组织工程血管种子细胞的培养

目的：为构建组织工程血管提供种子细胞。方法：全麻下取兔的主动脉，分别采用酶消化法和组织块贴壁法培养血管内皮细胞和平滑肌细胞，并传代，免疫组化鉴定及倒置显微镜下形态学观察。结果：成功地培养出血管内皮细胞和平滑肌细胞并传代，倒置显微镜下血管内皮细胞呈“鹅卵石”形态，平滑肌细胞呈典型的“峰—谷”状。免疫组化鉴定内皮细胞Ⅷ因子（ ），平滑肌细胞α—肌动蛋白( )。结论：所培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞为研究组织工程血管提供了细胞来源。     

组织工程研究中关于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞和平滑肌细胞是执行血管生理功能的必要物质基础.因此,获取足够量的、健康有活力的种子细胞是血管组织工程研究将要解决的关键技术问题.组织块法培养的血管平滑肌细胞获得率高、增殖快、合成表型的细胞比例大,应选择组织块法分离培养的平滑肌细胸作为血管组织工程种子细胞来源.     

血管组织工程实验研究

目的获得血管组织工程的实验依据。方法获取大鼠血管内皮（VEC）和平滑肌细胞（VSMCs）,进行培养扩增,然后接种到血管组织工程支架上;将VSMCs-血管支架移植到大鼠体内,观察移植后大鼠活体和组织病理反应。结果培养的细胞符合血管种子细胞的形态特征;VSMCs接种到血管组织工程支架上获得成功;VSMCs-血管支架移植到大鼠体内10d后,支架被纤维组织包裹,支架内见VSMCs生长,支架中央管腔存在,但与正常血管结构有很大差别,而且不具备血管功能。结论利用血管组织工程支架构建的大鼠VSMCs-血管支架移植到大鼠皮下是可行的;人工构建血管具有类似血管雏形,但尚不具备血管的正常结构。     

组织工程研究中关于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞和平滑肌细胞是执行血管生理功能的必要物质基础。因此,获取足够量的、健康有活力的种子细胞是血管组织工程研究将要解决的关键技术问题。组织块法培养的血管平滑肌细胞获得率高、增殖快、合成表型的细胞比例大,应选择组织块法分离培养的平滑肌细胞作为血管组织工程种子细胞来源。     

血管组织工程中单根主动脉培养的内皮细胞和平滑肌细胞形态学和生长增殖

目的：探索体外培养及扩增同一来源内皮细胞和平滑肌细胞的有效方法，为研究内皮细胞和平滑肌细胞相互关系和体外构建组织工程血管提供理论和实践基础。方法：在体外用酶消化法和组织块贴壁法分别建立内皮细胞和平滑肌细胞的原代，并应用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠传代培养。应用光镜、透身电镜和细胞计数对内皮细胞和平滑肌细胞的形态和增殖进行研究。结果：酶消化法和植块培养法可以有效的建立起内皮细胞和平滑肌细胞的原代。讨论：内皮细胞和平滑肌细胞作为血管构成的基本细胞，对于它们的形态学、体外培养和扩增以及相互关系的研究具有重要的意义。     

血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良

背景:如何获取高质量的种子细胞是构建组织工程血管的先决问题。目的:改良血管组织工程种子细胞原代培养技术并观察其生物学特性。设计、时间及地点:以细胞为培养对象,观察性实验,于2006-12/2008-03在江西省分子医学重点实验室完成。材料:新西兰家兔,体质量2kg左右,用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的原代培养。方法:以胶原酶胰酶序贯消化法获得血管内皮细胞、快捷贴壁法培养血管平滑肌细胞。主要观察指标:免疫细胞化学法对两者进行鉴定;流式细胞术检测第2代和第6代血管内皮细胞的增殖指数。结果:培养的种子细胞符合各自特征,免疫细胞化学鉴定其为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。内皮细胞第2代和第6代细胞增殖指数分别为(20.87±2.05)%和(9.75±1.76)%。结论:胶原酶胰酶序贯消化法和快捷贴壁法可以较稳定地获取血管内皮细胞及血管平滑肌细胞;第2代的内皮细胞较第6代更适用于构建组织工程血管。     

