三氟拉嗪对体外培养人晶状体上皮细胞增殖作用的实验研究

目的研究三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)对体外培养的人晶状体上皮细胞增殖作用的影响,为三氟拉嗪防治晶状体后囊混浊提供理论依据。方法不同浓度(2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml)的TFP作用于传代培养的晶状体上皮细胞,于作用244、8、729、6 h后,用MTT比色法测定其抑制率;用流式细胞仪分析检测TFP诱导人晶状体上皮细胞的细胞周期的阻断。结果TFP对人晶状体上皮细胞的抑制呈明显的时间剂量依赖性,细胞周期分布显示TFP使细胞阻滞在G0/G1期。结论三氟拉嗪可抑制晶状体上皮细胞的生长增殖,其抑制后囊混浊的可能作用值得进一步研究。     

水蛭渗滤液对酪氨酸蛋白激酶介导的牛视网膜色素上皮细胞跨膜信号转导途径的影响

目的研究水蛭渗滤液对酪氨酸蛋白激酶（PTK）介导的牛视网膜色素上皮（RPE）细胞跨膜信号转导途径的影响。方法（1）MTT比色法筛选促牛RPE细胞增殖作用最强的血小板源性生长因子（PDGF）浓度;（2）16mg/ml水蛭渗滤液与0.02μg/mlPDGF以3种加药方式分别孵育RPE细胞15分钟后,采用免疫沉淀,SDS-PAGE电泳,Western-blot检测转录因子STAT3磷酸化水平。结果（1）0.02μg/mlPDGF促RPE细胞增殖作用最佳（p〈0.05）;（2）16mg/ml水蛭渗滤液在3种加药方式下均能不同程度抑制细胞内PTK活性,降低转录因子STAT3的磷酸化水平。结论水蛭渗滤液能阻断PTK介导的牛RPE细胞内STAT3下游通路的信号传递。     

水蛭提取液对恒河猴视网膜血管内皮细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察渗滤法水蛭提取液对恒河猴视网膜血管内皮细胞RF/6A细胞增殖和细胞周期的影响。方法采用MTT法观察不同浓度水蛭提取液(0g.L-1、8g.L-1、16g.L-1、32g.L-1、64g.L-1、128g.L-1)对RF/6A细胞增殖的影响,筛选最佳抑制浓度,应用流式细胞仪观察水蛭提取液对凝血酶诱导的RF/6A细胞周期的影响。结果8g.L-1、16g.L-1浓度组水蛭提取液对血管内皮细胞RF/6A有促进生长作用,与空白对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05);32g.L-1、64g.L-1、128g.L-1浓度组水蛭提取液对血管内皮细胞RF/6A均有明显抑制作用,与空白对照组相比差异也均有统计学意义(均为P<0.05);24hIC50为97g.L-1;64g.L-1为水蛭提取液的最佳抑制浓度,用于后期实验。流式细胞仪检测发现:水蛭提取液组G1期细胞比例(91.95±1.69)%高于其他各组,合药组(83.60±1.88)%高于凝血酶组(77.78±3.22)%,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。凝血酶组S期细胞比例(21.75±2.94)%高于其他各组,水蛭提取液组(7.55±2.45)%...     

高三尖杉酯碱对人视网膜色素上皮细胞增生影响的实验研究

目的探讨高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)对人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)增生的抑制及其细胞周期的影响。方法采用MTT法检测50%细胞生长抑制率时HHT的药物浓度,并用此浓度作用于培养的人视网膜色素上皮细胞,用免疫细胞化学染色分析观察RPE细胞的Ki-67表达,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果HHT抑制培养的人色素上皮细胞的增生与药物剂量成正比,50%细胞生长抑制率时HHT的药物浓度约为4.77mg/L,Ki-67阳性细胞率在对照组和HHT组分别为89.1%和33.8%(P<0.01),两组中阳性细胞核积分光密度值分别为60.7±5.7和29.6±7.8(P<0.01)。流式细胞仪检测细胞周期变化示HHT组G1期细胞比例由72.14%增至83.95%,G2-M期细胞比例由15.46%下降至3.18%。结论HHT可抑制RPE细胞的增生。HHT作用后RPE细胞中G0-G1期细胞增多,G2-M期细胞明显减少,HHT对G2-M期细胞有杀伤作用。HHT有望成为防治视网膜脱离复位术后发生增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的一种新药。     

