乙肝核酸疫苗诱导BALB/C小鼠的CTL免疫应答

目的：研究携带HBsAg基因的载体质粒pcDHBs诱导小鼠CTL应答效果。方法：将HBsAg基因连接到真核表达载体pcDNA3．1上，构建成载体质粒pcDHBs。将纯化后的质粒pcDRBs和pcDNA3．1肌肉注射免疫小鼠，眼眶采血检测血清中抗体水平。用质粒pcDHBs转染P815细胞制备乙肝疫苗诱导BALB／C小鼠CTL活性检测的靶细胞。免疫后，取脾细胞，按效靶比为10：1、25：1、50：1进行CIL杀伤检测。结果：免疫pcDHBs疫苗后，检测到小鼠血清中的RBsAb。用pcDHBs进行转染的P815细胞能够检测到HBsAg基因片段和蛋白质抗原的表达。用pcDHBs免疫组小鼠的CTL杀伤率均明显高于pcDNA3．1免疫组。结论：质粒pcDHBs作为核酸疫苗能够诱导小鼠体液免疫应答和CTL免疫应答。     

表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因的DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答

目的 :检测表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答效果。方法 :将真核表达质粒pVAXGE肌肉注射BALB C小鼠 ,观察免疫小鼠脾T淋巴细胞亚群的数量、特异性CTL杀伤率及小鼠免疫后不同时间点血清中IgG抗体滴度。结果 :重组质粒pVAXGE免疫组小鼠脾淋巴细胞进行了增殖 ,脾特异性CTL杀伤率显著高于对照组 (P <0 0 1) ;小鼠免疫后于第 8周血清抗体达到最高。结论 :表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗质粒可诱导BALB C小鼠发生免疫应答     

恶性疟原虫AMA1不同类型疫苗组合免疫接种研究

目的 探索应用恶性疟原虫DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种，诱导针对恶性疟原虫红内期抗原AMA1的保护性抗体。方法PCR扩增云南株恶性疟原虫AMA1编码基因，构建和制备DNA免疫质粒VR1020/E（疫苗D）、重组改良安卡拉痘苗病毒rMVME（疫苗V）和重组原核表达AMAl胞外域蛋白E（疫苗P）。用疫苗D单独或与小鼠GM-CSF表达质粒共同对小鼠进行初始免疫，用疫苗V和疫苗P进行单次或先后各一次追加强化。采用疫苗D-V组合方案免疫新西兰白兔。ELISA测定小鼠血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a的水平，用免疫动物血清进行疟原虫裂殖子体外入侵抑制实验。结果在疫苗D初始免疫的基础上，采用疫苗V或疫苗P进行强化免疫可显著提高小鼠针对AMA1的抗体应答，小鼠血清特异性IgG平均增加15至137倍，GM-CSF表达质粒对疫苗D-V组合免疫小鼠的抗体应答有显著促进作用。采用疫苗D-V组合免疫在家兔可诱导明显的抗体应答。小鼠和家兔免疫血清在体外可显著抑制疟原虫裂殖子对RBC的入侵。结论将DNA疫苗、重组改良安卡拉痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种是诱导疟疾红内期保护性抗体的有效方法。     

多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答的研究

目的:构建多CTL表位DNA疫苗诱导特异性CTL应答。方法:将编码两个HCVCTL表位(H-2d)的基因序列插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建多CTL表位DNA疫苗。用其免疫BALB/c小鼠后,以经不同CTL抗原肽冲击的P815细胞(H-2d)作为靶细胞,进行CTL杀伤试验。结果:多CTL表位DNA疫苗可诱导机体产生针对其编码的两种HCVCTL表位的特异性CTL免疫应答,且总的特异性CTL杀伤效应增强。结论:通过天然侧翼氨基酸相连的多个CTL表位为编码序列构建的多CTL表位DNA疫苗,不但能诱导机体产生针对各个CTL表位的特异性CTL应答,而且各特异性CTL应答的联合作用可显著增强总的CTL杀伤效应。     

