粒连接后,用 BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切,插入 IgP 寡核苷酸片段;随后用 EcoR Ⅰ酶切 pSilencer IgP-APE1siRNA,将线性化载体与回收 IEcDNA 片段用 T4 DNA 连接酶连接;再用 Xho Ⅰ酶切,与回收 Kappa cDNA 片段连接,克隆出 MM 特异表达载体 pSilencer K-IE-IgPAPE1siRNA,每次连接后均经酶切鉴定和测序确认。用脂质体转染法将重组质粒转染 KM3、HOS 和MDA-231细胞,Western blot 分析其对 KM3细胞 APE1的特异性敲除作用。结果 pSilencer K-IE-IgP-APE1siRNA 能特异且有效地敲除 KM3细胞 APE1蛋白表达,转染 siRNA 后培养2d 的 KM_3细胞 APE1相对表达水平为0.118±0.047,而单独脂质体转染组,APE1相对表达水平为0.988±0.029,基因缄默效率为90%。结论成功构建了针对 MM 的 APE1siRNA 表达载体。     

mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定

目的构建mTORsiRNA重组表达载体,为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞mTOR基因的相关研究奠定基础．方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6／GFP／Neo中构建重组表达载体,转化DH5c~菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染人巨噬细胞RAW264．7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Westernblot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTORsiRNA重组表达载体。Westernblot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约4l％。结论mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选,该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。