苏拉明对体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 观察苏拉明(suramin)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(retinalpigment epithelial cells)生长、增殖的影响。方法 以300mg·L~(-1)苏拉明作用于培养的视网膜色素上皮细胞,于不同的时间点行细胞计数,绘制生长曲线,台盼蓝染色判定细胞的活性;将不同浓度的苏拉明(0、100、200、300、400mg·L~(-1))加入RPE细胞培养液,72h后用四甲基唑盐(MTT)比色法测吸光值A,并计算不同浓度条件下的细胞增殖抑制率;流式细胞技术检测细胞周期变化。结果 苏拉明在所设浓度内均抑制RPE细胞增殖,并存在时间-效应及剂量-效应关系,最大增殖抑制率约78％,72h时IC_(50)为272mg·L~(-1)。FCM示suramin使G_2/M期细胞增加了14.2％。结论 苏拉明能抑制体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖,可作为防治增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的候选药物作进一步研究。     

二甲基亚砜对培养人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的　探讨细胞分化诱导剂及端粒酶抑制剂二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)对人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用。方法　本研究分实验组和对照组 ,对照组弃原培养液 ,加无血清培养液继续培养 ,实验组用不同浓度的DMSO 5、10、2 0、4 0mL·L-1分别作用于人RPE细胞 2 4、4 8、72、96h ,用MTT法检测DMSO对hRPE细胞生长的影响 ,流式细胞仪检测DMSO对hRPE细胞周期的影响。结果　 10mL·L-1DMSO处理的hRPE细胞从作用 4 8h开始 ,OD值 ( 0 .5 37± 0 .0 10 )小于对照组 ( 0 .6 4 7± 0 .0 2 2 ) ,有显著性差异 (P <0 .0 0 1) ,细胞生长受到抑制 ,且随浓度增加及作用时间延长 ,抑制越显著。流式细胞仪检测 2 0mL·L-1DMSO作用 72h细胞周期发生明显变化 ,G1期细胞由4 1 31%增加至 5 9.6 5 % ,S期由 32 .0 9%减至 2 1.2 1% ,G2 期由 2 6 .6 5 %减至 19 14 % ,细胞生长被阻滞在G1期 ,生长受到抑制。结论　DMSO能阻滞hRPE细胞于G1期 ,抑制hRPE细胞增殖且呈剂量依赖性。     

雷帕霉素对兔晶状体上皮细胞增殖的影响

目的研究雷帕霉素（rapamycin）对培养的兔晶状体上皮细胞增殖的作用及其对细胞周期的影响。方法将传代的兔晶状体上皮细胞用含不同雷帕霉素浓度的培养液培养24h后，用NIT法测定5ng／ml、10ng／ml、20ng／ml、40ng/ml、80ng/ml雷帕霉素浓度组及对照组细胞的增殖情况；用流式细胞仪测定20ng/ml雷帕霉素浓度组及对照组细胞周期的变化情况。结果用5ng/ml的培养液培养细胞时，细胞增殖受到抑制（P〈0．05），随药物浓度增加，细胞增殖受抑制越明显；用10ng/ml的培养液培养细胞时，细胞增殖明显受到抑制（P〈0．01）。细胞周期分析显示，雷帕霉素（20ng/ml）作用后，G0／G1期细胞较对照组增多（由51．72％增加到61．63％），S期细胞较对照组减少（由34．92％减少至10．85％）。结论雷帕霉素具有抑制兔晶状体上皮细胞增殖的作用，且随浓度增加抑制作用增强。雷帕霉素将细胞抑制在G1期的限制点内。     

