糖基化终产物对大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子作用的研究

目的：探讨糖基化终产物（AGEs）对大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF) mRNA表达及细胞外基质（ECM）合成的影响。方法： 在培养的大鼠肾系膜细胞中，分别加入不同浓度的糖化牛血清白蛋白(AGE-BSA)及牛血清白蛋白(BSA)进行刺激，ELISA法检测培养上清中的纤连蛋白（FN）及Ⅳ型胶原（ColⅣ）含量，RT-PCR检测细胞CTGF mRNA表达。结果： 与加入BSA组比较，AGE-BSA组CTGF mRNA表达明显增强（P<0.01），上清中FN及ColⅣ合成增加（P<0.01）， 与CTGF mRNA表达量之间呈正相关（r=0.83）。 结论： AGEs能明显诱导大鼠肾系膜细胞CTGF mRNA的表达，提示AGEs可能通过上调CTGF mRNA的表达引起ECM积聚。     

糖基化终产物诱导心肌细胞炎症反应的研究

目的： 探讨糖基化终产物(AGEs)对乳鼠正常心肌细胞和胰岛素抵抗心肌细胞炎症反应的影响。方法: 原代培养乳鼠心肌细胞并建立胰岛素抵抗心肌细胞模型，用不同浓度葡萄糖孵育的糖化白蛋白（AGE-BSA）干预24 h，采用RT-PCR、免疫细胞化学染色和透射电镜法，观察AGE-BSA对细胞TNF-α mRNA和PPAR-γ mRNA表达、NF-κB活化以及细胞超微结构的影响。结果: AGE-BSA可诱导心肌细胞TNF-α mRNA表达和NF-κB活化,并可抑制PPAR-γ mRNA表达，与对照组及BSA组比较有显著差异（P<0.05）。BSA组与空白对照组比较差异无显著（P>0.05）。随着孵育葡萄糖浓度的增加，各AGE-BSA组间比较有显著差异（P<0.05）。AGE-BSA干预后胞内线粒体和滑面内质网增多、扩大。结论: AGEs能上调心肌细胞TNF-α mRNA表达和NF-κB活化，并可抑制PPAR-γ mRNA表达，提示AGEs在糖尿病心肌病的发生中可能有重要的作用。     

糖基化终产物通过其受体诱导人肾小球系膜细胞表达CTGF和FN

目的： 探讨体外培养条件下糖基化终产物（AGEs）对人肾小球系膜细胞(HRMCs）中结缔组织生长因子（CTGF）及纤维连接蛋白（FN）基因表达的影响及其可能的作用机制。方法: 将HRMCs与不同浓度的糖化牛血清白蛋白（AGE-BSA）和牛血清白蛋白（BSA）共同培养,或与同一质量浓度的AGE-BSA和BSA共同培养不同时间,以中和性抗RAGE抗体封闭细胞膜上糖基化终末产物受体（RAGE）;采用免疫印迹法（Western blotting）观察AGEs对HRMCs中RAGE表达的影响,半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测CTGF、FN mRNA的表达。结果: 在HRMCs中存在少量RAGE的表达,AGE-BSA能够诱导HRMCs中RAGE的表达增加,并以时间和剂量依赖方式促进HRMCs中CTGF和FN的表达上调;CTGF、FN的表达水平在加入不同浓度（50、100、200、400 mg/L）的AGE-BSA 作用48 h后以及加入质量浓度为200 mg/L的 AGE-BSA 作用不同时间（12、24、48、72h）后,较相应质量浓度或时间的BSA组和空白对照组均明显升高（P＜0.05）;抗RAGE抗体干预后能够部分抑制AGE-BSA诱导CTGF及FN的表达,而人IgG没有这种作用。结论: AGEs可能通过RAGE诱导CTGF及FN的表达上调,是糖尿病肾病肾脏纤维化的可能机制。     

慢性肾小球肾炎患者血清VEGF和HGF水平及临床意义

目的：探讨血清VEGF和HGF在慢性肾小球肾炎（CGN）中的作用。方法：应用ELISA检测35例正常对照组和34例CGN患者尿白蛋白,血清VEGF和HGF浓度以及CGN患者经过治疗后的血清VEGF和HGF浓度。结果：CGN组尿液白蛋白结果显著高于正常对照组（P〈0.01）;CGN组血清VEGF和HGF水平均明显高于正常对照组（P〈0.01）;CGN组血清VEGF与HGF水平经过相关分析,呈正相关r=0.761。经过1个月治疗好转后,CGN患者尿A lb及血清VEGF和HGF水平有显著下降（P〈0.05）。结论：血清VEGF和HGF在CGN的发病机制及治疗预后中有重要的作用,对CGN患者检测血清VEGF和HGF水平有一定的临床价值。     

