双氢睾酮和氟他胺干预前列腺癌细胞LNCaP线粒体内还原型谷胱甘肽的变化

目的 观察双氢睾酮(DHT)和氟他胺(FLU)作用于雄激素依赖性(LNCaP)前列腺癌细胞LNCaP线粒体自由基的变化,探讨DHT和FLU引起LNCaP细胞线粒体内还原型谷胱甘肽(GSH)变化的作用机制.方法 获得LNCaP细胞株,进行细胞培养,获得稳定生长及传代的细胞株.不同浓度的雄激素受体激动剂DHT及雄激素受体拮抗剂FLU作用于培养的LNCaP细胞株;不同时间点提取干预措施下的LNCaP细胞线粒体;通过检测并比较不同时间点、不同浓度药物作用下LNCaP细胞株线粒体自由基的变化和差异.结果 DHT作用于LNCaP细胞后,线粒体GSH的含量显著下降(P<0.05),各个指标在不同的时间点上下降的程度有所差异.FLU干预LNCaP后,中剂量组干预14 d与对照组比其GSH含量增加(P<0.05).其余各组GSH的含量差异无统计学意义(P>0.05).结论 DHT可明显降低LNCaP线粒体内GSH含量,说明可促进细胞的增殖活力;FLU不能清除LNCaP细胞线粒体GSH,导致自由基蓄积,可有效抑制LNCaP细胞的增殖.     

嵌合分子靶向降解前列腺癌LNCaP细胞表达的雄激素受体

目的 观察嵌合分子双氢睾酮-蛋白靶向降解嵌合分子(DHT-PROTAC)通过泛素蛋白酶体途径易化降解前列腺癌LNCaP细胞表达的雄激素受体以及雄激素受体降解后该细胞增殖和活力的变化.方法 细胞爬片免疫组织化学和Western blot技术检测DHT-PROTAC处理后LN-CaP细胞中雄激素受体蛋白的改变.DHT-PROTAC分别处理前列腺癌LNCaP细胞、PC-3细胞、肾癌786-O细胞,嚷唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力,细胞计数并绘制生长曲线观察细胞增殖能力.结果 随着DHT-PROTAC浓度升高,LNCaP细胞表达雄激素受体减少,并呈剂量依赖性,Westernblot检测结果 表现为信号减弱,细胞免疫组织化学见阳性细胞明显减少,随着处理浓度升高,细胞阳性率分别为93.22%、85.65%、61.94%、1.71%.DHT、ALAPYIP-(Arg)8肽段能拮抗DHT-PRO-TAC作用,蛋白酶体抑制剂抑制雄激素受体降解;噻唑蓝(MTT)细胞活力试验及细胞计数显示LNCaP细胞活力和增殖受抑制.结论 嵌合分子DHT-PROTAC能易化降解LNCaP细胞表达的雄激素受体,并抑制该细胞的生长和增殖.     

熊果酸对前列腺癌细胞雄激素非依赖性的逆转作用

目的 探讨中药成分熊果酸对雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)的治疗作用及其机制.方法 应用熊果酸处理体外培养的人雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)细胞株LNCaP和AIPC细胞株DU145,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性及对人工合成雄激素R1881的反应性,免疫细胞化学检测熊果酸对雄激素受体(AR)、糖皮质激素受体(GR)、前列腺特异性抗原(PSA)及成活因子HSP90和白细胞介素(IL)-6表达的影响,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)检测熊果酸对DU145细胞AR mRNA表达的影响.结果 熊果酸对不同浓度雄激素下的LNCaP细胞均呈浓度和时间依赖性生长抑制,20 mg/L的熊果酸作用96 h对LNCaP细胞的抑制率近50%.0.1 nmoL/L的R1881为最适生长浓度,熊果酸作用后,LNCaP细胞生长的最适雄激素浓度上升了10倍;熊果酸对DU145细胞的生长有浓度和时间依赖性抑制效应,DU145细胞对AR阻断剂羟氟他胺缺乏反应,熊果酸作用同时再应用氟他胺比单纯熊果酸的作用更明显,对细胞抑制率明显上升.熊果酸作用后,LNCaP和DUl45细胞IL-6、HSF90表达均明显下降(P＜0.05),DU145细胞GR表达明显降低(P＜0.01),AR和PSA蛋白及AR mRNA出现再表达.结论 熊果酸能改善前列腺癌细胞对雄激素的反应性,使LNCaP细胞对雄激素的依赖性加强,并诱发了DU145细胞对雄激素的反应性,其部分机制是降低了GR、HSP90、IL-6的表达并促进AR再表达.     

