HCV结构区重组质粒构建,蛋白表达及小鼠对重组质粒抗体 …

为进行ＨＣＶ－ＤＮＡ疫苗实验研究，通过分子克隆技术构建了ＨＣＶ－ＤＮＡ重组质粒（含有ＨＣＶ结构区基因片段１６９３ｂｐ，ＯｋａｍｏｔｏＩＩ型）将其转染到Ｈｅｌａ细胞中，蛋白抽提物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明，重组质粒能表达约１１０ＫＤ的融合蛋白，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实该融合蛋白为特异性的ＨＣＶ结构区蛋白。用核酸免疫方法，将构建的重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，经ＥＬＩＳＡ检测到免疫鼠能产生特异性抗体。     

DcR3基因克隆、重组质粒构建及表达鉴定分析

目的研究DcR3a基因克隆、重组质粒构建及表达鉴定。方法采用PCR技术克隆DcR3cDNA编码序列，构建真核表达载体，然后检测重组DeR3／pAAV—IRES—hrGFP质粒在真核细胞中的表达。结果DcR3蛋白的表达正确。我们进一步用激光共聚焦显微技术成功检测到重组DeR3／pAAV—IRES—hrGFP质粒在真核细胞中的表达，并证明质粒中GFP与DcR3在真核细胞中的表达具有一致性。结论可以将重组质粒转染的真核细胞中GFP的表达作为DcR3表达的标志。     

Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,mfn2)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pEGFPmfn2质粒载体。方法采用高效Trizol试剂快速提取大鼠血管平滑肌细胞株A7r5总RNA,经RT-PCR获得mfn2cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段并将质粒pEGFP-N1和mfn2基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收2.2 kb片段,再将回收的pEGFP-N1大片段与mfn2基因片段(2.2 kb)重组。对重组pEGFPmfn2质粒进行PCR和双酶切鉴定并测序。结果成功地从A7r5中克隆了mfn2基因,并构建了以pEGFP-N1为载体的真核表达质粒。结论含mfn2基因新型表达质粒构建的成功将为研究mfn2功能、进一步研究该基因异常表达与心血管疾病发生的关系奠定基础。     

毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统是一种优秀的重组蛋白表达系统,近年来被广泛应用于重组蛋白的表达。现就巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及其用于外源蛋白表达的基本策略作一综述。     

重组金属硫蛋白2A质粒的构建与表达

目的构建重组金属硫蛋白2A(MT-2A)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究MT-2A奠定基础。方法从人骨骼肌细胞cDNA文库中PCR扩增MT-2A基因DNA序列,构建重组表达质粒MT2A-pET32a,PCR与DNA测序法鉴定插入序列;重组细菌用IPTG诱导表达,His-bind亲和层析柱纯化MT-2A蛋白,Western blotting鉴定蛋白特性。结果扩增获得的MT-2A基因片段长186bp,DNA测序证实MT2A-pET32a重组质粒构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒MT2A-pET32a,在大肠埃希菌内诱导表达并纯化获得MT-2A。     

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。     

MeCP2特异性shRNA真核细胞表达质粒的构建与鉴定

目的构建MeCP2特异性SiRNA表达质粒pSilence-MeCP2.方法根据人MeCP2 mRNA序列设计作用靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,该序列中包含靶序列正义链、反义链,两者间的连接序列及与质粒相匹配的酶切位点序列,连接质粒后转化感受态细胞(E.Coli),使其在大肠杆菌内大量复制,提取质粒,PCR鉴定.结果合成的寡核苷酸序列与要求的序列完全相符,且以正确的方向插入.结论成功构建两个MeCP2特异性SiRNA表达质粒psilence-MeCP2/I和psilence-MeCP2/Ⅱ.     

