体内噬菌体展示技术筛选人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽及其性质、结合效果研究

目的探讨体内噬菌体展示技术筛选的人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽的性质和结合效果,为乳腺癌早期诊断提供分子靶向探针。方法制备人髓样乳腺癌Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型,采用噬菌体环七肽库进行3轮体内筛选。免疫组织化学法检测筛选的噬菌体在肿瘤及正常组织中的分布情况。酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定单克隆噬菌体对Bcap-37细胞的亲合力。提取阳性单克隆噬菌体DNA并测序,选取重复率高的序列合成多肽,制备光学分子探针,应用荧光分子成像验证合成的多肽在荷瘤小鼠体内对乳腺移植瘤的特异性和靶向性。结果第3轮体内筛选的噬菌体回收率为第1轮的107.2倍。免疫组织化学结果显示,随筛选轮次增加,肿瘤组织中结合的噬菌体依次增加;肿瘤组织结合的噬菌体多于正常组织(肺脏、骨骼肌、肝脏、肾脏),肿瘤组织切片扫描图像的吸光度(A)值均较正常组织高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。ELISA结果显示,随机选取的50个单克隆噬菌体中,22个为阳性(亲合力≥2)。阳性单克隆噬菌体DNA测序分析后,得到4条有重复的氨基酸序列,选择重复率最高的氨基酸序列CSPLNTRFC,化学合成异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CSPLNTRFC多肽。Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型体内验证实验显示,FITC-CSPLNTRFC多肽能明显富集在乳腺移植瘤组织。结论利用体内噬菌体展示技术能够筛选出可与人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的多肽CSPLNTRFC,有助于进行乳腺癌早期诊断的体外研究。     

乳腺癌干细胞新型多肽标志物的筛选

目的:从噬菌体随机十二肽库中筛选出能够与乳腺癌干细胞(breast cancer stem cell,BCSC)特异性结合的噬菌体,筛选后提取多肽以研究其与BCSC的亲和力和特异性。方法:通过"无血清-有血清"交替培养法培养人乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞系,以求最大化富集BCSC,将hs578bst正常人乳腺细胞和普通培养的乳腺癌细胞用作减性筛选细胞,筛选噬菌体随机肽库;然后根据筛选结果选取阳性噬菌体进行单克隆扩增并测序,得到测序结果后依据合成多肽,标记以FITC;最后,建立乳腺癌动物模型,并在体外观察合成多肽与BCSC结合的特异性。结果:经过3轮筛选,噬菌体富集约200倍;随机选出10株单克隆噬菌体,与BCSC共同培养,其中与MCF7和MDA-MB-231乳腺癌干细胞阳性结合的噬菌体数目分别为6株和8株;分别从中选取1个阳性噬菌体进行测序,合成多肽后分别命名为A3和B8;多肽A3特异性结合MCF7乳腺癌干细胞,同时多肽B8特异结合MDA-MB-231乳腺癌干细胞。结论:噬菌体随机肽库可成功筛选出能够特异性结合BCSC的多肽,为BCSC的靶向治疗和进一步研究奠定了理论基础。     

乳腺癌干细胞富集及其特异性多肽的筛选

目的：无血清培养法富集乳腺癌干细胞（breast cancer stem cell,BCSC）并采用噬菌体展示技术,筛选能特异性结合乳腺癌干细胞的噬菌体多肽。方法：无血清培养法富集乳腺癌MDA—MB-231细胞株中干细胞并以此为靶标,以hs578bst人正常乳腺细胞及普通培养的MDA—MB-231细胞为减性筛选细胞,对噬菌体随机肽库进行双重减性筛选,选取富集后的阳性噬菌体单克隆,ELISA及DAB染色鉴定阳性噬菌体特异性并测序。结果：经过3轮筛选,噬菌体得到约500倍的富集,随机挑选10株单克隆噬菌体。ELISA显示,6号噬菌体单克隆对乳腺癌干细胞的亲和力是对照的6．14倍;DAB鉴定亦显示,其对乳腺癌干细胞的特异性及亲和力最高,对阳性噬菌体DNA测序翻译得到十二肽氨基酸为GYSASRsTIPGK。结论：通过干细胞富集及噬菌体展示技术,成功筛选出能够特异性结合乳腺癌干细胞的特异性噬菌体多肽,为乳腺癌的干细胞靶向治疗和深入研究奠定基础。     