前列腺雄激素调节基因:一个新的雄激素非依赖性前列腺癌治疗的潜在靶点(英文)

目的:初步研究前列腺雄激素调节基因(PAR)与雄激素—雄激素受体信号转导通路的关系及其在前列腺癌细胞恶性转化过程中的作用,探讨通过抑制 PAR 基因治疗雄激素非依赖性前列腺癌的可能性。方法:用 RT-PCR 检测 LNCaP、PC3细胞中 PAR 基因 mRNA 表达水平的差异。分别用 RT-PCR 检测双氢睾酮对LNCaP、PC3及稳定转染了 pcDNA3-AR 的 PC3细胞株 PC3-AR 的 PAR 基因 mRNA 表达的调节作用,并观察这一调节作用是否可被雄激素受体拮抗剂氟他胺阻断。进一步用 RNA 干扰技术下调 PC3细胞 PAR 的表达,用细胞计数、软琼脂克隆形成实验、流式细胞术研究 PAR 基囚表达下调对 PC3细胞生长的抑制作用。结果:PC3细胞 PAR 基因 mRNA 的表达是 LNCaP 细胞的3倍;双氢睾酮可调节 LNCaP 和 PC3-AR 细胞株PAR 基因 mRNA 表达水平,此种对 PAR 表达的调节作用可被氟他胺阻断:双氢睾酮对 PC3细胞 PAR 基因mRNA 表达无明显影响。RNA 干扰可抑制 PC3细胞 PAR 基因表达,使细胞增殖受抑制,细胞周期阻滞于G_2-M 期,凋亡增加。结论:PAR 可能是雄激素—雄激素受体信号转导通路下游的与雄激素非依赖性前列腺癌恶性表型密切相关的癌基因,有望成为其基冈和药物治疗的靶点。     

不同p21活化激酶-6活性对前列腺癌细胞增殖的影响

目的 探讨雄激素受体关联蛋白p21活化激酶石（PAK6）激酶活性表达对前列腺癌细胞体外生长的影响。方法 根据PAK6基因序列构建野生型、激酶激活型和失活型表达载体，通过Lipofectamine转染前列腺癌细胞LNCaP，经．G418筛选稳定表达株，以PAK6磷酸化抗体行免疫印迹测定各细胞激酶的表达。观察细胞形态变化，MTT法测定各细胞株的增殖状况，对比各细胞株对雄激素刺激的不同效应。结果 成功建立了稳定表达野生型、激活和失活型PAK6激酶的LNCaP细胞株。野生型与激酶激活型PAK6可导致前列腺癌细胞棱角增多，与对照组比较增殖速度分别下降32．1％和39．3％（P值均〈0．01）。激酶失活型PAK6转染的LNCaP细胞由多突起形变为圆形，并呈簇状生长，增殖速度较对照组细胞加快110．7％（P〈0．01）。与对照组细胞比较，野生型、激活型和失活型转染细胞对双氢睾酮的生长反应出现不同程度的下降，增殖速度分别下降40．7％、51．9％、30．6％（P值均〈0．01）。结论 过度表达并维系PAK6激酶活性可抑制LNCaP细胞生长，丧失PAK6激酶活性可导致LNCaP细胞增殖加快，PAK6激酶活性可影响雄激素对LNCaP细胞的生长调控。     

睾酮对前列腺癌LNCaP细胞雄激素反应性基因表达的影响

目的检测睾酮作用下雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP中雄激素反应性基因（ARGs)的表达情况。方法检测不同浓度的睾酮对雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP增殖的影响，采用基因芯片确定LNCaP细胞中受睾酮调控的基因。结果低浓度的睾酮促进LNCaP细胞的生长，并呈剂量依赖性，相反较高浓度的睾酮能够抑制LNCaP的增殖。在96个与前列腺癌有关的基因中，受睾酮刺激有19个基因表达上调，8个基因表达下调。结论睾酮诱导的雄激素反应性基因在前列腺癌的发展中起非常重要的作用，基因芯片有助于高通量分析基因表达水平的变化，为前列腺癌的研究提供了非常理想的工具。     