HIV DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫效果的研究

目的 构建含HIV-1B亚型中国株gagV3基因的DNA疫苗及重组腺病毒伴随病毒(rAAV)疫苗，并研究DNA疫苗和rAAV联合免疫的免疫效果。方法 将HIV-1B亚型中国株gagV3基因克隆入真核表达载体pCI-neo上，构建了含HIV-1 gagV3基因的DNA疫苗pCI-gagV3。采用电击法将pCI-gagV3质粒转染p815细胞，用G418压力筛选，得到转入重组质粒的细胞系p815-gagV3，用免疫酶法检测细胞系中HIV-1基因的表达。用该DNA疫苗进行小鼠免疫实验，检测免疫效果；用该DNA疫苗初次免疫，含同样gagV3基因的重组腺病毒伴随病毒rAAV-gagV3加强免疫，采用免疫酶法检测免疫小鼠血清中HIV-1特异性的抗体水平，用乳酸脱氢酶法检测免疫小鼠的HIV-1特异性CTL水平。结果 pCI-gagV3可以在p815细胞中表达HIV-1的基因，免疫BALB／c小鼠后可以在小鼠体内诱发HIV-1特异性的细胞和体液免疫反应。HIV-1特异性抗体滴度为1：20；效靶比为50：1时，CTL平均杀伤率为41．7％。pCI-gagV3与rAAV-gagV3联合免疫并不能明显提高抗体水平，但可以提高CTL反应，效靶比为50：1时，CTL平均杀伤率为61.3％，高于单独用DNA疫苗或重组AAV疫苗免疫后产生的CTL活性。结论 DNA疫苗与重组腺病毒伴随病毒联合免疫可以提高免疫小鼠产生的HIV-1特异性CTL反应。     

共刺激分子4-1BBL基因免疫对HBsAg核酸疫苗诱导小鼠特异性免疫应答的影响

目的 研究共刺激分子4-1BBL基因免疫对HBsAg核酸疫苗诱导小鼠特异性体液和细胞免疫应答的影响.方法 将HBV表面抗原核酸疫苗pcDS2单独或联合共刺激分子4-1BBL质粒肌肉注射免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测小鼠血清抗-HBs IgG及亚型IgG1和IgG2a;迟发型超敏反应(DTH)反应检测体内细胞反应;流式细胞仪检测CD4+ T淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ及CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ水平;流式细胞仪检测小鼠脾细胞HBsAg特异性体外细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用(CTL).结果 与单纯免疫核酸疫苗pcDS2组比较,pcDS2和4-1BBL联合免疫组小鼠的抗-HBs水平显著提高,抗-HBs IgG亚类以IgG2a占优;免疫小鼠经HBsAg脚掌皮下刺激后,联合免疫组小鼠脚掌的厚度显著高于pcDS2组;联合免疫组CD4+T淋巴细胞的IL-4和IFN-γ表达水平及CD8+T淋巴细胞的IFN-γ表达水平显著升高;DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBsAg特异性体外CIL杀伤作用高于对照组,其中联合免疫组小鼠的体外CTL杀伤作用最强.结论共刺激分子4-1BBL不仅能增强HBV DNA疫苗诱导特异性体液免疫应答,还能增强特异性型细胞免疫反应,尤其增强体内CIL的杀伤活性.     

RSV CTL表位与G蛋白片段的融合表达对G蛋白片段诱导的免疫应答的调节作用

目的：观察呼吸道合胞病毒（RSV）的CTL表位F/M2与G蛋白抗原活性片段G1融合表达后，对G1诱导的免疫应答的调节作用。方法：将重组表达质粒pET-DsbA-G1和pET-DsbA-G1F/M2分别转化E.coli BL21（DE3），诱导表达融合蛋白DsbA-G1和DsbA-G1F/M2，亲和层析纯化。取上述蛋白，腹腔注射免疫BALB/c小鼠，定期采集血清和脾细胞，用MTT法测定CTL杀伤活性，ELISA测定IgG及其亚类IgG1和IgG2a抗体滴度，空斑抑制实验检测血清中和抗体。结果：经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白；DsbA-G1F/M2诱导了显著的RSV特异性CTL杀伤活性，而无CTL表位的DsbA-G1则不能诱导产生CTL反应；DsbA-G1F/M2和DsbA-G1均刺激产生了强烈的IgG抗体应答，但DsbA-G1所产生的IgG亚类仅为IgG1，而DsbA-G1F/M2同时诱导了高滴度的IgG1和IgG2a，显著下调了IgG1与IgG2a的比例；二者均诱导了高滴度的中和抗体，但与DsbA-G1相比，DsbA-G1F/M2所诱导的中和抗体滴度有所减弱。结论：CTL表位F/M2与G蛋白片段G1的融合表达产物DsbA-G1F/M2，能够同时诱导细胞免疫和体液免疫应答，CTL的激活下调了IgG1与IgG2a的比例，使得免疫应答更平衡，有利于改善该候选疫苗的安全性。     

