Bcl-2和Bax在多巴胺诱导PC12细胞凋亡中的作用

目的探讨多巴胺诱导PC12细胞凋亡的可能机制。方法流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡率及Bcl-2和Bax蛋白的表达率。结果多巴胺诱导PC12细胞凋亡,两者间呈明显的量效和时效关系。0.45mmol/L多巴胺作用24h,细胞的凋亡率为53.3%±3.1%。在凋亡过程中,Bcl-2蛋白表达显著降低,Bax蛋白表达随之增高。诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)抑制剂和半胱氨酸蛋白酶3(CPP32)抑制剂对抗多巴胺诱导PC12细胞的凋亡作用与Bcl-2蛋白增加、Bax蛋白降低有关。结论Bcl-2和Bax蛋白是多巴胺诱导PC12细胞凋亡的重要调节蛋白,iNOS和CPP32在凋亡过程中可能具有重要作用。     

阿霉素对大鼠心肌诱导型一氧化氮合酶mRNA表达的影响

目的研究阿霉素(ADM)对大鼠心肌诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的影响。方法将雄性wistar大鼠24只,随机分为ADM组和对照组,每组12只,ADM组按每次给ADM 2 mg/kg腹腔注射,隔日一次共6次;对照组给等体积的生理盐水腹腔注射。于实验第30 天,应用生化方法测定心肌组织中的一氧化氮(NO)水平及iNOS的活性;用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡指数;用RT—PCR方法检测心肌组织iNOS mRNA的表达。结果与对照组比较ADM组大鼠心肌组织NO、iNOS活性增加(P< 0.01),心肌细胞凋亡指数及iNOS mRNA的表达均显著增高(P< 0.01)。结论ADM能诱导大鼠心肌细胞iNOS mRNA表达增加,使NO合成增多,引起细胞凋亡而参与对心肌的损害。     

内毒素诱导大鼠胰岛细胞凋亡作用

目的：探讨内毒素（LPS）对大鼠胰岛细胞凋亡作用的机制。方法：观察腹腔注射2mg/kg LPS的大鼠血清胰腺NO含量动态变化,用原位杂交方法检测胰岛细胞诱生型一氧化氮合酶（iNOS)mRNA;采用单细胞凝胶电泳和DNA凝胶电泳技术,分析外源硝普钠（NO供体）和LPS离体条件下对胰岛细胞的损伤。结果：注射PLS 6h,大鼠血清NO水平明显升高并持续到3天,胰腺NO含量6h升高,12h达峰值,24h恢复至正常,胰岛细胞iNOS mRNA表达,6h开始升高,12h明显增强,体外试验显示。外源NO明显引起胰岛细胞NDA断裂,出现慧星尾和凋亡梯状带,并呈剂量依赖关系,高浓度NO（60mmol/L SNP)胰岛细胞DNA随机降解,LPS离体条件下,对胰岛细胞损伤作用不明显,结论：内毒素通过整本作用刺激炎症 细胞浸润胰岛并诱导iNOS表达,产生NO介导胰岛细胞凋亡和功能损害。     

内质网应激及其相关性凋亡在多巴胺能神经元选择性变性死亡中的作用

目的探讨内质网应激反应（endoplasmic retieulum stress response，ERS）及相关凋亡途径在多巴胺能神经元变性死亡中的作用。方法6羟基多巴胺（6-OHDA）、N-甲基-4苯基吡啶离子（MPP^＋）、鱼藤酮作用于神经生长因子（NGF）诱导的PC12细胞，MTT及流式细胞仪方法检测各种药物的神经毒性作用及细胞凋亡率，应用RT-PCR和Western印迹技术观察以上药物处理后ERS通路中XBP1、Grp78、CHOP表达水平的变化及相关凋亡因子caspase-12的活化和利血平耗竭胞内多巴胺水平后的影响。结果3种神经诱变剂处理PC12细胞后，细胞活力呈浓度依赖性下降，其中6-OHDA 100μmol／L、MPP^＋ 75μmol／L、鱼藤酮20nmol／L作用24h使细胞活力分别下降52％、44％、40％。流式细胞仪显示的细胞凋亡率在8h、16h、24h内逐渐增高（P〈0．01）。RT—PCR及免疫组化检测显示处理后XBP1、Grp78表达和CHOP的基因及蛋白表达水平明显增加，分别在8h、16～24h达到高峰（P〈0．01）。caspase-12 mRNA水平也在诱导后16h显著升高（P〈0．01），利血平预处理使其基因表达减弱（P〈0．05）。结论内质网应激和相关凋亡途径是多巴胺能神经元选择性变性死亡的内在环节之一。     