雄激素对前列腺癌细胞PAR基因表达的影响及其机制

目的观察在前列腺癌特异性高表达的癌基因前列腺雄激素调节基因（PAR）对雄激素的反应及其机制，探讨通过抑制PAR基因治疗雄激素非依赖性前列腺癌的可能性。方法用细胞计数检测双氢睾酮对LNCaP、PC3细胞增殖的刺激效应，以逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分别检测双氢睾酮对LNCaP、PC3细胞PAR基因mRNA表达水平的影响及双氢睾酮和其拮抗剂联合作用对LNCaP细胞PAR基因mRNA表达水平的影响。结果低浓度（0．001～1nmol／L）双氢睾酮刺激可促进LNCaP细胞增殖，且刺激效应随双氢睾酮浓度升高而增强，在0．1nmol／L浓度时达最大，细胞计数为（27、54±0．71）×10。爪／孔，为对照组（16．13±1．03）×10。爪／孔的（170．74±0．78）％；同时使PAR基因mRNA表达水平上调在0．1nmol／L浓度时最高，为对照组的（272．42±8．24）％，P〈0．05）；高浓度（10、100nmol／L）双氢睾酮则抑制其增殖和PAR基因表达，在10nmol／L和100nmol／L浓度，细胞计数分别为（12．02±0．41）×10。／孔、（11．13±1．92）×10^4／孔（P〈0．05）；PAR基因mRNA表达水平分别为对照组的（76．64±2．47）％和（52．97±1．07）％，（P〈0．05）。这一调节效应可以为氟他胺所阻断。双氢睾酮对PC3细胞生长及PAR基因mRNA表达无明显影响（P〉0．05）。结论PAR可能是雄激素．雄激素受体通路下游的前列腺癌特异性癌基因，有望成为雄激素非依赖性前列腺癌基因和药物治疗的潜在靶点。     

双氢睾酮对LNCaP细胞系Smad3和Smad4转录及表达的影响

目的:探讨双氢睾酮(DHT)对前列腺癌细胞系LNCaP中转化生长因子β(TGFβ)信号通路的下游信号蛋白Smad3、Smad4的基因转录及表达是否有影响,氟他胺对这些影响有无拮抗作用。方法:用含不同浓度DHT(2、10、50nmol/L)和氟他胺(100nmol/L)的RPMI1640培养液培养LNCaP细胞株。RTPCR检测LNCaP细胞中Smad3、Smad4mRNA水平,Western印迹法检测Smad3、Smad4蛋白表达情况。结果:与不含DHT和氟他胺的对照组比较,10、50nmol/LDHT明显增强LNCaP细胞中Smad3mRNA的表达(P<0.05),不同浓度的DHT均使Smad3蛋白的表达增高(P<0.05),氟他胺明显抑制DHT的这种增强作用(P<0.05);10nmol/L浓度的DHT对Smad4mRNA的转录有明显的抑制作用(P<0.05),这种抑制作用受氟他胺的抑制,不同浓度的DHT均可以使Smad4蛋白的表达下降,而且下降程度要比Smad4mRNA下降更为明显(P<0.05),氟他胺能够减轻这种抑制作用。结论:DHT能够增强Smad3mRNA的转录和表达,而对Smad4mRNA的转录和表达有抑制作用,氟他胺可以不同程度地抑制DHT的这些作用。雄激素受体(AR)信号通路和TGFβ信号通路可能在Smads水平上存在交联。     

雄激素受体在人前列腺癌LNCaP细胞和DU145细胞中的表达

目的 探讨雄激素受体(AR)在前列腺癌激素依赖特性转变过程中的可能作用.方法 分别应用Western Blot和RT-PCR法检测人前列腺癌LNCaP和DU145细胞株的AR蛋白表达差异和转录活性差异状况,并初步分析其在前列腺癌雄激素依赖特性转化过程中所发挥的作用.结果 与雄激素依赖的低转移性细胞株LNCaP细胞相比,AR在雄激素非依赖的高转移性细胞株DU145细胞株中的蛋白表达和转录活性下调.结论 结合我们前期研究,可能存在多重机制引起前列腺癌激素依赖特性改变.     