IL-12和IL-18基因免疫对HBcAg核酸疫苗诱导小鼠(H-2d)特异性免疫应答的影响

目的：观察IL-12和IL-18基因免疫对HBcAg核酸疫苗诱导小鼠（H-2d）特异性体液免疫和细胞免疫应答的影响.方法：用肌肉注射法将HBV核心区DNA疫苗、IL-12质粒和IL-18 质粒接种BALB/c小鼠;ELISA法检测小鼠血清抗-HBc（IgG）及IgG亚类（IgG1、IgG2a）;LDH释放法检测小鼠脾细胞HBcAg特异性CTL活性.结果：免疫6周后,HBcAg DNA疫苗联合IL-12质粒、IL-18质粒和IL-12＋IL-18质粒组小鼠的血清抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0.05）,抗HBc IgG亚类以IgG2a占优.DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤率均高于对照组（P组）,其中C＋IL-18组和C＋IL-12＋IL-18组中CTL值明显高于C组,尤以C＋IL-12＋IL-18组中的CTL杀伤率最高.结论：IL-12和IL-18基因与HBcAg DNA疫苗联合免疫,不仅能增强HBcAg特异性体液免疫应答,而且能增强HBcAg特异性CTL的杀伤活性.     

共表达HIV-1 gag-gp120与IL-6重组鸡痘病毒和核酸疫苗的联合免疫研究

目的探讨共表达HIV-1 gag-gpl20与IL-6重组鸡痘病毒和核酸疫苗联合免疫小鼠的免疫应答。方法以重组鸡痘病毒首免，以表达相同抗原的核酸疫苗质粒追加免疫，检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平。结果联合免疫组脾特异性CTL杀伤活性比重组鸡痘病毒单独免疫组、核酸疫苗单独免疫组、鸡痘病毒疫苗株对照组和空白质粒对照组高，血清抗体水平显著高于空白质粒对照组和鸡痘病毒疫苗株对照组，但与重组鸡痘病毒单独免疫组、核酸疫苗单独免疫组之间差异无显著性。结论重组鸡痘病毒和核酸疫苗的联合免疫可诱导小鼠产生更强的细胞免疫应答。     

pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的：构建pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，观察其在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤免疫应答的能力。方法： 通过RT-PCR构建重组表达质粒pcDNA3.1+/MAGE-3；以pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗免疫已接种肿瘤细胞的小鼠，每10 d重复免疫1次，共3次，以pcDNA3.1+、PBS为对照。末次免疫后5 d检测血清中MAGE-3抗体滴度、小鼠脾淋巴细胞的细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）杀伤活性、细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度，同时计算抑瘤率。结果： 成功构建了pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，用此疫苗免疫已接种B16/MAGE-3细胞的小鼠后，能诱导小鼠脾淋巴细胞MAGE-3特异性的杀伤活性，脾细胞培养上清中细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度明显增高，血清中抗MAGE-3抗体在1∶20滴度时阳性，肿瘤生长被显著抑制，与pcDNA3.1+组、PBS组相比，差异显著（P＜0.01）。结论： 成功构建了pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，该疫苗在小鼠体内既能激活CTL杀伤活性和CD4+ T细胞活性，又能激活体液免疫反应，从而诱导出特异性的抗肿瘤免疫应答。     