aFGF对Aβ25-5诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

目的探讨酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）对β淀粉样肽25-35（AB25-35）诱导凋亡PC12细胞凋亡的保护作用。方法采用MTT比色法分析细胞存括率，Hoechst 332582-PI荧光染色法检测细胞凋亡，RT-PCR方法检测PCI2细胞Bax和Bcl-2基因mRNA的表达，Western印迹检测PC12细胞Bax和Bcl-2蛋白表达。结果不同剂量（10、20、30mg／L）aFGF预处理PC12细胞1h可剂量依赖性对抗AB25-35引起的细胞凋亡，提高PC12细胞的存括率，减少Aβ25-35引起的PC12细胞核固缩、凝聚和碎裂，降低Bax基因mRNA表达及蛋白表达，增加bcl-2基因mRNA表达及蛋白表达。结论aFGF可剂量依赖性对抗Aβ25-35对PC12细胞的毒性作用，其机制可能与下调凋亡基因Bax和上调抗凋亡基因Bcl-2表达有关。     

N-乙酰半胱氨酸对阿霉素致心力衰竭兔心肌细胞凋亡的作用

目的:探讨慢性心力衰竭(HF)兔心肌核因子-κB(NF-κB)活化、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)与心肌细胞凋亡的关系以及N-乙酰半胱氨酸(NAC)对心肌细胞凋亡的作用。方法:设立对照组,剩余动物以阿霉素复制HF模型,随机分为HF组和NAC组,药物干预4周。观测3组心肌细胞凋亡指数、血清和心肌一氧化氮(NO)浓度、iNOS蛋白在心肌细胞中表达的水平,以及NF-κB p65的核表达和结合活性的改变,观察NAC对上述指标的影响。结果:与对照组比较,HF组心肌细胞凋亡指数增高,iNOS蛋白表达增多,NF-κB p65易位和核内表达增多,血清和心肌NO浓度升高(P<0.001),NF-κB p65活化与iNOS表达呈直线相关(r=0.973,P<0.001)。NAC组结果示NAC可显著减少NF-κB p65核内表达及iNOS蛋白的表达,降低血清和心肌NO水平,降低心肌细胞凋亡指数(P<0.01～0.001)。结论:HF时心肌细胞中NF-κB的活化及其促进iNOS的转录合成导致NO大量生成,参与了心肌凋亡的发生。NAC可显著拮抗NF-κB的大量活化核表达,减弱iNOS的表达上调,抑制NO的生成,减少心肌细胞凋亡。NF-κB的活化可能是iNOS表达的重要调控机制之一。     

黄芩素通过线粒体凋亡途径诱导体外培养喉癌细胞凋亡的机制

目的探索中药黄芩有效成分——黄芩素(BAI)通过线粒体凋亡途径诱导体外培养喉癌细胞凋亡的分子机制。方法体外培养的人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,暴露于浓度递增的BAI培养液中,分别培养24、48 h,流式细胞术(FCM)检测诱导细胞凋亡作用;分光光度法检测对半胱天冬酶(caspase)-3及caspase-9的激活作用;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测对Bcl-2、Bax mRNA表达的影响;Western印迹检测对酶原蛋白(procaspase)-9、caspase-9,procaspase-3、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果 BAI可诱导细胞凋亡,凋亡率增加;分光光度法表明BAI可以激活caspase-3、caspase-9活性;BAI可下调Bcl-2 mRNA表达,上调Bax mRNA表达;印迹BAI可上调Bax、caspase-9、caspase-3蛋白表达,下调Bcl-2、procaspase-9、procaspase-3蛋白表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论 BAI通过上调Bax在mRNA和蛋白水平的表达,下调Bcl-2在mRNA和蛋白水平的表达及Bcl-2/Bax比,促进Bax在线粒体外膜处聚集成簇,降低线粒体跨膜电位,促进细胞色素(Cyt)C释放到胞质,进而与激活的caspase-9及Apaf-1形成凋亡小体,从而激活caspase-3及后续线粒体凋亡途径,诱导喉癌Hep-2细胞凋亡。     