前列腺癌与良性前列腺增生细胞株差异核基质蛋白的鉴定

目的:鉴定人前列腺癌雄激素依赖性细胞株LNCaP、前列腺癌雄激素非依赖性细胞株PC-3与良性前列腺增生细胞株BPH-1之间差异表达的核基质蛋白(nuclear matrix proteins,NMPs)。方法:常规制备各细胞株NMPs,应用双向凝胶电泳对其进行分离;对差异表达的蛋白质点行MALDI-TOF-MS/MS质谱分析,数据库搜索并鉴定。结果:成功获得了分辨率高、重复性好的不同细胞株NMPs双向凝胶电泳图谱;初步鉴定出包含酶、调节蛋白、RNA结合蛋白及各种因子在内的12个差异表达的蛋白质,在癌细胞株中3个NMPs表达上调,9个下调。结论:人前列腺癌细胞与良性前列腺增生细胞之间NMPs表达存在明显差异;初步筛选出12个差异NMPs,其表达水平及功能与疾病的联系需进一步研究。     

苦参碱对雄激素依赖性前列腺癌细胞的影响

目的：探讨苦参碱（Matrine）对雄激素依赖性前列腺癌细胞株（LNCaP）凋亡及前列腺特异抗原（prostate specific antigen,PSA）表达的影响。方法：分别用0.5g／L、1.0g／L、1.5g／L、2.0g／L浓度的苦参碱作用于LNCaP细胞12h、24h、36h后MTT法检测细胞生长活性;24h后流式细胞仪测定细胞凋亡的变化;24h后Western印迹法检测细胞内Bel-2和Bax的表达;12h、24h、36h后化学发光法检测LNCaP细胞培养液中PSA的变化。结果：苦参碱能抑制LNCaP细胞的生长,呈剂量与时间依赖性,不同浓度苦参碱组之间与不同作用时间组之间的差异均有统计学意义（P〈0.05）。苦参碱诱导LNCaP细胞凋亡,各浓度组凋亡细胞比例均显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）;LNCaP细胞内Bcl-2含量呈浓度依赖性下降,Bax含量呈浓度依赖性升高（P〈0.01）;LNCaP细胞培养液中PSA的表达显著下降（P均〈0.05）。结论：苦参碱能显著抑制LNCaP细胞的体外生长,诱导其凋亡,并抑制PSA的表达。     

地高辛对前列腺癌LNCaP和PC3细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨地高辛对雄激素依赖和去势抵抗性前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制.方法 设立地高辛的浓度和时间梯度,分别作用于正常前列腺细胞株、雄激素依赖性及去势抵抗性前列腺癌细胞株LNCaP和PC3,流式细胞仪检测凋亡指数,MTT法检测细胞增殖速率;应用Western Blot技术检测HIF-1 α和VEGF的蛋白水平.结果 地高辛对LN-CaP和PC3细胞均有良好的抑制增殖及促进凋亡的作用(P＜0.05);Western Blot法检测提示地高辛干预组HIF-1α和VEGF的蛋白水平较未干预组明显降低(P＜0.05).结论 地高辛可抑制雄激素依赖及去势抵抗性前列腺癌细胞增殖并促进其凋亡,作用机制可能是通过抑制HIF-1 α/VEGF这一信号通路来发挥作用.     

Long-term exposure of tumor necrosis factor alpha causes hypersensitivity to androgen and anti-androgen withdrawal phenomenon in LNCaP prostate cancer cells

BACKGROUND: One of the mechanisms through which prostate cancers relapse during anti-androgen therapy may involve adaptation to low concentrations of androgen induced by anti-androgen therapies. Recent studies from our laboratory have reported that tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha) is secreted from prostate cancer epithelial cells and LNCaP cells. We hypothesized that TNFalpha changes androgen-sensitivity in LNCaP cells. METHODS: We cultured LNCaP cells for more than 3 months in the presence of 50 ng/ml TNFalpha and established TNFalpha-resistant LNCaP cells (LN-TR2). Sensitivity to androgen was examined by the cell proliferation assay. We also transfected LNCaP and LN-TR2 cells with a luciferase reporter plasmid driven by prostate-specific antigen (PSA) promoter and compared PSA promoter activity. Nuclear localization of AR protein that binds to target genes was also examined by Western blotting. RESULTS: LN-TR2 cells had increased sensitivity to dihydrotestosterone (DHT) (i.e., proliferation and PSA promoter activation) than LNCaP cells. Total AR mRNA and AR protein levels were decreased in LN-TR2 cells. However, LN-TR2 cells demonstrated increased levels of nuclear AR compared to LNCaP cells. At 1 nM DHT, the anti-androgen bicalutamide stimulated LN-TR2 and inhibited LNCaP proliferation. CONCLUSIONS: Long-term exposure of TNFalpha causes hypersensitivity to DHT in LNCaP and this was associated with increased nuclear AR protein. Furthermore, hypersensitivity to androgen caused anti-androgen withdrawal phenomenon in the presence of DHT although bicalutamide itself did not stimulate LNCaP proliferation without androgen. This result may be one possible mechanism for the anti-androgen withdrawal phenomenon.     

