HPV16E6和E7对乳腺癌细胞侵袭能力的影响及其机制

目的探讨HPV16E6、E7和E6/E7同时稳定高表达对乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力的影响及其机制。方法利用脂质体介导将HPV16E6、E7和全长E6/E7转染MCF-7细胞,利用Western blot检测转染后E6和E7的表达。采用Transwell实验检测MCF-7细胞侵袭能力的变化,RT-PCR法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA的表达情况。结果在MCF-7-E6细胞克隆中,克隆1表达水平最高;MCF-7-E7细胞克隆中,克隆4表达水平最高;MCF-7-E6/E7细胞克隆中,克隆4表达水平最高。与MCF-7亲本和MCF-7-vect细胞比较,MCF-7-E6和MCF-7-E6/E7细胞穿过小室底膜的细胞数均显著增加(P<0.01)。在MCF-7-E6、MCF-7-E7和MCF-7-E6/E7细胞中MMP-2mRNA表达均显著增加。结论 HPV16E6和E7促进MCF-7细胞体外侵袭能力的机制之一可能是通过诱导MMP-2的表达。     

HER2基因的克隆及其在MCF-7细胞中的表达

目的克隆人表皮生长因子受体（HER2）基因,建立共表达HER2基因和雌激素受体（ER）基因的MCF-7细胞模型.方法从高表达HER2的人乳腺癌细胞株SKBR-3中,用RT-PCR技术克隆HER2基因全长cDNA,将其插入载体pcDNA3.1中构建重组真核表达载体pcDNA3.1-HER2.测序鉴定后,利用阳离子脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用免疫细胞化学、流式细胞术及Western blotting等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况.结果DNA测序证明,获得的HER2基因序列与GenBank中报道序列完全一致.将其转染MCF-7细胞,经流式细胞术、Western blotting及免疫细胞化学等方法检测证实,转染细胞内有HER2基因高表达.结论成功克隆HER2基因并获得共表达HER2基因和ER基因的MCF-7细胞株.     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

乳腺癌细胞中E1AF,MMP-1和MMP-9的表达及其相关性

目的 探讨雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌细胞MCF-7和雌激素受体阴性(ER-)乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-435s中E1AF,MMP-1和MMP-9表达情况及相关性.方法 应用免疫细胞化学技术检测3种不同乳腺癌细胞中MMP-9的表达,采用RT-PCR方法检测细胞株中E1AF,MMP-1及其mRNA表达.结果 ER(-)乳腺癌细胞MDA-MB-231中E1AF基因、MMP-1及其mRNA的表达水平与MMP-9的表达高于ER(+)乳腺癌细胞MCF-7和ER(-)乳腺癌细胞MDA-MB-435s.结论 乳腺癌细胞中E1AF的表达与MMP-1,MMP-9的表达存在相关性,E1AF可能是乳腺癌侵袭转移的重要因子.     

人乳头瘤病毒16型E6、E7反义RNA对人宫颈癌SiHa细胞的恶性逆转作用

通过真核表达载体介导HPV16型E6、E7基因反义RNA在SiHa细胞中的表达，探讨反义RNA能否降低E6、E7基因的表达和诱导细胞凋亡。利用pEGFP构建HPV16型E6、E7基因反义RNA的真核表达载体并转染SiHa细胞。利用RT-PCR和Western blot技术检测转染后E6、E7基因的mRNA和蛋白的变化，利用MTT法检测SiHa细胞转染后细胞增殖活性，利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测转染后细胞的凋亡情况。     

