实时定量PCR应用中的问题及优化方案

实时定量PCR是利用PCR反应过程中所产生的荧光强度进行实时检测的定量PCR反应。目前，该方法已在生命科学领域得到了广泛的应用，本文对其应用过程中存在的主要问题加以分析，探讨优化实验方法。     

实时荧光定量PCR在食品致病菌检测中的应用

目的研究实时荧光定量PCR在食品致病菌检测中的应用。方法对PCR在不同食品致病菌的检测效果进行比较,分析PCR在食品致病菌检测中的作用。结果实时荧光定量PCR技术在食品致病菌包括沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等多种致病菌都有着较为有效地检测结果。结论作为一种新兴的检测方法,PCR技术可以快速,准确地检测食品中的各种致病菌。为保障消费者的食品安全工作做出了很大的贡献。     

实时定量PCR检测外周血中的巨细胞病毒

目的建立定量检测外周血中巨细胞病毒的实时定量PCR方法,并对骨髓移植病人进行巨细胞感染监测。方法构建基于LightCycler-TaqMan探针的实时定量PCR方法,对其进行方法学评价,并抽提外周血DNA,检测正常人与骨髓移植病人巨细胞病毒感染状况。结果经反应条件的优化,该方法的敏感性在10个拷贝数以上,批内与批间差异分别控制在较小范围,对骨髓移植病人巨细胞病毒感染的监测发现病毒拷贝数与病程进展和恢复呈较好的相关关系。结论实时定量PCR方法检测巨细胞病毒感染可为临床对移植患者的感染提供一种有效的监测手段。     

荧光定量PCR在检测儿童肺炎支原体感染中的应用

目的探讨实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法检测肺炎支原体在临床儿童感染诊断中的价值。方法对425例表现为不明原因持续咳嗽、发热、咽炎、支气管肺炎等上呼吸道感染患儿,采用FQ-PCR方法检测其咽拭子中肺炎支原体核酸(MP-DNA)。结果检测出98例患儿咽拭子MP-DNA阳性,阳性率23.1%,其中男性42例,女性56例,年龄2岁26例,2岁～6岁56例,6岁16例。结论实时荧光定量PCR方法检测对儿童肺炎支原体感染的诊断具有准确、早期、快速、简便等优点。     

实时定量PCR在干细胞及肿瘤研究中的应用

实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,已广泛用于生物医学及临床医学等多个领域。而在干细胞研究和肿瘤诊断的研究中,国内外文献报道较少,本文就其中方法原理、研究进展及其在干细胞和肿瘤研究方面的应用作一简要综述。     

实时荧光定量PCR快速诊断肠道病毒71型感染

目的探寻快速准确早期诊断肠道病毒71型(human enterovirus 71,EV71)感染的方法。方法手足口病患儿871例,采用实时荧光定量PCR检测患儿咽拭子或疱液的EV71感染情况,实时荧光定量PCR检测EV71阳性患儿采用ELISA法检测血清EV71-IgM和EV71-IgG。结果871份标本中,RT-PCR检测EV71感染阳性率为17.91%,其中5月份检测阳性率(24.44%)最高,12月份检测阳性率(4.17%)最低;随机抽取64例RT-PCR检测阳性患儿外周血,EV71-IgM阳性率为51.56%,EV71-IgG阳性率为14.06%。结论 RT-PCR能快速准确诊断EV71早期感染。     

实时荧光定量PCR在人血液循环DNA检测中的应用

循环DNA主要存在于人血浆和血清等体液中，在多种人类疾病中含量升高，具有临床诊断意义和预后判断价值。本研究以人工重组质粒DNA为内参照物，建立双重实时荧光定量PCR检测方法，对健康人血浆和血清DNA含量进行定量测定。[第一段]     

荧光实时定量PCR检测端粒长度

目的 应用定量聚合酶链反应(PCR)方法测量端粒长度.方法 随机选取63例健康人外周血样本,采用定量PCR方法测量端粒长度相对T/S比率、DNA印迹法测定端粒限制性片段(TRF)长度并进行相关性分析.结果 定量PCR测量端粒长度相对T/S比率为0.76±0.27,DNA印迹法测量平均TRF值为9.20±1.12,两种方法测量的结果 相关性分析R2=0.575,P＜0.01.结果 采用定量PCR方法测量端粒长度具有重复性好、省时、简便、可靠,可高通量的处理大量样品的特点,端粒的长短同癌症的发生有密切联系.本方法值得推广应用于癌症的遗传学和分子流行病学研究.     