Inhibition of orthotopic growth and metastasis of androgen-sensitive human prostate tumors in mice by bioactive soybean components

BACKGROUND: Systematic analysis of the influence of diet on the initiation and progression of prostate cancer is often difficult in human populations, for which dietary variables overlap a diversity of genetic backgrounds and social behaviors. Animal models that emulate human prostate cancer allow experimental analysis of the mechanisms of action of nutritional agents that show anti-prostate cancer activity. METHODS: We have used an orthotopic implant model to characterize the in vivo response of androgen-sensitive LNCaP prostate tumors to three well-characterized soy dietary supplements: isoflavone depleted soy protein, soy phytochemical concentrate (SPC), and genistin. RESULTS: In male SCID mice orthotopically implanted with the androgen-sensitive human prostate cell line LNCaP, dietary supplements of soy protein, genistin, and SPC reduced primary tumor weight by 42% (P = 0.07), 57% (P < 0.05) and 70% (P < 0.005), respectively. All three soy supplements significantly increased tumor apoptosis and decrease microvessel density, with no significant change in tumor proliferation. Each supplement produced a distinct serum androgen response, with genistin producing the greatest decrease in total serum testosterone and dihydrotestosterone (DHT) (P < 0.05) and the greatest increase in testosterone to DHT ratio (P < 0.05) and soy protein the greatest decrease in bioactive androgen (P < 0.05). Only SPC significantly inhibited metastases to lymph nodes and lungs, and only SPC produced a significant increase in tumor p53 expression. CONCLUSION: Taken together, these data suggest that the anti-prostate cancer activity of dietary soy protein, soy phytochemicals, and genistin use different molecular pathways. In addition, we have demonstrated that this animal model can be used in the design of dietary strategies for prostate cancer prevention and therapy.     

Two mutations identified in the androgen receptor of the new human prostate cancer cell line MDA PCa 2a

PURPOSE: We have characterized the androgen receptor (AR) in a new human prostate cancer cell line, MDA PCa 2a, that has recently been established from a bone metastasis of a patient whose cancer exhibited androgen-independent growth. MATERIALS AND METHODS: Androgen responsiveness of these cells was assessed by measuring the effect of DHT and R1881 on cell growth and PSA secretion. Scatchard analysis was used to characterize the affinity and abundance of AR protein. Using a PCR based strategy, genomic DNA of the entire coding region of AR gene was sequenced to identify possible mutations. RESULTS: These cells express abundant AR (Nmax = 685 +/- 149 fmol./mg. protein), but the AR binding affinity (Kd) for DHT is only 25 nM, approximately 50-fold lower affinity than the mutated AR in LNCaP prostate cancer cells (Kd = 0.5 nM) or the wildtype AR in MCF-7 breast cancer cells (Kd = 0.4 nM). Two mutations, L701H and T877A, were identified in the ligand binding domain of the AR gene. Compared with LNCaP cells, the new cell line is significantly less responsive to DHT and R1881 as well as to other androgens such as testosterone, androstenedione, and DHEA. Similar to LNCaP cells, the ligand specificity of the AR in MDA PCa 2a cells appears to be relaxed and non-androgens such as progesterone and estradiol act as agonists although with less potency than in LNCaP cells. Interestingly, in the absence of androgens, the new cell line expresses 15-fold higher baseline levels of PSA than LNCaP. CONCLUSIONS: Two mutations were identified in the AR gene of the MDA PCa 2a cell line that are likely responsible for the decreased androgen sensitivity and altered ligand specificity observed in these cells. Thus, this new cell line with partial androgen responsiveness and PSA expression can serve as a functionally relevant model system of bone metastatic prostate cancer, and can be used to investigate the role of AR mutations in prostate cancer and its progression to androgen independence.