端粒酶编码区的反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞增生的影响

目的探讨不同浓度端粒酶编码区的反义寡核苷酸对人视网膜色素上皮细胞增生活性的影响。方法用不同浓度(0μmol·L-1、5μmol·L-1、10μmol·L-1、15μmol·L-1)端粒酶编码区的反义寡核苷酸处理人视网膜色素上皮细胞24h后,使用MTT法测定视网膜色素上皮细胞增生的抑制率,使用流式细胞仪检测其对视网膜色素上皮细胞周期的影响。结果不同浓度端粒酶编码区反义寡核苷酸处理过的视网膜色素上皮细胞的抑制率随反义寡核苷酸浓度的增高而升高,并将视网膜色素上皮细胞阻滞在G0/G1期。结论端粒酶编码区的反义寡核苷酸对视网膜色素上皮细胞有抑制作用且呈浓度依赖性,这一结论可能成为增生性玻璃体视网膜疾病基因治疗的一个新靶点。     

维生素E琥珀酸酯对人晶状体上皮细胞增殖的影响

目的研究维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate,VES)对体外培养的人晶状体上皮细胞(HLECs)增殖的影响。方法人晶状体上皮细胞株HLECs-B3以VES刺激24h、48h、72h、96h,VES浓度为5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml,用MTT比色法测定VES对细胞增殖的抑制作用;以流式细胞仪分析细胞周期。结果VES对人晶状体上皮细胞的增殖具有显著的抑制作用,表现为时间和剂量依赖关系。并且将细胞周期阻滞于G0/G1期。结论VES对体外培养的人晶状体上皮细胞的增殖具有抑制作用,为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。     

水蛭提取液对p38丝裂原活化蛋白激酶介导的人视网膜色素上皮细胞信号转导途径的影响

目的 研究水蛭提取液对p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein ki-nase,MAPK)介导的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelial,hRPE)细胞跨膜信号转导途径的影响.方法 选3-5代生长良好的hRPE细胞,细胞同步化后分为:正常对照组、凝血酶组、水蛭组、合药组(凝血酶+水蛭组),根据前期实验数据,用64 g·L-1的水蛭提取液与500 NIHU·L-1的凝血酶分别(或共同)孵育hRPE细胞30 min后,采用流式细胞术及免疫细胞化学方法 检测孵育hRPE细胞内p38 MAPK的表达.结果 根据各组P-p38 MAPK免疫细胞化学平均光密度值发现,凝血酶组(1.195 0±0.022 6)与正常对照组(1.055 0±0.018 7)相比,OD值上升,差异有显著统计学意义(P<0.01);水蛭提取液组(0.756 7±0.071 0)与正常对照组相比,OD值下降,差异有显著统计学意义(P<0.01);合药组(0.555 0±0.065 0)与凝血酶组相比,OD值下降,差异有显著统计学意义(P<0.01).根据各组P-p38 MAPK流式细胞术检测的荧光量比较(OD值)发现,凝血酶组(6.441 7±0.072 0)与正常对照组(5.456 7±0.182 5)相比,荧光量升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);水蛭组(4.448 3±0.201 5)与正常对照组相比,荧光量下降,差异有显著统计学意义(P<0.01);合药组(4.143 3±0.068 0)与凝血酶组相比,荧光量下降,差异有显著统计学意义(P<0.01).结论 水蛭提取液能抑制hRPE细胞的增生,其机制与p38 MAPK介导的信号转导通路有关.     