白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞氧化损伤的影响

目的 探讨白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞损伤干预的可能机制.方法 以甲醛损伤PC12细胞为氧化应激损伤模型,用不同浓度(6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)的白藜芦醇预处理PC12细胞2 h后,加入终浓度为80 μmol/L甲醛作用24 h.并设氨基胍100 μmol/L为阳性对照组.采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法检测细胞活力;分光光度法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量;硫代巴比妥酸法测定MDA含量;黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;二硫对二硝基苯甲酸(DTNB)比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(iNOS)活性;并收集各组细胞,检测细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(COⅡ)蛋白活性及mRNA的表达;Hoechst 33258荧光染色法和流式细胞技术检查细胞凋亡情况.结果 白藜芦醇能明显改善甲醛所致PC12细胞损伤,与甲醛处理组相比,细胞存活率随着白黎芦醇浓度的增加而加强,且100 μmol/L白藜芦醇组细胞存活率为(92.66±3.27)%,高于氨基胍阳性对照组[(82.18±2.06)%];在白黎芦醇6.25～100 μmol/L浓度范围内,SOD、GSH-Px活性、COⅡ蛋白及mRNA表达水平随着白藜芦醇浓度增加而逐渐升高;LDH漏出量、NO、MDA含量、iNOS活性随着处理浓度的增加而逐渐降低.结论 白藜芦醇对甲醛诱导PC12细胞损伤具有保护作用,在一定范围内呈剂量-效应关系;能有效改善甲醛所致PC12细胞的氧化损伤,提高细胞存活率;这种抗氧化活性可能与抑制甲醛/ROS、甲醛/NOS/NO氧化应激途径、减轻线粒体损伤有关.     

硝普钠对体外培养的海马神经元NF-κB和caspase-3基因表达的影响

目的探讨NO供体硝普钠（SNP）诱导体外培养的海马神经元凋亡与核因子-kappaB（NF）-κB p65和caspase-3表达变化的关系。方法终浓度分别为0、25、50、100、200、400μmol/L的SNP处理海马神经元24 h,用MTT比色法分析细胞存活率;Hoechst33258荧光染色观察凋亡的形态学改变;DNA琼脂糖凝胶分析凋亡的生化特征;用RT-PCR检测NF-κB p65、caspase-3 mRNA表达变化;Western印迹检测NF-κB p65、caspase-3蛋白表达的变化。结果SNP可剂量依赖性的降低神经元的存活率;荧光显微镜可见染为高亮蓝色的典型凋亡小体,其细胞核明显固缩、凝聚和断裂;电泳图谱显示清晰的DNA梯度。随着SNP剂量的增加,NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达逐渐增加;caspase-3 mRNA表达无改变,但caspase-3酶原被裂解活化;从50μmol/LSNP起,caspase-3相对酶活性显著增加,为对照组的3.02倍,100μmol/L达最大值。结论SNP可诱导培养的海马神经元凋亡,其凋亡机制可能与增加NF-κB p65表达及激活caspase-3酶原有关。     

曲古霉素A对食管癌细胞系EC9706细胞凋亡的作用及机制

目的探讨曲古霉素A（TSA）对食管癌细胞系EC9706细胞凋亡的影响及机制。方法用AnnexinV-FITC和PI进行双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测TSA对食管癌细胞凋亡相关基因表达的影响。结果 1.0μmol/L的TSA诱导EC9706细胞凋亡率增加（P〈0.05）,且呈浓度依赖性;0.5μmol/L的TSA作用48 h后细胞凋亡率增加（P〈0.05）,呈时间依赖性。TSA处理的EC9706细胞Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少;TSA诱导EC9706细胞caspase-8及caspase-9裂解活化,且随作用时间延长逐步升高。结论一定量的TSA可以诱导EC9706细胞凋亡,凋亡原因与Bax表达增强、Bcl-2减少以及凋亡细胞中caspase-8及caspase-9介导的caspase-3活化有关。     

Involvement of nitric oxide in farnesyltransferase inhibitor-mediated apoptosis in chronic myeloid leukemia cells

The mechanism of action of farnesyltransferase inhibitors (FTIs) has not been fully clarified. We investigated the cytotoxic effects of various FTIs in chronic myeloid leukemia (CML), using LAMA cells and marrow cells from 40 CML patients in chronic phase. FTI-mediated cytotoxic effect was observed in LAMA cells and in 65% of primary CML cells, whereas marrow cells from controls were only weakly affected. Cytotoxic effects were partially related to enhanced apoptosis; however, Fas-receptor (FasR) and Fas-ligand (FasL) expression were not modified by FTIs. Susceptibility to FTI-mediated inhibition did not correlate with FasR/FasL expression in CD34+ CML cells. Moreover, intra-cellular activation of caspase-1 and -8 were not altered by FTIs, and their blockade did not reverse FTI toxicity. However, we observed FTI-induced activation of caspase-3, and its inhibition partially reverted FTI-induced apoptosis. FTIs did not modulate bcl2, bclxL, and bclxS expression, whereas they increased inducible nitric oxide (iNOS) mRNA and protein levels, resulting in higher NO production. Furthermore, C3 exoenzyme, a Rho inhibitor, significantly increased iNOS expression in CML cells, suggesting that FTIs may up-regulate NO formation at least partially through FTI-mediated inhibition of Rho. We conclude that FTIs induce selective apoptosis in CML cells via activation of iNOS and caspase-3.     