组织工程血管支架材料的评价

目的:评价组织工程修复颅骨缺损各种生物材料的性能和应用,寻找合理的颅骨替代物.方法:以组织工程,组织工程血管,干细胞,细胞因子,支架材料为中文关键词;以tissue engineering,tissue engineering blood vessel,intravascular stent为英文关键词,采用计算机检索1993-01/2009-10相关文章.纳入与生物材料及组织工程血管相关的文章;排除重复研究或Meta分析类文章.以30篇文献为主重点讨论组织工程血管材料的种类及其性能.结果:血管脱细胞基质可作为一种较理想的支架材料应用于血管组织工程.基于纤维蛋白制成的支架不但具有理想的生物相容性、生物降解性和较高的亲和性,而且能促进血管生成、组织修复.明胶无抗原性,生物相容性好,可完全生物降解,可实现支架自身的血管化.天然生物材料和合成高分子材料都存在一定不足,将两者按照一定的方法组合构建成一种复合基质,发挥两者各自的优势构建出性能良好的组织工程化血管.纳米修饰技术有望被应用于下一代组织工程化血管移植.结论:到目前为止,还没有发现一种很理想的血管支架材料.虽然现在天然生物材料成为研究的热点,但是物理机械性能并不能很好地符合支架要求,这就迫切需要新材料的出现,来更好的满足组织化血管支架的要求,达到修复和重建的目的.     

MTT法评价镧原位改性HMS材料的细胞毒性

背景:国内外对La-HMS制备工艺的探讨比较多,但缺乏对La-HMS生物安全性评价的研究.目的:制备La-HMS六方介孔材料,并对其进行生物学评价.方法:以长链伯胺为模板剂,在中性条件下合成出具有六方结构的介孔二氧化硅分子筛,以介孔二氧化硅为载体,将镧元素嵌入分子筛骨架,得到La-HMS.将La-HMS粉末与一定量的黏合剂混合并压片,并经高温高压消毒备用.分离培养鼠骨髓间质干细胞,倒置荧光显微镜下观察培养过程中细胞的形态及增殖情况,MTT检测La-HMS细颗粒对小鼠骨髓间质干细胞相对增殖率的影响,评价其细胞毒性.结果与结论:培养1 d后,细胞可在La-HMS周围贴壁生长,此后每天细胞生长情况良好,一直保持正常的形态.3 d和5 d后各培养孔中都未发现脱落的死亡细胞,细胞仍保持原来的形状且数量逐渐增加,且形态良好.MTT检测结果显示,实验制备的La-HMS没有毒性.提示实验用的材料为六方介孔材料,材料的介孔结构利于细胞的黏附,材料符合生物材料细胞毒性要求,具有良好的生物相容性和细胞黏附性,可应用于生物医药方面.     

组织工程血管构建中支架材料的特征

组织工程血管的构建是组织工程的重要内容,它是将种子细胞在体外种植于生物可吸收材料的血管支架上,形成多层细胞层,随着支架的吸收,可建立自体血管.组织工程血管应具有高度生物相容性、可塑性、异物反应小、无致血栓生成、无感染等特点,并且随着组织的长大,最终可成为完全意义上的自体血管.文章比较了几种人造血管材料,支架的加工技术,种子细胞和血管培养的内容,便于探寻一种更好制备人造血管的方法.     

纤维矿物粉尘体外细胞毒性及防治的实验研究

目的：评价工业上常用纤维矿物粉尘表面游离OH^-的毒性并用有机弱酸对其进行减毒处理，探讨其损伤机制。方法：以细胞死亡率、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase LDH)、超氧化物歧化酶(supemxide dismutase SOD)、丙二醛(malondialdehyde MDA)为毒性指标，观察纤维矿物粉尘对肺泡巨噬细胞的毒性，并用低浓度的有机弱酸处理各粉尘，观察对人红细胞(RBC)的溶血率及MDA的变化。结果：不含OH^-的斜发沸石、纤维硅灰石未表现出细胞毒性，纤维坡缕石及纤维水镁石因含不同的OH^-而表现出不同的细胞毒性。用低浓度的有机弱酸处理纤维坡缕石及纤维水镁石后能显著降低其对RBC的毒性。结论：纤维矿物粉尘的细胞毒性与其表面OH^-呈正相关；有机弱酸有减少其毒性的作用。     

动态反应器构建组织工程化血管的初步实验研究

目的 以自行设计的旋转细胞培养器和动态反应器比较静态和动态培养条件下细胞增殖的差异,以期为体外构建组织工程化血管提供依据.方法 将兔骨髓间充质干细胞种植在氧等离子体辐照10 min聚氨酯膜制成的管状支架上进行细胞培养,比较静态和动态种植、静态和动态培养细胞增殖率的差异.结果 自制的旋转培养器、动态反应器工作状态稳定;培养第7,14,28天动态培养组光密度值均高于静态培养组(P＜0.01);培养28 d甲苯胺蓝染色及扫描电子显微镜观察显示,动态培养组细胞增殖数较静态培养组多、生长更致密,且有顺培养液流动方向排列的趋势.结论 动态细胞的种植与培养优于静态.自制的旋转培养器、动态反应器可用于初步的动态培养实验,但仍有待改进.     