表没食子儿茶素没食子酸酯对视网膜色素上皮细胞增殖及相关因子表达的影响

目的　研究表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞增殖及相关因子表达的影响。方法　体外培养人RPE细胞,设阴性对照组,40 mg·L^-1、 80 mg·L^-1、 160 mg·L^-1 EGCG 3个浓度药物处理组。利用MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,实时荧光定量PCR检测细胞周期素依赖性激酶抑制因子P21和P27 mRNA的表达,Western blot检测色素上皮衍生因子受体（pigment epithelium derived factor receptor,PDGFR-α)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB）和IκB蛋白的表达情况。结果　MTT实验结果显示,40 mg·L^-1、80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG药物处理组随着作用时间的延长,对人RPE细胞的增殖抑制作用也逐渐增强;随着药物浓度的增加,EGCG的增殖抑制作用也增强（均为P<0.05）。160 mg·L^-1 的EGCG 在72 h的细胞增殖抑制率达到81.11%。随着EGCG浓度的增加,培养的人RPE细胞中G1期和G2期细胞比例减少,S期细胞比例增加,80 mg·L^-1、160 mg·L^-1EGCG药物处理组S期细胞比例与阴性对照组相比增加极显著（均为P<0.05）。EGCG对细胞周期的影响作用具有明显的剂量依赖性。与阴性对照组相比,80 mg·L^-1、160 mg·L^-1EGCG药物处理组细胞内的P21和P27 mRNA表达均有不同程度的升高（均为P<0.05）;40 mg·L^-1 EGCG药物处理组与阴性对照组相比,P27 mRNA表达也增高（P=0.015）,而P21 mRNA表达增高不明显（P=0.824）。P21和P27 mRNA表达量与EGCG浓度呈明显量效依赖关系（均为P<0.05）。Western blot结果显示,40 mg·L^-1、80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG作用人RPE细胞后,NF-κB蛋白表达随着浓度的增加而减少,各药物处理组与阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG亦能够抑制人RPE 细胞IκB蛋白和PDGFR-α蛋白表达,与相应阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。EGCG对人RPE细胞内PDGFR-α、NF-κB和IκB的蛋白表达抑制作用呈明显的浓度依赖性（均为P<0.05）。结论　EGCG可以有效地抑制人RPE细胞的增殖,其机制可能与EGCG将人RPE细胞阻滞于S期,上调P21及P27 mRNA表达,下调PDGFR-α、NF-κB和IκB蛋白表达有关。     

水蛭提取液体外对人视网膜色素上皮细胞PAR-1表达的影响

目的:研究水蛭提取液对人视网膜色素上皮(retinal pigment epichelial,RPE)细胞PAR-1表达的影响。方法:水蛭提取液体外单独或与凝血酶共同作用于人RPE细胞后,用免疫荧光法测定PAR-1的荧光表达。结果:PAR-1的免疫荧光光密度值比较:(1)凝血酶组与正常对照组比较,PAR-1的IOD值下降(1608±675,4036±1134,P<0.01)。(2)单加水蛭提取液组与正常对照组比较,PAR-1的IOD值升高(9998±2374,4036±1134,P<0.01)。(3)凝血酶和水蛭提取液同时加药组与凝血酶组比较,PAR-1的IOD值显著升高(19664±5436,1608±675,P<0.01)。表明水蛭提取液能竞争性抑制凝血酶对PAR-1的活化作用。结论:水蛭提取液能抑制凝血酶诱导的人RPE细胞膜上的PAR-1的活化,阻断PAR-1介导的细胞信号传导。     

Mitogen-activated protein kinase inhibitor,PD98059, inhibits rat retinal pigment epithelial cell replication by cell cycle arrest