实时定量PCR应用中的问题及优化方案

实时定量PCR是利用PCR反应过程中所产生的荧光强度进行实时检测的定量PCR反应。目前 ,该方法已在生命科学领域得到了广泛的应用 ,本文对其应用过程中存在的主要问题加以分析 ,探讨优化实验方法。     

降钙素原定量检测在血流感染患者中的临床应用价值

选取非血流感染和血流感染患者各30例,对两组患者的血清PCT进行比较。结果非血流感染组与血流感染组患者血清PCT水平对比,差异显著(P<0.05),具有统计学意义。在血流感染中,血清PCT最具诊断价值,血清PCT诊断特异性、灵敏度、阴性以及阳性预测值分别为73.3%、96.7%、96.8%及80.6%。在血流感染患者的临床诊断中,降钙素原定量检测可作为有价值的诊断指标,值得临床应用与推广。     

血清降钙素原定量检测在儿科血流感染诊断中的应用价值

目的：探讨血清降钙素原（PCT）定量检测在儿科血流感染诊断中的价值。方法回顾性分析某院183例同时送检血液培养和 PCT 检测的结果,以血培养为金标准,把患者分为非血流感染组和血流感染组,比较两组间血清 PCT 浓度的差异。两组间 PCT 值差异比较采用 Mann-WhitneyU 检验,P ＜0．05为差异有统计学意义。结果非血流感染组血清 PCT 浓度为0．15（0．065～0．55）ng/mL,血流感染组血清 PCT 水平为1．11（0．505～8．975）ng/mL,两组间的血清 PCT 浓度差异有统计学意义（P ＝0．000）;以0．50 ng/mL 为界点,PCT 诊断的灵敏度为77．8％、特异度为73．3％,阳性预测值和阴性预测值分别为24．1％和96．8％。结论定量检测 PCT 可辅助快速排除或诊断血流感染,为避免抗菌药物的过度使用或早期抗感染治疗提供参考。     

血清降钙素原检测对血流感染的诊断价值分析

目的：探讨血清降钙素原（PC T ）检测对血流感染的诊断价值。方法回顾性分析2013年2～11月同时进行血培养和PC T检测的患者356例临床资料,以血培养检测结果将患者分为非血流感染组和血流感染组,比较两组间及革兰阴性菌感染组与革兰阳性菌感染组间血清PC T浓度的差异。结果非血流感染组、血流感染组血清PCT浓度分别为0．21（0．06～1．05）、4．36（0．78～15．60）ng/mL ,组间比较差异有统计学意义（P＜0．05）。革兰阴性菌与革兰阳性菌感染组血清PCT浓度分别为5．60（1．23～19．90）、2．04（0．59～9．05）ng/mL ,组间比较差异有统计学意义（ P＝0．041）。以0．50 ng/m L为临界值,PC T对血流感染的诊断灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为83．1％、64．1％、41．3％、92．6％。结论 PC T定量检测用于血流感染的快速辅助诊断,也有利于血流感染病原菌类型的初步判断,能够为早期抗感染治疗方案的制订提供依据。     