宫颈癌HeLa细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

背景与目的:宫颈癌的分子靶向治疗具有很好的疗效,同时可以显著减少抗癌药物对人体自身的损伤,因此备受关注。本研究利用噬菌体体内展示技术筛选及鉴定宫颈癌特异性结合肽,将有可能成为化疗药物的靶向载体,为宫颈癌靶向药物治疗奠定基础。方法:体外培养宫颈癌HeLa细胞接种裸鼠,建立肿瘤动物模型。将随机肽库尾静脉注入裸鼠体内,循环15 min,心脏灌注后回收肿瘤组织噬菌体扩增、纯化并以此作为起始物进行第2轮的筛选,如此进行3轮体内筛选后挑取噬菌体克隆,进行免疫组化及ELISA实验,初步鉴定噬菌体克隆对宫颈癌细胞的亲和力及特异性,并将具有强亲和力的克隆进行测序。结果:ELISA结果显示,随机挑选10个噬菌体单克隆中8个克隆对HeLa细胞具有很强的亲和力,将这8个克隆进行测序,获得相同短肽序列LLRSTGF。结论:利用噬菌体展示技术筛选出与宫颈癌细胞HeLa特异性结合的短肽,进一步与化疗药物结合,为宫颈癌靶向治疗提供新的方法。     

环7肽库筛选胃癌耐药细胞特异性结合短肽

目的获得与胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR特异结合的抑制耐药短肽,作为提高胃癌化疗效果的先导化合物。方法以SGC7901/VCR细胞为靶细胞,胃粘膜永生化上皮细胞GES,胃癌药敏细胞SGC7901为吸附细胞对噬菌体7肽库进行消减筛选,用细胞ELISA鉴定阳性噬菌体克隆并测序,利用竞争抑制试验确定阳性克隆的结合部位是否为外源性肽段。结果经4轮筛选,从随机挑选的30个噬菌体克隆中得到14个能特异性与SGC7901/VCR结合而不与胃癌药敏细胞结合的阳性克隆,确定其氨基酸序列分别为SY1和SY2(筛选所得安基酸序列正在专利申请中),含SY1为阳性克隆。结论用噬菌体环7肽库成功筛选到能特异性结合胃癌耐药细胞株的短肽,为肿瘤治疗或药物靶向治疗奠定基础。     

利用体内噬菌体展示技术筛选肝癌组织特异性结合肽

目的 筛选人源肝癌组织特异性结合短肽。方法 体外培养人源肝癌细胞株BEL-7402,建立荷瘤裸鼠模型。尾静脉注射噬菌体12肽文库至荷瘤裸鼠体内,循环20min后回收肿瘤组织中噬菌体,同时取正常对照组织进行噬菌体效价测定和免疫绀化观察。将同收的噬菌体扩增、纯化,并以此作为起始物进行下一轮筛选。经过3轮体内筛选,得到与肝癌组织或细胞特异结合的肽段。随机挑选噬菌体单克隆进行测序,分析序列㈣源性后进行体外细胞酶联免嫂吸附试验（ELISA）和体内回输实验,验证噬菌体克隆的导向性。结果 经过3轮体内筛选,瘤组织中噬菌体的回收率逐步提高,回收量随着输入量的增加迅速增加,而每轮筛选肝组织中的噬菌体回收晕始终保持在一个恒定范围,并不随输入量的增加而增加。免疫组化结果硅示,第3轮筛选后,瘤组织中的噬菌体得到高水平富集,同时其他组织的非特异性结合降至最低,肝癌细胞特异性结合最强的是A54号单克降,A67、B2号单克隆次之。B2的导向效果最好,A54次之。通过对噬菌体单克隆的序列分析,初步确定了PSS／FTT基序。结论 利用体内噬菌体展示技术,可以成功筛选到与肝癌细胞或组织特异结合的噬菌体肽。     

胃癌腹膜高转移细胞特异性结合噬菌体多肽的筛选及鉴定

目的寻找能够与胃癌腹膜高转移细胞GC9811-P特异性结合的噬菌体多肽,探索治疗胃癌腹膜转移的新方法。方法运用噬菌体呈现肽技术,先后用胃癌的腹膜高转移细胞系GC9811-P和其亲本细胞GC9811对噬菌体12肽库进行消减性的全细胞淘洗．经过3轮筛选,随机挑选40个噬菌体单克隆C1～G40。用ELISA法选取能够与GC9811-P特异性结合的单克隆。将选出的单克隆分别注入裸鼠腹腔,采用免疫组化法排除与正常组织亦高结合的阳性单克隆。对筛选出的噬菌体克隆进行DNA序列测定,并推导其外源性氨基酸序列,进行同源性分析。结果经过3轮淘洗,噬菌体克隆得到理想富集。C9、C18、C23、C29、C34和C37可与GC9811-P特异性结合,经免疫组化证实,这6个单克隆均不与裸鼠腹腔内正常组织结合。测序结果大致展示了两种外源性多肽,即TLNINRLIIPRT和SMSIxSPYIxxx。结论筛选出6个可与GC9811-P细胞特异性结合的噬菌体多肽;这两个肽序列能否阻断GC9811-P细胞向腹膜转移尚待进一步确定。     