PURPOSE: To investigate the effect of PD98059, a mitogen-activated protein kinase (MAPK) inhibitor, on the replication of rat cultured retinal pigment epithelial (RPE) cells. METHODS: Growth-phase rat RPE cells were exposed to various concentrations of PD98059 in serum-free F12 medium containing 0.1% dimethyl sulfoxide. Cell proliferation was assessed by cell counts using a hemocytometer. Cell viability was tested by CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay at 24 hours after PD98059 application. Hoechst 33552 and propidium iodide staining were used to assess nuclear morphology. Immunostaining with Ki67 antibody was used for cell cycle analysis because the staining patterns produced on cells are characteristic depending on their position within the cell cycle. RESULTS: PD98059 inhibited cellular proliferation of cultured rat RPE cells in a dose-dependent manner but did not induce cell death. Twenty-four hours after the application of PD98059, cultured RPE cells were not immunopositive for Ki67, indicating that their cell cycle was arrested in the G0/G1 phase. CONCLUSION: These results demonstrated that MAPK inhibition arrested cell cycle progression of rat cultured RPE cells at the G0/G1 phase. The pharmacological induction of cell cycle arrest could be a new approach to inhibit cellular proliferation in such conditions as proliferative vitreoretinopathy.     

水蛭提取物对血管内皮细胞VEGF受体-2表达的影响

目的:研究水蛭提取物对凝血酶诱导的RF-6A细胞(恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞)跨膜受体VEGFR2表达的影响,从而探讨中药水蛭用于防治新生血管形成中的作用。方法:将培养细胞分成水蛭组,凝血酶组,凝血酶+水蛭组及空白组。在前期实验基础上选择64g/L水蛭提取液及20NIHU/mL凝血酶。8h后,采用免疫组织化的方法检测各组细胞VEGFR2的表达,并进行图像分析。结果:免疫组化分析:与空白组比较水蛭组RF-6A细胞膜上VEGFR2的表达明显降低,降低程度高于凝血酶组,小于混合组,Sig=0.000,P<0.01各组间的差异有统计学意义。结论:水蛭提取物可使内皮细胞跨膜受体VEGFR2表达明显减少,推测其对VEGF受体介导的跨膜信号传导途径的作用可能是通过竞争性地抑制VEGF与其受体的结合。     

Mechanism of growth inhibitory effect of Mitomycin-C on cultured human retinal pigment epithelial cells: apoptosis and cell cycle arrest.

PURPOSE: To investigate the therapeutic potential of Mitomycin-C (MMC) in the management of proliferative vitreoretinopathy, the antiproliferative effect of MMC on cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells were investigated in vitro. METHODS: Drug sensitivities of cultured human RPE cells to MMC were determined using the tetrazolium dye assay. In order to detect the presence of apoptosis, DNA fragmentation was assessed by DAPI staining, and TdT-dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay. The relative amount of DNA fragmentation was quantified by flow cytometric analysis. To analyze the cell cycle response of RPE cells to MMC, flow cytometric analysis of propidium iodide stained nuclei was performed. The levels of proteins related to DNA damage in the RPE cells were then determined by Western blot analysis. RESULTS: MMC inhibited cell proliferation in a dose-dependent manner. The majority of RPE cells following treatment with 10 microg/ml of MMC exhibited fragmented nuclei as observed by DAPI staining and TUNEL assay. Cell cycle analysis demonstrated an accumulation of cells arrested in S and G2/M phase following treatment with 1 microg/ml of MMC. At 10 microg/ml of MMC, a dramatic increase of the cell population in the sub G1 peak, which can be considered a marker of cell death by apoptosis, was observed by flow cytometry. Western blot analysis of p53 and p21 revealed a gradual increase in the level of these proteins when RPE cells were exposed to increasing concentrations of MMC. CONCLUSIONS: This study demonstrated that the response of RPE cells to MMC was bi-directional: 1) partial arrest of the cell cycle at S, G2/M phase, and 2) induction of apoptotic cell death.     