应用TaqMan实时荧光-聚合酶链反应方法快速检测粪便标本空肠弯曲菌的研究

目的建立空肠弯曲菌TaqMan实时荧光-PCR方法,用于粪便标本的直接检测。方法根据空肠弯曲菌特异性基因hipO和mapA分别设计引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上,对45例临床腹泻患者粪便标本提取DNA之后,荧光PCR检测,同时进行分离培养。 结果两组引物和探针能准确检测空肠弯曲菌菌株2株,检测限可达到10~20 cfu/ml,并与其他肠道致病菌无交叉反应。检测45份腹泻病例粪便标本,该方法检测到3份为阳性,同时进行的传统培养方法仅从该3份标本中的两份中分离到空肠弯曲菌。 结论本研究建立的TaqMan荧光PCR检测粪便标本中所携带的空肠弯曲菌灵敏度高,特异性好,能够提高粪便中空肠弯曲菌的阳性检出率和缩短检测时限。     

荧光定量PCR方法在空肠弯曲菌检测中的应用

空肠弯曲菌是引起人类食源性疾病的主要病原菌之一。快速、特异检测方法的建立对于该病原菌感染的诊断及鉴别诊断具有重要意义。荧光定量PCR方法作为一种快速诊断方法已经广泛应用于空肠弯曲菌的检测及鉴定。本文从荧光定量PCR方法在空肠弯曲菌病原检测中的建立、发展以及应用等方面进行综述。     

实时荧光PCR技术在手足口病检查中的应用

目的采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)法检测手足口病患儿病原体。方法收集433例疑似手足口病患儿的粪便标本进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型(EV-71)和柯萨奇病毒16型(CA-16)鉴别与分析。结果实时荧光PCR法检测433例患儿肛拭子标本使用通用型试剂盒检出366例阳性,其中66例为EV-71感染,151例为CA-16感染。结论 EV-71和CA-16肠道病毒是手足口病的主要病原体,该地区2011年以CA-16感染为主,实时荧光PCR技术对手足口病的病原诊断具有重要价值。     

Multiplex real-time PCR assay for detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus strains

Foodborne disease caused by pathogenic Vibrio parahaemolyticus has become a serious public health problem in many countries. Rapid diagnosis and the identification of pathogenic V. parahaemolyticus are very important in the context of public health. In this study, an EvaGreen-based multiplex real-time PCR assay was established for the detection of pathogenic V. parahaemolyticus. This assay targeted three genetic markers of V. parahaemolyticus (species-specific gene toxR and virulence genes tdh and trh). The assay could unambiguously identify pathogenic V. parahaemolyticus with a minimum detection limit of 1.4 pg genomic DNA per reaction (concentration giving a positive multiplex real-time PCR result in 95% of samples). The specificity of the assay was evaluated using 72 strains of V. parahaemolyticus and other bacteria. A validation of the assay with clinical samples confirmed its sensitivity and specificity. Our data suggest the newly established multiplex real-time PCR assay is practical, cost-effective, specific, sensitive and capable of high-throughput detection of pathogenic V. parahaemolyticus.     

2012～2014年血流感染的病原菌分布及耐药性分析

目的 了解该院血流感染的病原菌分布和药敏特点,为临床合理用药提供依据.方法 用BD Bactec FX-400、BactAlert 3D240全自动血培养仪对血标本进行培养检测,Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定系统对病原菌进行鉴定及药敏结果检测,WHONET5.6软件进行数据的统计及分析.结果 2012～2014年共收检血培养标本30 801份,共分离出病原菌4 161株,血培养阳性率为13.5％.其中革兰阳性菌2 010株(48.3％),革兰阴性菌1 916株46.0％,真菌202株(4.9％),厌氧菌33株(0.8％).分离率为前5位的病原菌分别是凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌.甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNSA)的检出率分别为39.4％和83.5％,未发现对万古霉素、替考拉宁耐药的革兰阳性菌.肠杆菌科主要细菌对亚胺培南耐药率最低,铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率为15.7％,而鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率高达36.1％,鲍曼不动杆菌对其他抗菌药物的耐药率均＞20％.结论 该院血流感染病原菌主要为凝固酶阴性葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌,临床应重视血培养病原菌的分布及其耐药性监测,合理选用抗菌药物.     