HPV16-E6、E7蛋白在宫颈癌组织中的表达与病理特征的相关性

目的探讨HPV16-E6、E7蛋白在宫颈癌(CC)组织中的表达与病理特征的相关性。方法56例CC患者设为A组,43例高度鳞状上皮内病变(HSIL)患者设为B组,48例低度鳞状上皮内病变(LSIL)患者设为C组。3组均采集病理组织样本行HPV16-E6、E7蛋白检测,对比3组HPV16-E6、E7蛋白阳性率,探讨CC患者淋巴结转移、肿瘤最大径、临床分期、病理类型、宫旁浸润等病理特征与HPV16-E6、E7蛋白阳性的相关性。结果A组HPV16-E6、E7蛋白阳性率均高于B组、C组(均P<0.05),B组HPV16-E6、E7蛋白阳性率均高于C组(均P<0.05);HPV16-E6、E7蛋白阳性率与CC患者年龄、肿瘤最大径、淋巴结转移及组织学分级间差异均无统计学意义(均P>0.05),与临床分期、宫旁浸润及病理类型差异均有统计学意义(均P<0.05);CC患者HPV16-E6阳性与HPV16-E7阳性呈正相关(r=0.542,P<0.05)。结论HPV16-E6、E7蛋白在CC患者癌组织中表达水平较高且与病理特征间存在相关性。     

人乳头状瘤病毒16E7在人喉癌细胞系中的转染及表达

目的:构建含人乳头状瘤病毒16E7(HPV16E7)基因的真核表达载体,观察HPV16E7对人喉癌HEp-2细胞系生物学特性的影响,为后续实验提供研究对象.方法:以含HPV16E7基因的中间质粒pET28a-HPV16E7为模板扩增出HPV16E7基因全长序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,并进行序列分析和酶切鉴定.电穿孔法将重组体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入喉癌HEp-2细胞中,Western 印迹法检测HPV16E7蛋白的表达,相差显微镜观察转染前后的HEp-2细胞系形态学变化,流式细胞仪检测转染前后细胞生长周期的改变.结果:成功构建并将pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入人喉癌HEp-2细胞中;转染后HEp-2细胞增生活跃,S期明显延长,并能够稳定表达HPV16E7蛋白.结论:HPV16E7有促进HEp-2细胞的致瘤活性;真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7可为下一步建立动物模型和喉癌体外治疗实验提供研究工具.     

RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体,利用脂质粒转染SiHa细胞,用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达,其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。     

E1A抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖及其分子机制

目的：本研究将E1A基因转染HER-2表达阳性的乳腺癌细胞系MCF-7，并研究E1A对MCF-7细胞增殖的抑制作用及其分子机制。方法：利用基因转染技术检测MCF-7细胞中E1A的表达，RT-PCR和Western杂交检测E1A基因对HER-2mRNA和蛋白表达水平的调控，MTT法检测E1A对MCF-7细胞增殖的抑制作用，软琼脂集落法检测E1A对MCF-7细胞集落形成的影响，并利用流式细胞术检测E1A对MCF-7细胞凋亡的调控。结果：MCF-7细胞无内源性的E1A表达，E1A在MCF-7细胞内的表达显著性地降低了细胞中HER-2mRNA和蛋白表达水平，诱导MCF-7细胞发生凋亡。细胞增殖曲线显示E1A基因显著性抑制MCF-7细胞增殖和细胞集落形成能力。结论：E1A基因能降低人乳腺癌细胞MCF-7的HER-2表达，诱导细胞发生凋亡，从而抑制细胞的增殖和细胞集落形成能力。     

化学合成siRNA沉默宫颈癌SiHa细胞E6基因表达的进一步研究

目的 探讨靶向HPV16 E6基因特异性siRNA对SiHa细胞E6和E7基因表达的沉默效果,以及沉默作用对pRb、P53、Survivin和VEGF-C蛋白表达的影响.方法 化学合成靶向HPV16 E6基因的siRNA,脂质体法转染SiHa细胞.半定量RT-PCR检测siRNA对SiHa细胞E6和E7基因转录表达的影响;Western Blotting法检测pRb、P53、Survivin和VEGF-C蛋白的表达.结果 RT-PCR检测结果显示,转染siRNA后24、48和72 h组SiHa细胞E6和E7 mRNA表达水平均明显低于对照组(F=80.71、182.18,P<0.05).Western Blotting结果显示,与对照组相比,转染组pRb和P53蛋白表达明显升高(F=59.78、29.00,P<0.05),VEGF-C蛋白表达明显降低(F=7.58,P<0.05),Survivin蛋白的表达则没有发生明显变化(F=2.28,P>0.05).结论 HPV16 E6特异性siRNA能同时抑制SiHa细胞内E6和E7基因的表达,进而引起P53、pRb以及VEGF-C蛋白表达水平的改变.     

肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌的表达及其与HPV感染的关系

目的探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中的蛋白表达以及人乳头瘤病毒(HPV)16E6、E7和HPV18E6/E7感染对其表达的影响。方法采用免疫组化SP法检测70例浸润性宫颈癌、15例原位癌、20例正常宫颈组织中KAI1蛋白的表达,采用PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳法检测浸润性宫颈癌组织中HPV16E6、E7和HPV18E6/E7的DNA状况。结果宫颈浸润癌及原位癌组织中的KAI1蛋白表达与正常宫颈上皮中的表达相比明显下调(P<0.05),原位癌与浸润癌中的表达差异无统计学意义;HPV16E6、E7和HPV18E6/E7在浸润性宫颈癌中的阳性率分别为67.1%、54.3%和12.9%,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染与宫颈癌中的KAI1蛋白表达无相关性。结论肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中呈下调表达,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染不影响其表达。     

外源性HPV16 E7癌基因表达对宫颈癌HeLa细胞Cyclin E表达的影响

目的研究重组腺病毒介导人乳头状瘤病毒（HPV）16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期蛋白E（Cyclin E）表达的影响,探讨HPV16 E7癌基因以及Cyclin E在宫颈癌发生发展中的作用。方法用含有HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。免疫荧光染色后激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）检测感染前后Cyclin E表达的差异。结果HPV16 E7感染后Cyclin E表达较感染前明显增加。结论HPV16 E7基因的表达促进Cyclin E的表达,对宫颈肿瘤细胞有增殖促进的作用。     

人乳头瘤病毒16型E6/E7基因对人角质形成细胞增殖及其调控因子的影响

目的 研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）１６型Ｅ６／Ｅ７基因对人角质形成细胞增殖及细胞周期调控因子ｐ５３,ｐＲｂ的影响。方法 Ｌｏｐｏｆｅｔａｍｉｎｅ介导法进行 染,筛选阳性克隆,免疫荧光染色检测ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７在转染细胞内的表达,流式细胞仪分析细胞周期变化,免疫印迹分析ｐ５３,ｐＲｂ表达情况。结果 免疫荧光染色检测见转染细胞内有ＨＰＶＥ６／Ｅ７表达,汉式细胞仪显示转染细胞Ｇ１期细胞为４９．２％比正常     

重庆地区1例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6,E7基因的结构和变异

目的：报告1例重庆地区宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7基因的结构及其变异，方法：应用聚合酶链式反应（PCR）从宫颈癌组织扩增出人乳头瘤病毒16型重庆株E6，E7基因，分子克隆技术进行基因的克隆，测序。结果：成功地扩增出重庆地区宫颈癌人乳头瘤病毒16型株E6，E7基因，并克隆于质粒载体pBKS( )，结论：该例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7与标准株HPV16 E6，E7基因的长度相同，E6基因无变异，但E7基因有两处点突变。     

喉癌组织中HPV16及其早期区基因E6、E7蛋白的表达及意义

目的:观察喉癌组织中HPV16及其早期区基因E6、E7蛋白的表达,并初步分析其与喉癌组织临床分期、病理分级的相关性.方法:147例喉组织标本,其中喉鳞状细胞癌组织82例,非癌组织39例(声带息肉27例,距肿瘤＞1.0 cm的癌周正常组织12例),癌前病变(声带白斑)26例.免疫组织化学检测各组标本中HPV16及其早期区基因E6、E7蛋白的表达.分析喉鳞癌组织中3种蛋白表达情况与临床分期、病理分级的相关性.结果:喉鳞癌组织中HPV16蛋白及E6、E7蛋白的阳性率明显高于癌前病变组织(P＜0.05或0.01),后者高于非癌组织 (P＜0.05或0.01).非癌组织中HPV16蛋白阳性率明显高于E6、E7蛋白的表达(P＜0.05或0.01),而喉癌组织及癌前组织中三者间无显著差异.不同临床分期(Ⅰ～Ⅳ期)及不同病理分级(Ⅰ～Ⅲ级)喉癌组织中HPV16的阳性率间有显著差异(P＜0.05);而不同临床分期及病理分级间HPV16 E6、E7蛋白表达率无显著差异.结论:HPV16感染后其早期区基因E6、E7的表达可能是诱发喉癌的因素之一,应用免疫学方法抑制E7蛋白的表达对于喉癌的治疗有积极的意义,但其预防和治疗作用不应过分夸大.     