包裹天然骨架CpG ODN和HBsAg的非磷脂脂质体疫苗的免疫效果

非磷脂脂质体NovasomeR○(Np )是由Brij5 2、胆固醇和油酸组成 ,可作为同时传递佐剂和抗原的载体。我们将HBsAg与天然骨架CpGODN (phosphodiesterCpGODN ,pdCpGODN )包裹于Np后免疫BALB/c小鼠 ,检测其免疫效果。结果显示 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np在小鼠中诱导了很高滴度的抗 HBs抗体产生并诱生了HBsAgS2 8 3 9特异性的CTL ,而铝佐剂组和仅包裹HBsAg的Np组诱生的抗体滴度较低 ,未检测到CTL活力。抗体亚类分析结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np诱生的免疫应答类型与pdCpGODN剂量有关 ,较低剂量 (2 4 μgpdCpGODN )诱生的为IgG2a为主的Th1型应答 ,而较高剂量(4 7μgpdCpGODN )诱生的是Th1/Th2混合型应答。铝佐剂和仅包裹HBsAg的Np组诱生的是以IgG1为主的Th2型应答。此外 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np免疫小鼠脾淋巴细胞在体外HBsAg刺激培养后特异性增殖并分泌高水平的IFN γ。这些结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np能增强HBsAg的免疫原性 ,诱生体液 /细胞免疫均衡应答 ,有可能发展为慢性乙肝的治疗性疫苗     

Immunomodulatory effect of a plasmid expressing CD40 ligand on DNA vaccination against human immunodeficiency virus type-1

CD40 ligand is a costimulatory molecule which acts a potent immunomodulator. We found the mice inoculated with human CD40 ligand expression plasmid (pMEhCD40L) combined with human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) DNA vaccine exhibited both humoral and cellular antigen-specific immunological enhancement. The expression of hCD40L induced predominantly antigen-specific immunoglobulin G (IgG) antibody response while it failed to induce mucosal IgA response. Delayed-type hypersensitivity (DTH) and cytotoxic T lymphocyte (CTL) activity were induced in a dose-dependent manner. Examination of the relative levels of the two IgG subclasses showed that co-injection of pMEhCD40L enhanced IgG2a response without suppressing IgG1 response. Similarly, the expression of pMEhCD40L enhanced not only T helper 1 (Th1)- but also Th2-type cytokine production. In conclusion, co-inoculation of pMEhCD40L with DNA vaccine was shown to be a useful way to enhance CTL responses without suppressing the humoral immune response in acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients.     

手足口病CA16型VP1亚单位疫苗的构建制备及免疫原性初步分析

目的 制备CA16型VP1蛋白疫苗并进行免疫原性初步分析,为手足口病CA16疫苗的深入研究提供资料.方法 利用RT-PCR技术获得CA16 VP1基因,克隆到载体pFastBac HT A,与Bacmid DNA重组,转染Sf9昆虫细胞,重组CA16 VP1蛋白与Al(OH)_3佐剂混合制备重组CA16 VP1蛋白疫苗,腹腔免疫BALB/c小鼠,2次免疫后进行免疫效果初步评价.结果 用间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western blot法,证明重组CA16 VP1蛋白在昆虫细胞Sf9中得到表达,用ELISA和微量中和法检测到免疫小鼠血清有特异IgG和中和抗体产生,最佳免疫抗原剂量为20μg,其特异IgG效价为1:1600,中和抗体效价为1:250;通过淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定,证明诱导T细胞应答,诱发Th1/Th2型免疫应答.结论 CA16 VP1基因克隆成功,并在Sf9昆虫细胞中获得表达,构建的蕈组CA16 VP1亚单位疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为今后研制手足口病CA16疫苗奠定了基础.     

SARS冠状病毒S蛋白C端片段基因的克隆及其DNA疫苗的免疫学研究

目的：构建抗原基因为SARS冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoY）S蛋白C端片段基因的DNA疫苗，采用肌注和滴鼻的方法接种小鼠后观察肌肉注射途径和黏膜途径免疫使机体产生免疫应答的情况。方法：将S蛋白C端片段克隆至真核表达载体pcDNA3．1（-），随之将重组质粒进行小鼠肌肉和黏膜免疫，定期检测外周血中抗SARS-CoV的病毒特异性抗体水平，流式细胞仪观察其淋巴细胞表型变化，免疫组化检测抗原表达分布，脾细胞增殖实验评价CTL效果。结果：疫苗注射后15天就能在血清中检测出病毒特异性抗体。随着时问的延续，抗体水平逐步升高，至30天后达到稳定，以CTL为主的CD8^＋T淋巴细胞的百分比含量增加极显著，引起强大的体液免疫和细胞免疫；疫苗滴鼻后45天可在鼻黏膜检测到抗原表达；而空载体质粒对照组未检测出明显的特异性免疫应答。结论：以S蛋白C端片段基因为抗原基因的DNA疫苗通过肌注和滴鼻能诱导小鼠针对SARS病毒强大的免疫应答。     