Rapid detection of bloodstream pathogens by real-time PCR in patients with sepsis

Rapid detection of bloodstream infections is an important issue for a better patient outcome. The aim of our study was thus to evaluate the LightCycler SeptiFast assay for diagnosis of bloodstream pathogens in a tertiary hospital in Western Austria. The 71 blood samples of 61 patients with presumed sepsis were investigated and compared with conventional blood culture system results. In both assays, 51 samples (71.8?%) were negative. In 20 positive samples (28.2?%), 10 different pathogens were detected by either blood culture system or SeptiFast assay or by both methods. Five samples were positive in both assays. The agreement rate of blood culture system and SeptiFast assay was 78.9?%, the negative predictive value of SeptiFast assay versus blood culture system was 0.94, sensitivity was 0.63, and specificity 0.81. In 12 samples where a positive SeptiFast assay and a negative blood culture system result were obtained, the same pathogens as identified by SeptiFast assay were detected in samples from other body sites suggesting a correct positive detection. In 11.3?% of cases, the SeptiFast assay resulted in an adjustment of the patients' therapy. In 3 samples, the blood culture assay was positive whereas the SeptiFast assay yielded negative results. In two of these cases, the pathogens involved were not included in the SeptiFast detection list, in the third case SeptiFast assay failed to detect Candida glabrata.Thus we recommend the SeptiFast assay as a valuable tool for rapid diagnosis of bloodstream infections in addition to, but not as replacement for, the blood culture test.     

血流细菌感染致脓毒症患者血清炎症因子与凝血指标的变化

目的探究血流细菌感染致脓毒症患者血清炎症因子与凝血指标的变化。方法选取63例血流细菌感染致脓毒症患者为研究对象,按照血培养结果分为革兰阳性菌血流感染组(G+菌血流感染组)22例和革兰阴性菌血流感染组(G-菌血流感染组)41例,并随机选取同期50例健康体检者作为对照组。比较各组降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)水平、D-二聚体(D-D)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)、抗凝血酶Ⅱ(ATⅡ)、血栓弹力指标最大振幅(MA)及凝血综合指数(CI)水平。结果G-菌血流感染组的血清炎症因子PCT水平、CRP水平明显高于G+菌血流感染组和对照组,G+菌血流感染组的血清炎症因子PCT水平、CRP水平明显高于对照组(LSD-t分别=3.47、6.92、5.86、7.02、7.24、7.97,P均<0.05)。G-菌血流感染组的D-D水平、PT、APTT、TT、MA明显高于G+菌血流感染组和对照组,而FIB、ATⅡ、CI明显低于G+菌血流感染组和对照组(LSD-t分别=6.94、5.68、3.74、2.75、6.32、2.96、3.06、4.02;9.26、8.95、7.92、7.95、7.95、6.25、8.74、8.46,P均<0.05);G+菌血流感染组的D-D水平、PT、APTT、TT、MA明显高于对照组,而FIB、ATⅡ、CI明显低于对照组(LSD-t分别=8.96、7.96、6.83、7.06、7.03、5.38、8.36、7.90,P均<0.05)。G+菌血流感染组和G-菌血流感染组中的重症脓毒症患者的PCT、CRP、D-D、PT、APTT、TT、MA水平均高于非重症患者,而FIB、ATⅡ、CI水平则低于非重症患者(t分别=2.18、2.63、8.17、4.93、12.02、7.68、5.02、2.17、4.63、3.97;4.01、9.18、9.00、6.19、13.50、10.78、4.63、3.90、6.19、4.62,P均<0.05)。结论血清炎症因子PCT、CRP以及凝血指标D-D、PT、APTT、TT、FIB、ATⅡ、MA、CI的水平与血流细菌感染致脓毒症患者病情严重程度相关。     

Simple multiplex real-time PCR for rapid detection of common 16S rRNA methyltransferase genes

We have developed a real-time multiplex PCR assay to detect the three most common 16S rRNA methyltransferase genes (armA, rmtB and rmtC), which encode problematic high-level resistance to all clinically-relevant aminoglycoside antibiotics. All results were consistent with published conventional PCR assays and these genes still appear rare in Australia.