曲安奈德对正常人视网膜色素上皮细胞

目的研究曲安奈德（TA）对视网膜色素上皮（RPE）细胞的毒性作用。方法四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法测定不同浓度(0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/ml)TA对RPE细胞增生的影响；流式细胞术检测TA［当生长抑制率达到50%时的药物浓度(IC₅₀)］作用72 h后细胞周期的变化；倒置相差显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态和超微结构的改变。结果0.4~0.025 mg/ml浓度范围内，与对照组比较，TA作用后RPE细胞生长均有明显抑制 (P＜0.05)，且呈浓度依赖性。TA组S期细胞较对照组减少10.6%（P＜0.05）。光学显微镜下TA组细胞密度稀疏，形态不规则，有较多突起及细胞空泡。电子显微镜下TA组细胞核染色质分布不均，细胞质空化，甚至可见细胞坏死。结论TA可抑制培养人RPE细胞有丝分裂S期，抑制细胞增生；明显破坏细胞结构甚至导致细胞死亡。(中华眼底病杂志,2005,21:233-236)     

吲哚美辛对体外培养的RPE细胞增殖及DNA合成的影响

目的探讨吲哚美辛(IN)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮(RPE)细胞的抑制作用及DNA合成的影响。方法 分别用核酸蛋白分析仪测定加入50、100、200、400、600μmol/L IN作用24 h后RPE细胞DNA质量浓度的变化和MTT法测定加入100、200、400、600、800、1 000 μmol/L IN 12 h后RPE细胞数量的改变。 结果 前者其细胞DNA质量浓度(单位:μg/ml)分别为101.171 2±15.512 4、88.640 0±13.584 5、72.365 1±7.796 9、5.908 9±10.722 9、51.223 6±8.775 7。与对照组21 3.735 1±83.157 2相比,差异有显著性(q值分别为5.481、6.091、6.883、7.490、7.912,P值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000);后者其细胞A值分别为0.236 7±0.054 6、0.168 7±0.069 5、0.081 9±0.034 6、0.065 6±0.017 6、0.055 4±0.028 6、0.050 8±0.027 7。与对照组0.267 4 ±0.043 0相比,差异有显著性(q值分别为1.442、4.621、8.682、9.447、9.925、10.140,P值分别为0.158、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000)。 结论 IN可抑制体外培养的RPE细胞的DNA合成及增殖。     

透明质酸刺激活性物对人视网膜色素上皮细胞的抑制

目的观察透明质酸(hyaluronic acid,HA)刺激活性物(HA-stimulating activity,HASA)对培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞的作用。方法将不同质量浓度的HASA加入RPE细胞培养液, 采用活细胞计数、四甲基偶氮唑盐(tetrazolium,MTT)比色法及氚标胸腺嘧啶核苷(³ H-th ymidine,^3 H-TdR)掺入法检测细胞活力,用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)分析RPE细胞周期。结果HASA在12.5～200．0 μg/ml范围及48小时内对人RPE细胞的抑制存在剂量-效应及时间-效应关系。最大细胞抑制率约48.0%。FCM显示 HASA作用后G₁期细胞数较对照组增加7.2%,S期减少9.7%。结论HASA在一定时间和剂量范围内对人RPE细胞有抑制作用。(中华眼底病杂志,1999,15:72-74)     

组织型纤溶酶原激活剂对人视网膜色素上皮细胞的抑制

目的：探讨组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator,tPA)对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE)细胞的作用。方法：运用活细胞计数法和甲基噻咪基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色实验观察分析tPA对人RPE细胞增殖的抑制作用,应用流式细胞仪（flow eytometry,FCM)分析人RPE细胞周期。结果：0．1－3μg/ml tPA对人RPE细胞有抑增殖作用,其效应与药物浓度和作用时间呈正向依赖关系（P＜0．01）;5μg/ml tpA对人RPE细胞有致死毒性作用。RCM显示tPA作用后S期细胞增加9．8％（P＜0．05）,G2M期减少6．6％（P＜0．05）。结论：tPA在一定时间和剂量范围内对人RPE细胞具有抑增殖作用,且不对细胞产生致死毒性;tPA主要延迟／阻滞人RPE细胞于S期。