Increased expression of 70 kD heat shock protein in cultured primary human keratinocytes induced by human papillomavirus 16 E6/E7 gene

Background Heat shock protein 70 （HSP70） is expressed highly in epithelial tumours associated closely with human papillomavirus 16 （HPV16） infections. However, evidence about the direct relationship between HSP70 expression and HPVs infections are still lacking. In the present study, we examined the expression of HSP70 in keratinocytes introduced with HPV16 E6/E7 oncogenes. Methods Stable transfected cells were established by transfection of the plasmids pLXSN16E6/E7 into cultured primary keratinocytes and subsequently selected by plasmid specific selection antibiotic （G418） at the required concentration. The expression of HSP70 in pLXSN16E6/E7 transfected keratinocytes was determined by Western blot. The correlation of HSP70 expression and E6/E7 transfeetion was further confirmed by doubly labelled immunofluorescent staining. Results Compared to non-transfected keratinocytes, there was a significant trend for higher levels of HSP70 in pLXSN16E6/E7 transfected keratinocytes. Doubly labelled immunofluorescent staining experiment showed that the co-localization of HPV16 E6/E7 and HSP70 in transfeeted keratinoeytes was observed and increased expression of HSP70 was strongly associated with the transfection of HPV16 E6/E7. Conclusions Our studies demonstrated increased levels of HSP70 proteins in keratinocytes stably transfected by HPV16 E6/E7 oncogenes. It suggests that the expression of HSP70 is modulated by HPV16 E6/E7 proteins, which may be involved in HPV16 E6/E7 induced immortalization.     

人乳头瘤病毒16型E6/E7基因对人角质形成细胞生长及CyclinA,CyclinD1和cdk4的影响

目的 研究１６型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）Ｅ６／Ｅ７对人角质形成细胞细胞周期素（ＣｙｃｌｉｎＡ,ＣｙｃｌｉｎＤ１）及细胞周期素依赖（ｃｄｋ４）的影响。方法 用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导法将ＰＬＸＳＮ１６Ｅ６／Ｅ７质粒转染逆 转录病毒包装细胞ＰＡ３１７,挑选Ｇ４１８抗性克隆检测病毒滴度,将表达ＨＰＶ１６原高滴度逆转 录病毒感染人角质形成细胞;免疫印迹分析感染细胞ＣｙｃｌｉｎＡ,ＣｙｃｌｉｎＤ１,ｃｄ     

人喉鳞癌组织中HPV16E7、CyclinD1和Rb蛋白的表达

目的:探讨喉鳞癌组织中人乳头瘤病毒(HPV)16型E7、CyclinD1和Rb蛋白表达的变化.方法:采用免疫组织化学SABC法检测80例喉鳞癌、30例声带息肉组织中HPV16E7、CyclinD1和Rb蛋白的表达状况.结果:声带息肉组织中HPV16E7未见表达,喉鳞癌组织中的表达率为34/80(P＜0.000 1);声带息肉与喉鳞癌组织中Cy-clinD1的表达率分别为2/30和42/80(P＜0.000 1),Rb的表达率分别为25/30和42/80(P＜0.05).HPV16E7与CyclinD1的表达与临床分期、淋巴结转移情况和5 a生存率有关(P＜0.05或0.01).喉鳞癌组织中HPV16E7与Rb的表达相关(P＜0.01).结论:HPV16感染和Rb、CyclinD1的异常表达与喉鳞癌发生、发展有关.HPV16E7与CyclinD1可作为判定喉鳞癌预后的指标.