噬菌体随机12肽库筛选肝癌患者血清肿瘤标记物的初步研究

目的：从噬菌体随机多肽文库中,筛选出能与肝癌患者血清特异性结合的短肽分子.方法：采用肝癌患者血清作为配基,筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表达的随机12肽文库.按吸附一洗脱一扩增的淘筛过程,经3轮淘筛后,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性,评价分析其诊断肝癌的价值.结果：经3轮淘筛后,特异性结合的噬菌体富集增加近100倍.用.ELISA检测第3轮筛选后随机挑取的单个噬菌体克隆,其中特异性最好的3个克隆具有诊断肝癌的潜在价值.结论：噬菌体展示肽库技术,可以有效进行肝癌相关抗原肽的筛选研究,为获得特异性诊断试剂进而为肝癌的诊断提供依据.     

胃癌细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

目的 筛选与胃癌细胞特异性结合的多肽。方法 以正常细胞为吸附细胞,胃癌细胞为筛选靶细胞对噬菌体随机12肽库进行消减筛,用细胞酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫细胞和组织化学法及裸鼠正常组织结合实验鉴定阳性克隆并进行DNA测序。结果 经三轮筛选,利用ELISA从随机挑选的24个噬菌体克隆中得到8个与胃癌细胞具有高结合力的噬菌体阳性克隆,经免疫细胞化学及裸鼠正常组织结合试验鉴定,发现第20、24两个克隆能与胃癌细胞特异性结合,而不与正常细胞和裸鼠组织结合,噬菌体阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论 得到两个序列不同的特异性结合胃癌细胞的噬菌体克隆,这可为进一步的研究提供实验依据。     

应用噬菌体随机肽库筛选肿瘤MUC1/Y黏蛋白结合肽

目的：探索用噬菌体随机肽库筛选可用于肿瘤导向治疗的新型小分子载体。方法：以MUC1/Y黏蛋白的胞外段蛋白（MUC1/Yex）为靶分子,用凝胶亲和法和酶联板法分别筛选十二肽噬菌体随机肽库,ELISA鉴定阳性克隆,DNA序列测定后确定MUC1/Yex结合肽的氢基酸序列;免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆及正常及肿瘤细胞的结合能力及特异 性。结果：通过4轮筛选,共获得3种MUC1/Yex的结合肽,分别为HHWHSRSQLSWF,HLKHKNYLPPTP和GNWYRHPHYLQP,其中HXXHS表位可能在与MU1/Yex的结合中起重要作用。阳性噬菌体克隆可与肿瘤细胞系MCF7,OVCA3,而不与正常外周血淋巴细胞结合。结论：筛选获得的MUC1/Yex结合肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,可进一步用于肿瘤导向治疗的研究。     

MDA-MB-231乳腺癌细胞特异性多肽的初步筛选

目的 利用噬菌体展示技术,从噬菌体随机十二肽库中筛选出能够特异性结合MDA-MB-231乳腺癌细胞的噬菌体克隆.方法 以人正常乳腺细胞为减性筛选细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行筛选,挑取富集后的阳性单克隆噬菌体,酶联免疫吸附试验（ELISA）及DAB染色鉴定阳性噬菌体的特异性及亲和力.结果 经过3轮筛选,噬菌体得到约113倍的富集,随机挑选11株单克隆噬菌体,ELISA显示8号噬菌体单克隆对乳腺癌细胞的亲和力是对照的6.5倍,DAB鉴定亦显示其对乳腺癌细胞的特异性及亲和力最高,命名为LK-8.结论 利用噬菌体筛选技术成功筛选出能够特异性结合MDA-MB-231乳腺癌细胞的特异性噬菌体单克隆LK-8,可为进一步合成特异性多肽用于早期诊断和靶向治疗乳腺癌奠定基础.     