Proapoptotic nitric oxide production in amyloid beta protein-treated cerebral microvascular endothelial cells

OBJECTIVE: The objective of this study was to investigate the effects of amyloid beta protein (Abeta) on cerebral microvascular endothelium, and their possible involvement in Abeta-induced apoptosis in the neighboring cells. METHODS: Cultured bovine brain microvascular endothelial cells (BBECs) were incubated with Abeta for 24 h. Production of nitric oxide (NO) was assessed by nitric oxide-sensitive fluorescent dye, DAF-2, and the expression of NO synthase (NOS) proteins was examined by Western blotting. Effects of Abeta-treated microvascular endothelium on the DNA damage of the neighboring cells were assessed by single-cell gel electrophoresis. RESULTS: Abeta increased the expression of iNOS protein, but did not affect eNOS and nNOS expressions in BBECs. Abeta-treated BBECs showed spontaneous NO production in the presence of L-arginine. The neural cell line PC12 showed marked apoptosis after being co-cultured with Abeta-treated BBECs for 48 h, and the apoptosis was as potent as that induced by the inflammatory stimuli lipopolysaccharide and interferon-gamma. The DNA damage of PC12 cells evoked by co-culture with Abeta-treated BBECs was prevented by L-NG-nitroarginine methyl ester, an inhibitor of NOS. CONCLUSIONS: These results indicate that Abeta induces the expression of iNOS in BBECs, and that microvascular endothelium-derived NO may induce apoptosis in neighboring neural cells.     

Regulation of inducible nitric oxide synthase expression in bovine ovarian granulosa cells

Nitric oxide (NO) is a potential regulator of ovarian follicle growth, and ovarian granulosa cells reportedly generate NO in response to gonadotrophins, suggesting that the regulated form of nitric oxide synthase (iNOS) is present. The objectives of the present study were to gain insight into the expression and role of iNOS in the follicle. Messenger RNA encoding iNOS was detected in granulosa cells, and abundance was higher in growing dominant follicles compared to subordinate follicles (P<0.01). FSH (P<0.05) and IGF1 (P<0.01) stimulated oestradiol secretion and iNOS mRNA abundance in granulosa cells in vitro, whereas FGF2 (P<0.05) and EGF (P<0.01) decreased oestradiol secretion and iNOS expression. The addition of an anti-oestrogen prevented FSH-induced iNOS mRNA accumulation. Inhibition of endogenous NO production did not affect steroidogenesis in granulosa cells, but increased FasL mRNA abundance, caspase-3 activation and the incidence of apoptotic cell death (P<0.05). These results demonstrate that iNOS is expressed in ruminant granulosa cells and is regulated by gonadotrophins and oestradiol. Physiological levels of NO may contribute to the survival of granulosa cells.     

复方丹参注射液对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

目的　探讨复方丹参注射液 (ISM)对 H2 O2 诱导的 PC1 2细胞凋亡的保护作用机制。方法　在 H2 O2 诱导 PC1 2细胞凋亡模型的基础上 ,采用 MTT比色分析测定细胞存活率 ,Hoechst- PI荧光染色和流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况 ,RT- PCR检测 par- 4和 caspase- 3基因 m RNA表达 ,Western blot检测 par- 4蛋白表达和 caspase- 3P2 0活性片段 ,比色法检测 caspase- 3相对活性。结果　不同剂量 ISM预处理 1 h可提高 PC1 2细胞存活率 ,降低 par- 4和 caspase- 3的 m RNA表达以及 Par- 4的蛋白表达 ,caspase- 3 P2 0活性片段和 caspase- 3相对活性减少 ,但变化不明显。结论　 ISM可剂量依赖性地对抗 H2 O2的神经毒性作用 ,其机制可能与凋亡基因 par- 4表达有关 ,与 caspase- 3的关系尚需进一步探讨。