MeCP2特异性shRNA真核细胞表达质粒的构建与鉴定

目的构建MeCP2特异性SiRNA表达质粒pSilence-MeCP2。方法根据人MeCP2mRNA序列设计作用靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,该序列中包含靶序列正义链、反义链,两者间的连接序列及与质粒相匹配的酶切位点序列,连接质粒后转化感受态细胞(E.Coli),使其在大肠杆菌内大量复制,提取质粒,PCR鉴定。结果合成的寡核苷酸序列与要求的序列完全相符,且以正确的方向插入。结论成功构建两个MeCP2特异性SiRNA表达质粒psilence-MeCP2/Ⅰ和psilence-MeCP2/Ⅱ。     

PET32a-IL-1RⅠ重组质粒的构建及表达

目的 构建含有编码白细胞介素1 Ⅰ型受体(IL-1R I)胞外区蛋白基因的PET32a-IL-1RⅠ重组质粒,利用原核表达体系表达 IL-1RⅠ的胞外区蛋白.方法 从人白细胞中提取总RNA,采用聚合酶链反应(PCR)从总RNA中扩增出IL-1RⅠ胞外段基因,并将其插入PET32a质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌D...     

肺癌组织中细胞周期蛋白依赖激酶、细胞周期蛋白D2和P16表达及其意义

目的　探讨细胞周期蛋白依赖激酶 (CDK4)、细胞周期蛋白D2 (CyclinD2 )和P16在人类肺癌组织中的表达及意义。方法　采用免疫组化SP法检测 6 9例肺癌组织中CDK4、CyclinD2 和P16的表达并行统计学分析。结果　 6 9例肺癌组织中CDK4、CyclinD2 和P16的阳性率分别为 4 9.3% ,39.1%和 5 0 .7% ,与正常支气管粘膜比较有显著性差异 (P <0 .0 1)。CDK4、P16的表达与肺癌淋巴结转移有关 (P <0 .0 1,P <0 .0 5 )。P16的表达与CDK4、CyclinD2 的表达呈显著负相关 (P <0 .0 1)。结论　CyclinD2 高表达与肺癌的发生有关 ,CDK4和P16的异常表达与肺癌的侵袭和转移有关 ,可作为判断肺癌淋巴结转移和估计预后的重要指标。     

心脏转录因子Nkx2．5真核表达质粒的构建

目的构建人类心脏特殊转录因子Nkx2．5的真核表达质粒,为进一步探讨Nkx2．5在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法以质粒pCMV6-XL5-Nkx25为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2．5编码区序列,将真核表达载体pCMV-HA和Nkx25的PCR产物分别在双酶切后用,T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-HA-Nkx2．5,转化至大肠杆菌,提取质粒后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果成功设计引物扩增出Nkx2．5基因编码区约1000bp的目的片段。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2．5基因序列。结论成功构建了含有Nkx2．5的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。     

重组人源甲胎蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化

目的：从毕赤酵母GS115蛋白表达体系入手,实现人源甲胎蛋白（AFP）的重组克隆、异源高效表达、蛋白纯化并得到具有临床免疫原性的高纯度AFP。方法通过聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pReceiver‐AFP扩增到目的基因片段,构建酵母重组表达质pPICZαA‐AFP,经测序比对与GenBank公开的AFP序列一致。将重组质粒pPICZαA‐AFP转入毕赤酵母GS115,通过甲醇诱导表达目的蛋白AFP。收集蛋白后用硫酸铵分级沉淀法对AFP进行纯化,高效液相色谱法（HPLC）检测纯度,在临床医院通过电化学发光法对其蛋白含量定值。结果研究发现AFP在酵母GS115中经甲醇诱导表达主要分泌到胞外培养基上清,免疫印迹试验能够检测到AFP蛋白条带,经硫酸铵分级沉淀,87％AFP目的蛋白存在于55％硫酸铵沉淀集份,HPLC检测其纯度为98．844％,电化学发光法检测其水平为3473ng／mL。最后与临床肝癌患者血清标本比对,蛋白的相对分子质量大小一致,表明其糖基化水平与临床标本相当。结论通过毕赤酵母甲醇诱导表达系统可以制备高纯度的、具有生物活性的、可用于肿瘤临床检测的AFP标准物质及其可以溯源的校准品、质控品和相关诊断试剂。     