糖基化终产物对人单核细胞源树突状细胞糖基化终产物受体表达的研究

目的：探讨糖基化终产物 (AGEs）)对人单核细胞源树突状细胞（MDCs）糖基化终产物受体（RAGE） 表达的影响。 方法： 用免疫磁珠分离人外周血CD14+单核细胞，经含rhGM-CSF（100 μg/L）和rhIL-4（50 μg/L）的RPMI-1640培养，使其分化为MDCs，采用RT-PCR和Western blotting法，观察糖基化-白蛋白（AGE-BSA）对MDCs RAGE mRNA和蛋白表达的影响，同时检测培养液上清中IFN-γ和IL-12的浓度。 结果： AGE-BSA诱导DCs RAGE mRNA和蛋白的表达（P＜0.05），高于空白对照组，并且明显促进了DCs IFN-γ和IL-12的分泌（P＜0.05）。BSA干预组与空白对照组相比差异无显著（P＞0.05）。 结论： AGEs能够上调DCs RAGE的表达，并且促进了DCs IFN-γ和IL-12的分泌，这可能是糖尿病通过DCs促进动脉粥样硬化发生的重要机制之一。     

AGEs对肾小管上皮细胞转分化、1型胶原合成及smad信号通路的影响

目的:观察终末期糖基化终产物(AGEs)对正常大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK52E ）转分化、collagenⅠ合成及Smads信号通路的影响。 方法:应用自制的AGEs（AGE-BSA）刺激NRK52E细胞，采用免疫细胞化学方法检测pmad2/3核表达情况；ELISA方法检测细胞培养上清TGF-β₁的浓度；RT-PCR检测TGF-β₁、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；Western印迹检测α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、E-钙粘着糖蛋白（cadherin）和1型胶原（collagenⅠ）蛋白的表达。 结果: AGE-BSA刺激15 min后pSmad2/3核表达明显增加，于30 min（68%）和24 h（76%）出现两个高峰，与刺激前及时间匹配的BSA对照组比较均有显著差异（P<0.05）；AGE-BSA以时间依赖方式上调TGF-β₁、Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达；NRK52E细胞α-SMA和collagenⅠ蛋白表达高于对照组（P<0.01），E-cadherin蛋白表达低于对照组（P<0.01），细胞上清液TGF-β₁的浓度高于对照组（P<0.01）。 结论:AGEs可诱导肾小管上皮细胞Smads信号通路活化，促进肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质collagenⅠ的合成。     

糖基化终产物对人肾系膜细胞Fractalkine分泌的影响

目的 既往实验已观察到糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可增加人肾系膜细胞(human renal mesangial cell,HRMC) Fractalkine (FKN) mRNA和蛋白的表达,现进一步探讨AGEs对HRMC FKN的趋化功能及分泌的影响.方法 运用体外制备的糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin,AGE- BSA)干预HRMC,用Transwall小室装置检测HRMC趋化单核细胞的功能,用ELISA法检测HRMC上清液中FKN的蛋白含量.结果 1. AGE-BSA组HRMC趋化单核细胞数显著高于对照组,FKN中和抗体组HRMC趋化单核细胞数较AGE-BSA组显著减少;2. 随着AGE-BSA浓度的增高及干预时间的延长,细胞的FKN蛋白分泌水平随之增高,且显著高于对照组(P<0.01).结论 AGE-BSA可增强HRMC趋化单核细胞的功能,此效应可被FKN中和抗体部分抑制,且AGE-BSA呈时间和浓度依赖性增加HRMC FKN的蛋白分泌,提示AGEs可能部分通过FKN途径参与糖尿病肾病的发生发展.     