组织工程技术构建血管壁的实验研究

目的:构建组织的方法和环境是组织工程研究所涉及的另一重要环节,对于能否最终形成新生组织以及新生组织质量的好坏起着关键作用。探讨运用组织工程技术构建血管中膜组织的方法。方法:将体外培养、扩增的犬平滑肌细胞接种于片状聚羟基乙酸(PGA)材料上,形成细胞-材料复合物,将该复合物包绕于硅胶管使成管状结构后移植于裸鼠皮下,第2,6,11周后行大体及组织学检测。结果:裸鼠皮下形成的组织工程化血管中膜组织学结构在不同的时间点具有不同的特征。结论:运用组织工程技术可形成具有与天然血管中膜组织学结构相似的血管。     

Development and evaluation of axially aligned nanofibres for blood vessel tissue engineering

Biodegradable polymers have been extensively used as scaffolds to regenerate lost tissues. The geometry of the three‐dimensional (3D) scaffolds has an influence on the cellular behaviour. In this study, we have developed 3D‐scaffolds of axially aligned nanofibres of poly(lactic acid) (PLA), poly(caprolactone) (PCL) and PLA:CL (50:50) with diameters in the range 100–400 nm, internal diameter 4 mm, length 4 cm and wall thickness 0.2 mm, by using a dynamic collector. PCL and PLA:CL nanofibres were significantly less hydrophobic than PLA nanofibres. The porosity of PCL (16.23 ± 9.88%) and PLA:CL nanofibres (14.77 ± 3.41%) were comparable, while PLA (6.57 ± 1.54%) nanofibres had lower porosity. The tensile strength and Young's modulus of PLA was significantly lower than PCL and PLA:CL nanofibres and the suture retention strengths of all three scaffolds were comparable. After 4 weeks, the molecular weight of PLA nanofibres was reduced by 53% compared to 44% and 41% for PCL and the PLA:CL nanofibres, respectively. However, the PLA:CL nanofibres maintained their structural integrity even after 28 days. Platelet adhesion studies showed that PCL nanofibres had least tendency to be thrombogenic, while PLA:CL blend nanofibres were highly thrombogenic. Further, in vitro responses such as cell adhesion, proliferation and gene expression of human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs) were evaluated. After 6 days of culture, the surfaces of all the three scaffolds were completely covered with cells. Our results demonstrate that expression levels of elastin, angiopoietin, laminin‐4α and ‐5α were upregulated in PCL and PLA:CL nanofibres without the addition of any exogenous factors. Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.     

丝素蛋白作为组织工程材料应用于角膜的研究进展

背景：丝素蛋白纤维材料具有透明性、结构可塑性、成分单一性、力学强韧性及生物相容性等特点。目的：综述国内外丝素蛋白应用于角膜组织工程的研究进展。方法：由第一作者在标题和摘要中以“silkfibroin,corneal,ocular”或“丝素,角膜”为枪索词,榆索1980至2011年PubMed及1990至2011年CNKI数据库中关于丝素蛋白角膜的文章。结果与结论：从天然蚕丝中提取的高分子丝素蛋白,因其良好的生物相容性、独特的力学性能、光学透明性及降解速率可控性,既可以单独应用于角膜组织结构的重建,又可与其他组织材料联合应用,成为角膜组织工程学心用的理想材料。现已证明多种角膜细胞可在丝素纤维膜上良好生长,但体外培养的细胞应用f动物模型的相关研究较少;此外丝素蛋白材料植入角膜内对其产生何种影响的研究数据较缺乏,这些均是亟待解决的问题。     

