针对乙酰肝素酶基因的短发夹RNA干扰载体的构建

目的 构建对人乙酰肝素酶(hpa)基因有特异性抑制作用的短发夹RNA(ahRNA)表达载体.方法 根据GenBank数据库提供的hpa基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒...     

RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。     

短发卡样RNA抑制c-myc癌基因在乳腺癌细胞中的过度表达

目的构建人cmyc癌基因特异性短发卡样RNA(shRNA)真核表达载体,抑制靶基因cmyc在乳腺癌细胞中的过度表达。方法设计有小发夹结构的三条寡核苷酸序列,克隆至空载体pEGFPC1/U6中构建重组体并体外转染乳腺癌细胞株MCF7,48h后分别用RTPCR和Westernblot方法检测胞内cmyc癌基因mRNA水平和蛋白水平。结果①成功构建shRNA真核表达载体;②shRNA表达载体转染MCF7细胞48h后,pEGFPC1/U62能明显下调胞内cmycmRNA水平和蛋白水平(P<0.01)。结论构建的shRNA真核表达载体能显著抑制cmyc癌基因在MCF7细胞中的过表达。     

ssp411基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选

目的 为探索精子细胞特异表达的新基因ssp411在受精及早胚发育中的功能,设计并构建了以ssp411基因为靶点的RNA干扰表达载体siRNA-ssp411s,筛选其中对ssp411基因有显著干扰作用的表达质粒.方法 根据已知的ssp411 mRNA序列,选择设计三条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到含有U6启动子的载体pRNAT-U6.1中并测序分析.用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒ssp411-pDsRed共转染293T细胞,24h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过实时定量PCR方法检测不同干扰质粒对ssp411 mRNA的干扰效果.结果 3个ssp411的siRNA片断被成功克隆到pRNAT-U6.1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致.实时定量PCR结果表明,针对ssp411基因蛋白编码区3-22序列构建的干扰质粒效果最好,干扰效率可达71%.结论 成功构建了能表达ssp411 shRNA(small hairpin RNA)的重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到一个干扰效果达70%以上的干扰片断,为建立转基因RNA干扰小鼠模型,在体内研究ssp411基因及蛋白的生殖生物学功能打好基础.     

乙酰肝素酶基因靶向特异性RNA干扰重组表达载体的构建及筛选

目的 构建对人乙酰肝素酶(HPA)基因有特异性抑制作用的短发夹状RNA表达载体.方法 根据GenBank数据库提供的人HPA基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆.用脂质体转染人MDA-MB-231细胞,分别以荧光定量PCR、Western blot分析其对HPA在mRNA水平和蛋白质水平上表达的影响.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功.在构建的5个载体中,HPSE-1组及HPSE-5组中MDA-MB-231细胞HPA基因mRNA和蛋白质表达水平明显下降,而对照组未发生明显改变.结论 成功构建了2个靶向人HPA的shRNA表达载体,转染MDA-MB-231细胞后可高效抑制HPA基因表达,为进一步研究HPA的表达与乳腺癌迁移和侵袭的机制奠定了基础.     

靶向CCR7基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计并构建靶向CCR7基因shRNA真核表达质粒,并检测其干扰效果。方法以CCR7为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pGC-silencer-CRM30载体,构建的3条重组短发夹shRNA表达载体分别命名为pGC-silencer-CRM30-CCR7A、-CCR7B和-CCR7C。采用测序法鉴定寡核苷酸序列。将构建好的真核表达载体转染人结肠癌SW480细胞,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR法检测CCR7干扰效率。结果重组质粒测序结果与Genebank中的CCR7 cDNA序列相符,转染SW480细胞后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白,RT-PCR结果表明,pGC-silencer-CRM30-CCR7C干扰效果最强。结论靶向CCR7基因shRNA表达载体构建无误,为进一步探讨趋化因子受体CCR7在胃肠道恶性肿瘤生物学行为中的作用奠定了基础。     

Survivin靶向的短发夹RNA表达载体的构建

目的：构建存活素（Survivin）基因短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）重组质粒并测序鉴定,为下一步探索乳腺癌基因治疗的RNA干扰途径建立基础。方法：设计并合成有小发夹结构的8条DNA片段,退火成互补双链后克隆至pSilencer adeno 1．0-CMV载体中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5。菌株,提取质粒行酶切鉴定后测序分析。结果：酶切鉴定和测序结果证实构建成功。结论：survivin shRNA重组质粒的成功构建为下一步用腺病毒包装,并感染荷瘤裸鼠行靶向RNA干扰抗乳腺癌的研究打下基础。     

Rictor基因特异性RNA干扰表达载体的构建和筛选

目的构建针对Rictor基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人膀胱癌T24细胞,观察其对目的基因Rictor表达的影响,为探讨沉默Rictor基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响奠定基础。方法根据GENEBANK提供Rictor基因系列,设计并化学合成三对Rictor-RNAi和一对阴性对照寡核苷酸序列,定向克隆入真核质粒载体pGCSIL-PUR中,构建pGCSIL-RICTOR-RNAi表达载体。各质粒载体瞬时转染到T24细胞,Western-Blot检测筛选载体。筛选出的载体稳定转染,Realtime-PCR和Western-Blot筛选干扰效果明显的稳定株。结果重组质粒pGCSIL-RICTOR-RNAi经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,成功构建Rictor-RNAi载体。瞬时转染T24细胞,RICTOR蛋白表达明显降低。稳定转染T24细胞,Rictor基因表达在mRNA水平和蛋白水平均明显降低。结论成功构建Rictor-RNAi表达载体,转染T24细胞后可有效抑制Rictor表达。     