子痫前期患者胎盘组织PLGF表达及血清HGF和VEGF测定

目的：探讨子痫前期患者血清肝细胞生长因子（HGF）、胎盘生长因子（PLGF）表达水平和血管内皮生长因子（VEGF）水平的变化及意义。方法：分别采用放射免疫分析、酶联免疫分析和免疫组化法测定32例子痫前期孕妇（子痫前期组）和35名正常孕妇（对照组）血清VEGF、HGF和PLGF表达水平。结果：子痫前期患者无论轻度子痫前期组和重度组血清HGF含量均显著低于对照组（P均〈0.01）;但轻度和重度组之间水平无显著性差异（P〉0.05）。胎盘中PLGF表达水平也显示轻度和重度两组均显著低于对照组（P均〈0.01）;且重度组又显著低于轻度组（P〈0.01）。血清VEGF水平轻度组显著低于对照组（P〈0.05）;重度组水平较对照组降低更为显著（P〈0.01）,且重度组显著低于轻度组（P〈0.01）。相关分析显示,HGF含量与PLGF具有显著相关性（r=0.6012,P〈0.01）;而与VEGF水平则无明显相关性（r=0.3010,P〉0.05）。结论：测定结果证实,患者血清三项标志物均参与了子痫前期的病理进程,其测定对于了解病情和预后评估有帮助。     

盐酸氨基胍对糖基化终产物诱导的人肾小球系膜细胞调节活化蛋白表达的影响

目的探讨盐酸氨基胍对糖基化终产物（AGEs）促进人肾系膜细胞（HRMC）趋化因子RANTES表达和分泌的干预效应。方法常规方法制备糖基化终产物（AGEs-BSA）和盐酸氨基胍干预体外培养的HRMC,收集培养上清和细胞,ELISA法检测上清中RANTES浓度,实时定量RT-PCR检测RANTES mRNA表达水平,western blot检测RANTES蛋白表达。结果盐酸氨基胍干预组HRMC RANTES的mRNA和蛋白表达以及蛋白分泌明显低于AGE-BSA组（P〈0.05）;且降低水平呈浓度依赖性。结论盐酸氨基胍能抑制AGEs诱导的HRMC RANTES的表达和分泌。     

氨基胍对糖基化终产物干预下人肾系膜细胞β1-整合素及胞外基质成分表达的影响

目的观察氨基胍（AG）对糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）干预的人肾系膜细胞（human renal mesangial cell,HRMC）β1-整合素表达以及胞外基质（extracellular matrix,ECM）成分层粘连蛋白（Laminin,LN）分泌的影响。方法用葡萄糖和牛血清白蛋白制备糖基化终产物（AGE-BSA）,用不同浓度的AG和AGE-BSA共同以及AGE—BSA单独干预体外培养的HRMC。RT—PCR法测定细胞β1-整合素mRNA水平;Western Blot法检测β1-整合素蛋白表达;放射免疫分析法测定细胞培养上清LN含量。结果各浓度氨基胍组均能下调由AGE—BSA诱导的HRMC β1-整合素mRNA和蛋白表达的升高并抑制培养上清LN的分泌,与AGE—BSA组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论氨基胍通过抑制AGEs引起的上述改变,发挥一定的肾脏保护作用。     

Hepatocyte growth factor increases expression of vascular endothelial growth factor and plasminogen activator inhibitor-1 in human keratinocytes and the vascular endothelial growth factor receptor flk-1 in human endothelial cells

The pleiotropic growth factor hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) has been implicated by clinical and experimental studies in repair mechanisms in different organs and tissues. However, no data on the impact of HGF/SF in wound healing in the skin are yet available. Proliferating and migrating keratinocytes play a major role in repair processes in the skin by closing the wound. Recent evidence gathered from studies that used gene-deficient mice has implicated the plasminogen activator (PA)/plasmin system in wound healing, which depends on controlled matrix degradation and deposition during cell migration and proliferation. Furthermore, keratinocytes are an important source of vascular endothelial growth factor (VEGF), which is a potent inducer of angiogenesis. In this study, we show that in human keratinocytes HGF/SF but not the related cytokine macrophage stimulating protein (MSP) significantly increases expression of VEGF and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) on the level of protein and mRNA. Furthermore, we demonstrate that HGF/SF increases the expression of the VEGF receptor flk-1 in human endothelial cells and that, in an angiogenesis co-culture assay of endothelial cells and keratinocytes, HGF/SF increases endothelial cell tube formation significantly. Therefore, we propose a role for HGF/SF in wound repair in the skin: HGF/SF--produced by activated fibroblasts--increases in keratinocytes the expression of PAI-1, which leads to increased matrix stability during the repair process and which could also limit activation of HGF/SF by proteases such as urokinase-type PA (u-PA) or tissue-type PA (t-PA). Furthermore HGF/SF also increases the expression of VEGF in these cells, thereby initiating angiogenesis in a paracrine manner. This effect would be enhanced by an increased responsiveness of endothelial cells toward VEGF, resulting from the HGF/SF-induced up-regulation of flk-1 on these cells.     