SV2A基因真核表达质粒构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建鼠突触囊泡蛋白2A(SV2A)基因的真核表达质粒,并瞬时转染至人胚肾细胞(HEK293T)中,对其表达进行鉴定。方法以APP/PS1双转基因小鼠海马组织的cDNA为模板,扩增得到长2239 bp的SV2A基因编码序列,将此序列插入到真核表达载体p3×Flag-CMV-10多克隆位点区域中,得到真核表达质粒p3×Flag-CMV-10-SV2A,转化后挑取单克隆菌落经双酶切鉴定后送公司测序,将构建成功的重组质粒转染至HEK293T细胞中,利用蛋白质印迹法(Western blot)检测SV2A基因的表达情况。结果成功构建p3×Flag-CMV-10-SV2A重组质粒,并在转染至HEK293T细胞后,验证了相应蛋白表达。结论利用分子克隆技术成功构建了p3×Flag-CMV-10-SV2A真核表达质粒并在HEK293T细胞中正确表达,为后续实验奠定了基础。     

变形链球菌thrS基因生物信息学分析及同源重组质粒的构建

背景:变形链球菌是公认的主要致龋菌,细菌的黏附、生物膜形成、产酸、耐酸等各个表型都与细菌的致龋性相关.有研究结果提示,苏氨酰-tRNA合成酶基因(threonyl-tRNA synthetase,thrS)可能与变形链球菌的黏附、产酸、耐酸等致龋性表型相关.目的:对苏氨酰tRNA合成酶基因进行保守性分析,构建用于变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因敲除的重组质粒.方法:首先通过生物信息学结合Southern Blot对苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性进行分析,再将变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因上下游序列分别克隆至自杀质粒pFW5上的多克隆位点,构建用于基因敲除的重组质粒.观察苏氨酰-tRNA合成酶基因的保守性及重组质粒的构建结果.结果与结论:苏氨酰-tRNA合成酶基因在实验中所列6种变形链球菌中保守存在:经过聚合酶链反应和酶切分析,重组质粒所插入片断无误.表明重组质粒pFW5-thrS构建成功.重组质粒pFW5-thrS的构建可用于今后变形链球菌苏氨酰-tRNA合成酶基因功能的研究.     

细胞周期蛋白依赖性激酶2及相关蛋白研究进展

在所有真核细胞中,细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase,CDK）调控着细胞周期各个环节的起始与进程,进而控制细胞的增生和凋亡。CDK2在20世纪90年代初鉴定并命名,是目前已发现的11个CDK成员中研究极为深入的细胞周期调控因子之一,在决定细胞周期进程中起着重要作用。     

HCV基因组5‘端非编码区部分cDNA重组质粒的构建及应用

应用分子克隆技术将丙型肝炎病毒ＲＮＡ５＇端非编码区的部分ｃＤＮＡ片段连接至质粒载体上，构建成重组质粒，用作ＰＣＲ法检测血清ＨＣＶ－ＲＮＡ时的阳性对照。     

ZWINT和CDK2在乳腺癌中的表达及与临床病理特征的关系和诊断价值

目的 探讨ZW10结合因子（ZWINT）和细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)的相关性及其在乳腺癌病理诊断中的价值。方法 通过GEPIA数据库分析ZWINT在乳腺癌和正常乳腺组织之间的表达差异,以及在乳腺癌中ZWINT和CDK2表达的相关性。通过Kaplan-Meier Plotter数据库预测ZWINT的表达与乳腺癌患者预后的关系。收集84例乳腺癌及其配对癌旁组织石蜡包埋病理标本和20例乳腺癌及其配对的癌旁组织新鲜标本,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和免疫组织化学检测乳腺癌和癌旁正常乳腺组织中ZWINT和CDK2的mRNA及蛋白的表达,分析ZWINT和CDK2与乳腺癌临床病理特征的关系,并采用关联分析分析ZWINT和CDK2的相关性;采用受试者操作特征（ROC）曲线评估ZWINT和CDK2在乳腺癌病理诊断中的价值。结果 数据库分析结果显示,ZWINT在乳腺癌组织中高表达,在乳腺癌中ZWINT和CDK2的表达呈正相关（rs=0.600,P <0.001）,ZWINT的表达与乳腺癌患者的预后相关（P均<0.05）。84例病例检测结果显示,在乳腺癌组织中ZWINT和CD...     