Improved Humoral and Cellular Immune Responses Against the gp120 V3 Loop of HIV-1 Following Genetic Immunization with a Chimeric DNA Vaccine Encoding the V3 Inserted into the Hepatitis B Surface Antigen

The gp120-derived V3 loop of HIV-1 is involved in co-receptor interaction, it guides cell tropism, and contains an epitope for antibody neutralization. Thus, HIV-1 V3 is an attractive vaccine candidate. The V3 of the MN strain (MN V3) contains both B- and T-cell epitopes, including a known mouse H-2^d-restricted cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitope. In an attempt to improve the immunogenicity of V3 in DNA vaccines, a plasmid expressing MN V3 as a fusion protein with the highly immunogenic middle (pre-S2 + S) surface antigen of hepatitis B virus (HBsAg) was constructed. Epidermal inoculation by gene gun was used for genetic immunization in a mouse model. Antibody and CTL responses to MN V3 and HBsAg were measured and compared with the immune responses obtained after vaccination with plasmids encoding the complete HIV-1 MN gp160 and HBsAg (pre-S2 + S), respectively. DNA vaccination with the HIV MN gp160 envelope plasmid induced a slow and low titred anti-MN V3 antibody response at 12 weeks post-inoculation (p.i.) and a late appearing (7 weeks), weak and variable CTL response. In contrast, DNA vaccination with the HBsAg-encoding plasmid induced a rapid and high titred anti-HBsAg antibody response and a uniform strong anti-HBs CTL response already 1 week p.i. in all mice. DNA vaccination with the chimeric MN V3/HBsAg plasmid elicited humoral responses against both viruses within 3–6 weeks which peaked at 6–12 weeks and remained stable for at least 25 weeks. In addition, specific CTL responses were induced in all mice against both MN V3 and HBsAg already within the first 3 weeks, lasting at least 11 weeks. Thus, HBsAg acts as a ‘genetic vaccine adjuvant’ augmenting and accelerating the cellular and humoral immune response against the inserted MN V3 loop. Such chimeric HIV–HBsAg plasmid constructs may be useful in DNA immunizations as a ‘carrier’ of protein regions or minimal epitopes which are less exposed or poorly immunogenic.     

酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白的免疫原性研究

目的评价毕赤酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在Balb／c小鼠诱导体液和细胞免疫的能力。方法利用重组Gag蛋白单独及与重组DNA或痘苗联合免疫Balb／c小鼠，检测小鼠产生的特异性结合抗体和IgG1／IgG2a，同时检测T淋巴细胞增殖反应和CTL反应。结果3个蛋白单独免疫组均能诱导小鼠产生抗体和T淋巴细胞增殖反应，其中不加佐剂的免疫组诱导免疫反应低于其它两组。但3组的CTL杀伤活性均不明显。重组蛋白和重组DNA及痘苗联合免疫均诱导产生了较好的体液和细胞免疫反应，而且重组痘苗初始免疫一蛋白加强免疫组还诱导产生了较强的CrL反应。结论酵母表达的HIV-1 Gag蛋白具有良好的免疫原性，在与重组DNA和痘苗疫苗联合使用时具有协同作用，能刺激动物产生更强的HIV-1特异性体液和细胞免疫反应。本研究为构建HIV-1蛋白疫苗和探讨各类疫苗的联合免疫方式提供了有价值的参考数据。     

乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性

目的 :探讨HBV复合多表位DNA疫苗诱导体液及细胞免疫的可行性。方法 :将HBV多表位抗原基因BPT克隆到真核表达载体pcDNA3.1中 ,构建重组真核表达载体pcDNA3.1/BPT。将其通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠 ,用间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验 ,检测特异性体液免疫和细胞免疫的水平 ,并观察其对免疫小鼠的毒副作用。结果 :用重组质粒pcDNA3.1/BPT免疫BALB/c小鼠后 ,在效靶比为 10 0∶1时 ,可诱导显著地特异性CTL应答 (P <0 .0 5 )。ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG的水平明显升高 (P <0 .0 5 )。在BPT基因原核表达蛋白的刺激下 ,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖显著 (P <0 .0 5 )。RT PCR分析表明 ,IL 12mRNA的水平亦明显升高。结论 :HBV多表位基因疫苗可诱发特异性免疫应答 ,为预防、治疗性HBV疫苗的研制提供了一定的实验依据