噬菌体随机12肽库筛选肝癌患者血清肿瘤标记物的初步研究

目的:从噬菌体随机多肽文库中,筛选出能与肝癌患者血清特异性结合的短肽分子.方法:采用肝癌患者血清作为配基,筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表达的随机12肽文库.按吸附一洗脱一扩增的淘筛过程,经3轮淘筛后,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性,评价分析其诊断肝癌的价值.结果:经3轮淘筛后,特异性结合的噬菌体富集增加近100倍.用.ELISA检测第3轮筛选后随机挑取的单个噬菌体克隆,其中特异性最好的3个克隆具有诊断肝癌的潜在价值.结论:噬菌体展示肽库技术,可以有效进行肝癌相关抗原肽的筛选研究,为获得特异性诊断试剂进而为肝癌的诊断提供依据.     

筛选与KDR有结合活性的小肽

目的：从噬菌体12肽库和环7肽库中,筛选能够与KDR分子有特异结合活性的小肽。方法：以KDR/IgGFc为靶分子筛选噬菌体12和肽7肽库,经过3轮筛选和竞争性洗脱后,由ELISA、细胞-ELISA和竞争结合实验,鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：从40个噬菌体克隆中得到12个能特异性与靶分子结合的阳性克隆,其中,6个噬菌体克隆与靶分子有较强的结合力,6个结合力较弱。结论：测序结果表明,12条小肽的一级结构中没有发现共同模式。特异性与KDR结合的活性小肽,有望在临床上作为放化疗药物的导向肽,以提高药物的选择性和降低其毒副作用。     

随机十二肽噬菌体展示文库筛选血型B抗原模拟多肽的实验研究

目的:筛选出替代血型B抗原的模拟多肽,用多肽抗原替代糖类抗原.方法:抗血型B抗原的单克隆抗体作为固相筛选靶分子,对随机十二肽噬菌体展示文库进行生物淘选(bio-panning),经包被-结合-洗脱-扩增等循环3轮,对筛选的克隆ELISA鉴定,并通过剂量依赖实验验证其结合特异性.最后提取DNA测序,确定模拟肽氨基酸序列.结果:3轮筛选结束,得到2个亲和力较强的十二肽序列TKNMLSL-PVGPG和HSLKHTQMSYSS.结论:经过生物筛选得到模拟多肽序列,利用噬菌体展示技术筛选糖类抗原的模拟肽具有可行性,为糖类抗原的研究提供一种新思路.     

胃癌SGC7901细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

目的筛选与人胃癌细胞株SGC7901特异性亲和的短肽,提高胃癌治疗的针对性。方法建立裸鼠胃癌模型,将噬菌体随机环7肽文库通过尾静脉注射入裸鼠体内,每轮筛选后测噬菌体效价。采用免疫组化及ELISA等方法,对目标噬菌体进行检测,提取噬菌体DNA,进行序列测定。结果经过4轮筛选,噬菌体在胃癌肿瘤组织中得以明显富集。免疫组化结果显示肿瘤组织为强阳性。ELISA结果显示:随机挑选的13个克隆中12个对SGC7901细胞的亲和力高。序列测定结果:PPRWMPS出现的次数最多。结论提示短肽PPRWMPS可能对荷瘤裸鼠模型的胃癌组织具有很强地结合力,有望成为胃癌治疗的靶点。     

中国人膀胱癌BIU-87细胞导向肽的体外筛选与特异性鉴定

目的：体外差减筛选噬菌体展示环七肽库,获得与中国人膀胱癌BIU-87细胞系高度结合的小分子多肽并鉴定其结合特异性。方法：以中国人膀胱癌BIU-87细胞作为靶细胞,正常人膀胱上皮细胞为吸附细胞,对噬菌体展示环七肽库进行3轮体外差减筛选。ELISA法鉴定与BIU-87细胞呈强阳性结合的噬菌体克隆,对其编码的DNA进行序列测定和同源性分析。化学合成与BIU-87细胞强阳性结合的肽段并制备成FITC标记的荧光探针,流式细胞术、荧光显微镜下鉴定其与BIU-87细胞、正常人膀胱上皮细胞、人前列腺癌PC3M细胞、人肝癌SMMC-7721细胞以及人结肠癌HCT116细胞的特异结合能力。结果：经3轮差减筛选将噬菌体展示环七肽库富集了25倍,阳性率达76%。共获得10个强阳性克隆,DNA共有序列为SISSLTH、MARYMSA、TVRTSAD。BIU-87细胞与小分子荧光探针FITC-SISSLTH的结合率为（80.06±8.78）%,显著高于FITC-MARYMSA的（52.93±7.28）%、FITC-TVRTSAD的（38.04±7.47%）、FITC-EDRKETA的（1.91±1.37）%和FITC的（985±29）%（均P<0.01）。FITC-SISSLTH与BIU-87细胞的结合率显著高于与正常人膀胱上皮细胞、人前列腺癌PC3M细胞、人肝癌SMMC-7721细胞和结肠癌HCT116细胞的结合率\[（80.06±8.78）% vs （13.89±1.97）%, （8.13±2.85）%, （2700±287）%, （2.33±1.75）%; 均P<0.01\]。结论：噬菌体展示环七肽库经3轮体外差减筛选获得高效结合BIU-87细胞的导向肽SISSLTH,具有良好的结合特异性。     