正常与糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞移植促进皮肤创伤愈合的比较

目的比较正常和糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞(Adipose mesenchymal stem cells,ADSCs)移植促进皮肤创伤愈合疗效差别。方法无菌条件下获取正常小鼠及糖尿病小鼠的ADSCs,应用流式细胞术对3代细胞表面抗原CD34、CD45、CD90、CD105进行表型鉴定。应用WST法和Transwell迁移实验检测细胞增殖和迁移情况。应用ELISA对正常小鼠及糖尿病小鼠的ADSCs条件培养液中VEGF、HGF和IGF-1蛋白含量进行检测。建立小鼠皮肤创伤模型并随机分为3组,分别以皮内注射方式将3代正常小鼠或糖尿病小鼠来源ADSCs的细胞混悬液移植到小鼠创面四周,空白对照组注射生理盐水,于伤后14d观察创面愈合情况;Western blot检测伤后14d创面组织Bcl-2蛋白表达。结果小鼠ADSCs表达CD90和CD105,不表达CD34和CD45,与正常小鼠相比,糖尿病小鼠来源的ADSCs增殖和迁移能力下降,条件培养液中VEGF、HGF和IGF-1蛋白含量明显降低。糖尿病小鼠ADSCs移植组于创伤后第14d伤口愈合率为(79.6%±6.2%),均显著低于正常小鼠移植组14d的(97.1%±4.1%),两者均高于对照组14d的(64.6%±2.9%,0.05)。与正常小鼠移植组相比,糖尿病小鼠移植组伤后14d创面组织Bcl-2表达水平降低,高于对照组创面组织Bcl-2表达水平。结论正常小鼠来源ADSCs较糖尿病小鼠ADSCs更能促进小鼠皮肤创面愈合。     

Study of platelet-rich fibrin promoting endothelial cell differentiation and angiogenesis induced by transplantation of adipose-derived stem cells

Diabetic patients are characterized by long wound healing time, and adipose stem cells (ADSCs) can secrete growth factors to promote angiogenesis and improve diabetic wound healing. In this research, we attempted to interrogate the impact of platelet-rich fibrin (PRF) on ADSCs in diabetic wound healing. ADSCs were harvested from human adipose tissues and identified through flow cytometry. After pretreatment with cultured medium supplemented with different concentrations of PRF (2.5%, 5%, and 7.5%), proliferation and differentiation capacity of ADSCs were assessed by CCK-8 assay, qRT-PCR and immunofluorescence (IF), respectively. Tube formation assay measured angiogenesis. Western blot analysis analyzed expression of endothelial markers and the extracellular signal-regulated kinase (ERK) and serine/threonine kinase (Akt) pathways in PRF-induced ADSCs. The CCK-8 experiment indicated that PRF enhanced proliferation of ADSCs in dose-dependent manner, relative to normal control group. The expression of endothelial markers and the capacity of tube formation were significantly promoted by 7.5% PRF. The release of growth factors containing vascular endothelial grow factor (VEGF) and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) from PRF was increased with the extension of detection time. When the receptors of VEGF or/and IGF-1 were neutralized, ADSCs differentiation into endothelial cells were obviously inhibited. Additionally, PRF stimulated ERK and Akt pathways, and the inhibitors of ERK and Akt attenuated PRF-induced differentiation of ADSCs into endothelial cells. In conclusion, PRF promoted endothelial cell differentiation and angiogenesis induced by ADSCs in diabetic wound healing, which appears to give guidance for treating patients.     

Effect of EGF and bFGF on Fibroblast Proliferation and Angiogenic Cytokine Production from Cultured Dermal Substitutes

Abstract

Growth factors accelerate wound healing but the underlying mechanisms remain poorly understood. The aim of this study was to investigate the effect of epidermal growth factor (EGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) on fibroblast proliferation and production of angiogenic factors from cultured dermal substitutes (CDS). In the first experiment, fibroblasts were seeded into a flask at a density of 1 × 10⁴ cells/cm².Cell proliferation was assessed after culturing in media containing EGF or bFGF at concentrations ranging from 2 to 50 μg. The number of fibroblasts increased significantly in the presence of EGF or bFGF, but fibroblasts detached from the flasks in the presence of 50 μg bFGF. In the second experiment, CDS were prepared by incorporating fibroblasts into collagen gels. To make a wound surface model, the CDS was elevated to the air–liquid interface, on which a spongy sheet of hyaluronic acid (HA) containing EGF or bFGF was placed. The amount of vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth factor (HGF) released from the CDS after 1 week of cultivation was measured by ELISA. When the CDS was covered with a HA sponge containing EGF (Group 1), fibroblasts released 3.5-times more VEGF compared with a HA-alone sponge (control group). When covered with a HA sponge containing bFGF (Group 2), 8.7-times more VEGF was released compared with the control group. Fibroblasts in Groups 1 and 2 released 9.6- and 9.3-times more HGF, respectively, compared with the control group. Thus, EGF stimulates fibroblasts to produce VEGF and HGF, in addition to its ability to enhance epidermal cell proliferation.     