传染性非典型肺炎疫苗的研制：重组真核质粒PVAX1／SARS-CoV M的构建及免疫原性研究

目的：构建真核表达质粒PVAX1／M，免疫Balb／c小鼠，测定其诱导的特异性免疫应答，探讨传染性非典型肺炎(severe acute resperatory syndrome，SARS)防治和康复的可能手段。方法：根据GenBank中登录的SARS-CoV M蛋白基因序列设计引物，采用反转录聚合酶链反应方法从感染SARS病毒的VeroE6细胞中扩增得到约666 bp的片段，构建重组真核表达质粒PVAX1／M。体外转染COS-7细胞，细胞免疫化学方法鉴定目的蛋白的表达后，肌肉注射免疫Balb／c小鼠(雌性，6周龄)，加强免疫3次后，测定其诱导免疫应答的能力。结果：构建的重组质粒经酶切及测序鉴定，与GenBank中登录的序列完全一致；细胞免疫化学方法均显示重组质粒可在COS．7细胞中表达有免疫原性的SAILS-CoV M蛋白；免疫小鼠血清中检测到较高滴度的抗体，并能诱导特异性的CTL反应。结论：成功构建真核表达质粒PVAX1／SARS-CoV M，并能诱导小鼠产生特异性的免疫应答，为SARS的预防康复提供了可能的治疗手段。     

携带DREAM基因小分子干扰RNA重组质粒的构建

背景：DREAM是一种多功能蛋白,在细胞中不同位置与不同靶蛋白结合,体外细胞培养和动物实验均证明DREAM参与了许多疾病的发病机制。目的：构建携带DREAM基因的小分子干扰RNA重组质粒。方法：设计并合成shRNA对应的两条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP—U6质粒经BamH I 和 HindIII双酶切与退火后的寡核苷酸连接,转化感受态coliDH5a,获得阳性克隆进行PCR和测序鉴定。结果与结论：经PCR、酶切及测序证实,重组质粒pDC316-EGFP．DREAM-shRNA-U6片段大小为473bp,其中插入的片断序列和位点与预期完全一致,说明pDC316．EGFPDREAM．shRNA-U6重组质粒构建成功。     

Cyclin B1 and p21cipl在急性白血病中的表达及其相关性研究

细胞周期蛋白（cyclin）B1作为调节细胞进行有丝分裂的正性调节因子,在细胞增殖中起到重要作用.本研究旨在评价cyclin B1在急性白血病（AL）发生、发展中的作用及其对AL患者预后判断的价值.采用流式细胞术对136例初治AL成人患者、10例持续完全缓解（CCR）患者及17例正常人进行cyclin B1、p21^cipl蛋白表达水平检测和细胞周期分布分析;采用RT-PCR测定Cyclin B1、p21^cipl和增殖细胞核抗原（PCNA）mRNA水平.结果显示：136例初治AL患者cyclin B1蛋白表达水平明显高于正常对照组;复发AL患者的cyclin B1表达水平明显高于正常对照组,但低于初治AL患者;缓解AL患者及CCR的AL患者cyclin B1蛋白表达水平与正常对照比较均无显著性差异;所有cyclin B1高表达的AL患者出现非顺序表达（cyclin B1在G1期出现,有些甚至G2期高表达）,cyclin B1与p21^cipl的蛋白表达呈负相关;cyclin B1蛋白表达与其mRNA水平呈正相关;cyclin B1表达与PCNA及细胞增殖指数（PI）表达水平呈正相关;cyclin B1表达水平高的AL患者有较高的缓解率和生存率,但有较高的复发率.结论：本研究首次发现cyclin B1在成人AL患者有过度表达和异常分布,认为cyclin B1与AL发生、发展有关,是影响AL患者预后的因素之一.