构建RNA干扰载体特异性抑制绿色荧光蛋白表达的研究

目的:利用PCR构建RNA干扰质粒载体的方法,促进RNA干扰技术的广泛开展.方法:PCR方法获得小鼠U6 27启动子序列,以及干扰绿色荧光蛋白(EGFP)表达的siRNA的相应DNA模板序列.将其序列克隆入pUC19,获得RNA干扰载体pU6-siEGFP.将pU6-siEGFP及pcDNA3.1/EGFP共转导COS-7细胞,观察EGFP表达情况.结果:所构建的pU6-siEGFP能够成功干扰COS-7细胞中EGFP的表达.结论:PCR方法成功构建了RNA干扰载体,为RNA干扰技术在更多实验室的广泛开展奠定基础.     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

质粒介导的短发卡状RNA特异性抑制大肠癌cerb-B1基因的表达

目的:体外构建编码人类基因cerb-B1短发卡状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的质粒表达载体,观察其对结肠癌LoVo细胞cerb-B1基因和表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的特异性抑制作用.方法:体外合成cerb-B1基因的DNA模板引物,和Pgenesil-1质粒构建编码shRNA的表达载体.应用脂质体Lipofectamine 2000转染人结肠癌LoVo细胞,转染成功后以G418筛选4周,实时荧光定量RT-PCR(Real Time RT-PCR)检测cerb-B1基因的mRNA表达,Western-blot检测EGFR蛋白的表达.结果:质粒载体经酶切鉴定证实DNA模板插入质粒成功,且测序与设计结果相符,成功的构建了针对原癌基因cerb-B1的质粒表达载体.质粒载体成功转染后,cerb-B1基因mRNA表达下降了(81.3±2.8)%,EGFR蛋白表达下降了(73.4±2.3)%,和对照质粒载体组比较有显著性差异.结论:说明本研究构建的针对cerb-B1基因的质粒表达载体可以显著抑制cerb-B1基因和EGFR蛋白在人结肠癌LoVo细胞的表达,为结肠癌的基因治疗提供了新的思路.     

VEGF shRNA表达质粒的构建及对血管内皮细胞VEGF表达的抑制

目的：构建大鼠血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shor thairpin RNA,shRNA）真核表达质粒,观察其对大鼠主动脉血管内皮细胞（ECs）中VEGF表达的影响.方法：采用DNA重组技术根据大鼠VEGF mRNA序列设计并合成3条shRNA寡核苷酸片段,构建表达质粒并通过脂质体介导转染ECs,采用RT-PCR,Western Blot方法分别检测VEGF mR-NA及蛋白质的表达.结果：经酶切和测序证实VEGF shRNA重组质粒构建成功.3条VEGF shRNA质粒均可下调VEGF mRNA和蛋白的表达,其中VEGF shRNA3质粒的抑制作用较强,转染72h时VEGF mRNA和蛋白的抑制率可分别达到71.91%和67.86%.结论：成功构建VEGF靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制ECs中VEGF mRNA和蛋白的表达,为利用RNA干扰技术从转录后水平抑制角膜新生血管的研究提供依据.     

靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义

目的：构建针对呼吸道合胞病毒（RSV）M2基因mRNA的短发卡结构状RNA（shRNA）重组载体质粒，为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础；方法：按shRNA设计原则，选择RSV—M2基因作为靶基因，设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列，中间以9bp序列间隔，经退火形成互补双链，克隆至转录载体pgenesil-1上，重组质粒经酶切和测序鉴定，然后将构建成功的重组质粒转染HEP2细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率。结果：将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上，经酶切及序列鉴定为目的序列，并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达。结论：成功构建了针对RSVM2基因mRNA的shRNA重组载体质粒，可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制，从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段。     

人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定

目的 构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的RNA干扰（RNAi）表达载体。方法 化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到pSilencer1．0-U6 shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）启动子的下游，构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。结果 经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。结论 已成功构建pSliencer-hTERT载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。     

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的：设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR( RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109 TU/ml,pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备

目的：构建并制备携带靶向干扰VEGF165基因shRNA的重组腺相关病毒载体．方法：将PCR法扩增所得EGFP-U6-shRNA（VEGF165）片段插入载体质粒pSNAV2．0-lacz-α的EcoRI和SalI酶切位点,构建重组质粒pSNAV2．0-EGFP—U6-shRNA（VEGF165）．以HSV1-RapCap／△UL2为辅毒,包装rAAV2-EGFP-U6-shRNA（VEGF165）病毒．对所获病毒载体进行PCR,SDS-PAGE鉴定分析、滴度测定和EGFP的活性检测．结果：PCR,SDS-PAGE鉴定分析结果表明靶向干扰VEGF165基因的shRNA片段成功包装入重组AAV2载体,病毒纯度在98％以上．点杂交法测定重组病毒载体基因组滴度约为3×10^14v．g．（vector genomes）／L．EGFP活性检测显示重组AAV2感染细胞阳性率在30％以上．结论：成功制备了rAAV2-EGFP-U6-shRNA（VEGF165）病毒载体,为通过RNA干扰技术特异性抑制VEGF基因的表达来阐明VEGF在缺血性脑损伤后各种生物学事件中的作用奠定了实验基础．     

Influence of osteopontin short hairpin RNA on the proliferation and invasion of human renal cancer cells

The influence of short hairpin RNA(shRNA)-mediated osteopontin(OPN)gene silencing on the proliferation and invasion of human renal cancer ACHN cells was investigated.Four types of OPN shRNA recombinant plasmids were constructed and RT-PCR assays were used to screen the most highly functional shRNA recombinant plasmids,which were transferred into the cultured ACHN cells by LipofectamineTM 2000.The cells transfected by shRNA expression vectors(ACHN/OPN)were visualized under an inverted microscope and screened...