慢病毒介导的CCN1基因对大鼠骨髓间充质干细胞

 目的：探讨外源性CCN1对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长和迁移的作用。方法：构建带有绿色荧光蛋白的大鼠CCN1慢病毒载体（Lenti-GFP-CCN1）并感染大鼠BMSCs,筛选最适感染复数（MOI）;实验分为空白组、感染Lenti-GFP组和感染Lenti-GFP-CCN1组,倒置荧光显微镜下观察BMSCs感染后荧光表达情况;MTT法检测细胞存活率,划痕愈合实验检测细胞迁移作用。结果：与空白组和阴性对照组相比,Lenti-GFP-CCN1感染大鼠BMSCs后,细胞的存活率未见明显差异;感染组细胞划痕愈合实验的愈合宽度/原宽度值与空白组及阴性对照组相比差异显著（P<0.05）。结论：外源性CCN1对正常大鼠BMSCs存活率无影响,可促进BMSCs迁移。     

低能量体外震波对糖尿病慢性创面模型血管新生和血管内皮细胞生长因子表达的影响**☆

背景：体外震波作为一种非侵入性的物理刺激近年来发现具有促进新生血管形成、促进组织修复的功能。 目的：观察体外震波对创面内血管内皮细胞生长因子表达和新血管形成的影响及促进创面愈合的作用。 方法：72只SD大鼠随机均分为治疗组、糖尿病组及对照组。治疗组和糖尿病组制作糖尿病慢性创面模型。建模后1 d治疗组创面用体外震波处理,糖尿病组和对照组仅涂抹耦合液。观察创面的肉芽组织和新血管形成情况,检测血管内皮细胞生长因子蛋白含量及mRNA的表达水平。 结果与结论：与糖尿病组比较,治疗组创面的闭合率增加。治疗后3 d开始,治疗组创面内毛细血管数量比糖尿病组增多,肉芽组织相应增加。与对照组比较,糖尿病组血管内皮细胞生长因子蛋白含量和mRNA表达水平在3 d和7 d均降低,在7 d出现下降。经体外震波治疗后,各时间段表达均增高,在14 d出现下降。说明糖尿病创面局部血管内皮细胞生长因子分泌量降低和高表达时段缩短是其难愈的重要因素之一,体外震波治疗可增加糖尿病创面组织内血管内皮细胞生长因子的表达强度,延长其高表达的时间,从而促进创面内新血管形成,最终加快肉芽组织生长和创面愈合。关键词：体外震波;糖尿病创面;血管内皮细胞生长因子;血管新生;愈合 缩略语注释：VEGF: vascular endothelial growth factor,血管内皮细胞生长因子 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.15.019     

AGEs对人主动脉内皮细胞线粒体融合蛋白表达的影响

目的:明确晚期糖基化终产物(AGEs)是否可引起内皮细胞线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2表达水平的变化。方法:AGEs用糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)代替。将购买的原代人主动脉内皮细胞株进行体外扩增、传代、分组,进行AGEs干预,分为对照组,不同浓度梯度的AGEs干预组(50 mg/L、100 mg/L和200 mg/L)和干预不同时间组(分别是100 mg/L的AGEs干预人主动脉内皮细胞6 h、12 h、24 h和48 h)。采用实时荧光定量PCR方法对AGEs干预后的人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的mRNA表达水平进行检测;采用Western blot法对AGEs干预后的人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的蛋白表达水平进行检测。结果:不同浓度AGEs干预人主动脉内皮细胞24 h可引起Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平显著降低;100 mg/L AGEs干预人主动脉内皮细胞6 h,Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平与对照组相比无显著变化,而干预12 h、24 h和48 h均引起人主动脉内皮细胞Mfn1和Mfn2的mRNA和蛋白表达水平显著降低。结论:AGEs干预体外培养的人主动脉内皮细胞12 h后其线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2的表达水平降低,提示AGEs可能引起内皮细胞线粒体动力学的改变,并可能通过这一途径引起内皮细胞线粒体功能异常,而导致内皮细胞的功能异常。