噬菌体肽库在宫颈癌血清肿瘤标志物筛选中的应用

目的:用噬菌体随机12肽库对宫颈癌患者血清进行差异性筛选,筛选出能与宫颈癌患者血清特异性结合的肿瘤标志物。方法:应用噬菌体随机12肽库对宫颈癌患者和正常人血清进行三轮差异性筛选,用ELISA法检测噬菌体克隆对宫颈癌患者血清结合的特异性。结果:经过三轮筛选,噬菌体富集率逐轮提高,提高近100倍。用ELISA法对50例宫颈癌患者血清和50例健康者血清检测验证,其中获得一株与宫颈癌患者血清特异结合较好的噬菌体,对宫颈癌的早期诊断具有潜在价值。结论:筛选出能与早期宫颈癌患者血清高亲和力特异结合的短肽,为研究宫颈癌肿瘤标志物及宫颈癌的早期诊断奠定了基础。     

胃癌肝高转移细胞结合肽的特异性鉴定

目的鉴定选择性噬菌体阳性克隆是否可与胃癌肝高转移细胞-XGC9811-L特异性结合。方法利用竞争结合试验检测噬菌体阳性克隆与XGC9811-L细胞的结合效率。竞争抑制实验确定阳性噬菌体与靶细胞的结合性是否通过外源呈现肽发挥作用。细胞结合ELI-1SA实验和免疫荧光技术鉴定phage20与靶细胞XGC9811-L结合的特异性。结果在8个阳性克隆中，phage20与XGC9811-L细胞的结合效率最高，达100％，是原噬菌体肽库的50倍，随着外源呈现肽浓度的增加，phage20与靶细胞的结合力随之减弱。phage20可与XGC9811-L特异结合，并可内化入细胞。结论在8个噬菌体阳性克隆中，phage20与XGC9811-L细胞具有高度结合力，并呈现出明显的细胞特异性。     

HAbl8G／CDl47拮抗肽的筛选及对肝癌细胞侵袭力的抑制

目的 筛选能与HAbl8G／CD147相结合的多肽，从中寻找该因子的肽类拮抗剂，抑制肝癌的恶性转移。方法 利用亲和层析法获得HAbl8G／CD147抗原，在此基础上通过筛选噬菌体12肽库得到与HAbl8G／CDl47相结合的多肽，以固相法合成这些多肽并用质谱仪进行鉴定。最后利用侵袭力抑制实验从中筛选拮抗肝癌细胞转移的功能多肽。结果 经纯化的HAbl8G／CD147分子量为65000，Western blot验证结果阳性。用此纯化分子筛选噬菌体肽库，得到9条多肽。经体外功能验证，9条肽抑制肝癌细胞侵袭力的活性不一，其中3条有显著活性(P＜0．01)，活性最好的一条肽能使穿过Boyden小室膜的肝癌细胞数量较对照减少90．1％。结论 以亲和层析法和噬菌体随机肽库法相结合，筛选获得了有抗肝癌细胞侵袭力功能的多肽，此结果为抗肝癌转移肽类药物的研制奠定了基础。     

从随机肽库中筛选血管内皮生长因子的抑制剂

目的：从随机噬菌体肽库中筛选血管内皮生长因子（VEGF165）的抑制剂,研究治疗实体瘤生长的小分子药物。方法：以VEGF165分子的受体KDR为靶分子,筛选随机噬菌体环7肽库,通过竞争性洗脱得到能特异结合KDR的阳性噬菌体,以ELISA、细胞免疫组化、细胞ELISA、鸡胚绒毛膜尿囊膜实验和MTT法,鉴定其结合活性和抑制活性。结果：得到5个能特异结合靶分子的阳性噬菌体克隆,它们均可以与表面有KDR表达的细胞结合,其中噬菌体克隆3和13还能抑制VEGF165诱导鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成的活性。但MTT法结果显示,这两种噬菌体小肽对高表达KDR的阳性细胞生长没有明显的抑制活性。结论：从随机噬菌体肽库筛选到了能抑制VEGF165生物活性的克隆,为进一步研究小分子抑瘤药物提供了一定基础。