血管组织工程的研究与进展

背景:血管组织工程是指利用血管壁的正常细胞和生物可降解材料来制备、重建和再生血管替代材料的科学。近年来,组织工程学技术的发展推动了组织工程化血管的研究,已成为今后血管替代物的重要方向。目的:综述血管组织工程的相关临床及基础研究进展。方法:检索SCI数据库2001/2010有关血管组织工程的文献,检索词为"组织工程血管(tissue-engineered vascular);组织工程(tissue engineering);血管(vascular);支架材料(scaffold materials);支架(scaffolds);种子细胞(seed cell);细胞外基质(extracellular matrix,ECM);血管支架(vascular scaffold);高分子材料(polymer materials);复合材料(composite materials);纳米(nanometer);生物材料(biological materials)",对血管组织工程的临床及基础文献进行分析。结果与结论:血管组织工程研究的内容主要有种子细胞、细胞外基质替代物以及组织工程血管三维培养。血管组织工程所应用的种子细胞包括自体血管壁细胞、胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞,还包括内皮细胞,平滑肌细胞及成纤维细胞等众多组织细胞。在组织工程血管构建中血管组织微环境是活细胞在体外生长所需的支持物,是种子细胞生长增殖的三维空间,便于细胞黏着、生长、进行新陈代谢。因此,组织工程血管需要具有良好的生物相容性,可塑性强,来源广泛,有一定的抗张强度和无免疫原性的支架材料。根据来源和性能,目前研究应用的材料分为天然生物生材料和合成材料两种。     

组织工程化血管构架及构建环境相关研究与进展

目的:介绍组织工程血管的支架材料设计、种子细胞的选择及体外动态培养系统的应用现状及进展。资料来源:应用计算机检索PUBMED 1996/2007与组织工程化血管相关的文章,检索词“tissue engineering,vascular,scaffold,seed cell,bioreactor”,限定文献语种为“English”;同时检索万方数据库2000/2007相关文章,检索词“组织工程,血管,支架材料,种子细胞,生物反应器”,限定文献语种为中文。资料选择:共检索到相关文献200余条,选择与组织工程血管构建、组织工程血管支架材料及其生物相容性研究、种子细胞选择相关的文章,无论观察对象为人或动物、无论是否有对照组均纳入,排除综述和重复文献。资料提炼:根据以上标准共纳入30篇进行综述。其中12篇陈述了血管构架材料,12篇介绍种子细胞选择,8篇论述了构建环境对组织工程血管的影响。资料综合:①根据血管构架的来源和性能,可分为天然生物生材料和人工合成材料,因为2种材料均有其缺陷,目前已有研究将天然材料的重要氨基酸序列接在合成聚合物的表面,形成复合生物材料以克服两种材料各自的缺陷。②选取种子细胞的一种途径是从组织活检中直接捕获成熟的血管壁细胞,来源包括自体的非必须大血管壁细胞及微血管壁细胞;另一种途径就是通过构建具有自我更新、多向繁殖分化能力的干细胞工程来获得相应的种子细胞。③组织工程血管的培养环境应尽可能模仿生物体内血管生发的环境条件。结论:到目前为止,组织工程血管的研究主体仍处于实验阶段,现有的临床应用仅仅是少量的尝试性探索。只有从应力与生长关系出发,摸索出能够成功诱导分化成血管壁细胞的干细胞系,在体外完全模拟出新生血管的相同环境,并解决体内移植的组织相容性等问题,才能形成可生长性、可塑形性和高度顺应性的组织工程血管。     

骨组织工程支架材料：脱矿骨基质

背景：脱矿骨基质是目前研究较多的具备骨诱导及骨引导的生物支架材料之一。 目的：总结脱矿骨基质作为骨组织工程支架材料的研究进展,并展望其发展趋势。 方法：由第一作者检索1965年1月至2013年5月PubMed数据库、中国生物医学数据库、万方数据库及FMJS数据库有关脱矿骨基质及其作为骨组织工程支架材料的相关文献。英文检索词为＂Demineralized Bone Matrix,Scaffold material, Groowth factor, Cells,drugs＂,中文检索词为＂脱矿骨基质,支架材料,生长因子,细胞,药物＂,根据纳入标准排除重复性研究,保留34篇密切相关文献进行归纳总结。 结果与结论：骨组织工程支架材料是组成组织工程骨的主体,而脱矿骨基质既具备骨诱导性又具备骨引导性,可为骨组织细胞的修复提供空间,又可与生物活性因子、活细胞、抗生素等在体外构建成复合体,植入骨内促进骨缺损的愈合。但这一技术也面临着脱矿骨基质与各种物质的配比、消毒、保存成骨活性及抗原性的消除等问题,充分了解脱矿骨基质作为骨组织工程支架的研究,可为其服务于临床提供理论依据。     

可降解组织工程心肌材料聚氨酯的体外评价

背景:体外构建组织工程化心肌是当今医学领域的研究热点,支架材料的选择和设计是心肌组织工程的关键环节,但目前仍未找到理想的心肌支架材料.目的:对新型可降解材料聚氨酯进行体外评价,初步探讨其作为心肌组织工程支架的可行性.方法:以赖氨酸基二异氰酸酯为硬段,以赖氨酸为扩展链合成新型聚氨酯(PU-Lys).在拉力机上测试材料的缝合强度和拉伸强度;在37℃,pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中检测聚氨酯的降解性能;采用细胞培养MTT法、细胞形态学观察方法,分析该聚氨酯的细胞毒性.结果与结论:力学性能检测得出该聚氨酯的拉伸强度为(8.1±0.1)MPa,缝合强度为(12.2±0.8)N;体外降解8周后质量损失为(13.1±0.3)%;MTT比色法结果显示细胞毒性为0～1级;细胞形态学观察显示L929细胞在聚氨酯材料浸提液中呈梭形或三角形,贴壁良好.提示此种新型解聚氨酯具有良好的力学性能和降解性,细胞相容性良好,符合组织工程心肌支架材料的应用要求.     

组织工程心脏瓣膜构建研究:去细胞牛心包支架的制备

目的对比去污剂-酶消化法、胰蛋白酶消化法和去氧胆酸钠法去除新鲜牛心包组织上细胞的效果和保护基质的能力,为组织工程心脏瓣膜的构建提供较满意的支架材料。方法应用3种方法处理新鲜牛心包组织,用光学显微镜、扫描电镜观察脱细胞效果和胶原纤维、弹力纤维改变;热皱缩实验、拉力测试观察基质的物理性能变化;DNA抽提比较脱细胞前后细胞数量差异。结果3种方法均能完全去除细胞,但是与去污剂-酶消化法比较,其它两种方法对基质破坏明显。结论去污剂-酶消化法脱细胞效果好,且有良好的保护基质的能力。     

聚羟基丁酸己酸酯/聚碳酸亚丙酯共混材料作为血管组织工程支架的性能特征

目的：为改善生物材料聚羟基丁酸己酸酯（PHBHHx）的力学性能和聚碳酸亚丙酯（PPC）的可加工性,将两者共混,制备不同比例的共混材料,并对共混膜上血管平滑肌细胞的黏附和共混材料制成的管形支架的力学性能进行评价,以选出合适比例的共混材料作为血管组织工程支架。 方法：实验于2006-08/2007-04在清华大学生物科学与技术系生物膜与膜生物工程国家重点实验室完成。①制备5种不同比例（PHBHHx∶PPC分别为0∶10,3∶7,5∶5,7∶3,10∶0）的共混材料,利用CCK-8试剂测定兔主动脉平滑肌细胞在共混膜上培养24h后的黏附数量。②采用热致相分离和冷冻干燥法制备管形支架,通过反复浸渍和晾干,在多孔支架外层形成一层晾干的膜层。利用扫描电镜观察支架形貌、压汞仪测量孔隙率和孔径分布,利用自制装置以6.65kPa/s的加压速度测定管形支架的破裂强度,万能材料试验机测定支架的缝合强度,以羊颈动脉为对照。 结果：①兔主动脉平滑肌细胞在各种膜上培养24h后,在5∶5比例PHBHHXx/PPC共混膜和PPC膜上相对黏附量高于PHBHHXx膜（P〈0.05）。②PHBHHx和共混材料均可制备成管形支架,而单纯PPC支架在制备晾干层时溶化,无法维持原形。管形支架的孔径随PPC含量的增加而增大,孔隙率提高。③支架的破裂强度与羊颈动脉相似（P〉0.05）;缝合强度均强于羊颈动脉,以5∶5和3∶7PHBHHx/PPC共混材料制备的管形支架的缝合强度高于PHBHHx支架。 结论：①与PHBHHx相比,5∶5PHBHHx/PPC共混膜和PPC膜上兔主动脉平滑肌细胞的黏附更好。②共混材料均可以制备成管形支架,并且力学强度符合移植的要求,缝合强度以5∶5和3∶7的PHBHHx/PPC共混材料最佳。