SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

BRCA2基因启动子的克隆和分析

目的构建BRCA2基因启动子的荧光素酶报告质粒,为BRCA2基因调控研究提供基础。方法采用高保真Taq聚合酶,从正常人外周血中扩增出BRCA2启动子并将其插入质粒中。通过基于PCR的定点突变方法在多态性位点rs3092989(-254A/G)获得含-254G等位基因的序列。亚克隆BRCA2启动子片段至pGL3-basic报告基因载体中,构建含BRCA2启动子的重组报告质粒。转染HeLa细胞,评价启动子活性以及-254A/G多态性位点对活性的影响。结果酶切和直接测序法证实所构建质粒含有pGL3-basic及BRCA2基因启动子序列,扩增的含-254A和-254G的BRCA2启动子序列正确。构建的报告基因具有启动子活性,与pGL3-basic质粒相比较,BRCA2启动子的相对荧光单位增加了413倍。rs3092989(-254A/G)多态位点未明显影响启动子活性。结论 BRCA2转录起始位点上游序列具有较强的启动子活性。成功克隆BRCA2启动子并引入相关突变,可为后续的基因转录调控研究奠定基础。     

人GDDR基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆人GDDR基因的启动子;构建GDDR启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法:设计合成GD-DR启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增GD-DR启动子;将扩增片段插入T载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至pGL3-Basic荧光报告基因载体;瞬时转染细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:PCR扩增得到人GDDR基因启动子;成功构建pGL3-GDDR-promoter 报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.结论:成功地构建人GDDR基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究GDDR转录表达的调控机制提供基础.     

人前列腺特异性膜抗原基因启动子/增强子表达载体的构建及组织特异性鉴定

目的：构建前列腺特异性表达的人前列腺特异膜抗原（PSMA）基因启动子/增强子表达载体，并进行组织特异性鉴定。 方法：从人外周血中提取基因组DNA，采用PCR技术分别扩增PSMA上游 1 175 bp 的启动子序列，及第三内含子中258 bp的增强子序列，将两个序列定向克隆至荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-Basic，构建前列腺特异性表达载体pGL3-PSMP-PSME。将构建载体用脂质体分别转染前列腺癌PC-3M细胞株及4种非前列腺癌细胞株，48 h后通过检测荧光素酶表达活性，确定克隆的启动子及增强子的活性及其组织特异性表达活性。结果：构建的pGL3-PSMP-PSME质粒经酶切及DNA测序分析鉴定，证实克隆片段的大小、插入方向及其序列正确。细胞转染结果显示， pGL3-PSMP-PSME在PC-3M细胞株中表达活性明显高于其它4种非前列腺癌细胞株。结论：构建的前列腺表达载体具有较高的组织特异性, 为进一步研究PSMA调控序列驱动治疗基因进行前列腺癌的靶向生物治疗奠定了基础。     

CD226基因5''''上游调控序列研究

目的：研究CD226基因5’上游调控序列对CD226基因表达调控的影响。方法：通过基因克隆的方法将CD226基因5’上游调控序列，克隆到荧光素酶报告基因载体中（pGL3-basic），用脂质体转染Jurkat细胞，48小时后检测荧光素酶活性。结果：CD226基因存在两个启动子P1和P2，分别位于与-843--319bp和＋1-＋181bp，PMA可以上调P1的启动子活性，对P2有一定的抑制作用；A23187均可以上调两个启动子的活性，但对P2的作用更为明显。结论：CD226基因存在两个启动子，其活性受到PMA和A23187的调控，并呈与蛋白水平表达调控相类似的模式。     

NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探

目的：构建NOx4荧光素酶报告基因质粒载体,探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作,采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列（533bp）,插入质粒DGL3-basic载体,构建重组质粒pGL3-NOX4,重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3-NOX4转染A549细胞,通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激,结果显示NOx4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体,为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。     

人NKX3.1基因启动子的克隆及在不同肿瘤细胞系中启动子活性的测定(英)

目的：克隆NKX3.1基因启动子并检测其启动子活性，为研究NKX3.1 基因转录调控的基本机制奠定基础。 方法： 采用PCR方法从人基因组中扩增NKX3.1基因上游 1.04 kb 启动子片段并分别克隆到报道基因载体pGL3-basic和 pEGFP-1中，通过转染细胞、荧光素酶活性测定及荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，检测其启动子活性。 结果： DNA测序结果证实克隆的 1.04 kb 启动子片段序列正确；pGL3-1.04 kb 启动子转染LNCaP细胞后，双荧光素酶活性测定M1/M2=2.7, 为pGL3-control 活性的1.5倍，为pGL3-basic活性的50倍。表明克隆的人NKX3.1基因上游 1.04 kb 片段具有较强的启动子活性。为检测此 1.04 kb 启动子在不同组织细胞中的活性，分别将pGL3-1.04 kb 启动子和pEGFP-1.04 kb启动子转染入不同的肿瘤细胞系，检测荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达。结果显示 1.04 kb 启动子在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。采用TRANSFAC数据库分析，发现在 1 040 bp 片段内含有多种顺式作用元件，它们的功能性将需要进一步实验证明。 结论： 克隆的人NKX3.1基因上游 1.04 kb 片段具有较强的启动子活性，并且在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。     

人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1基因P7启动子调控的报告基因载体的构建及鉴定

应用PCR方法从人单核细胞系THP-1基因组DNA扩增人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase1, ACAT1)基因 P7启动子全长片段,进行TA克隆,经双酶切、测序鉴定阳性克隆.将该基因亚克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Enhancer,用DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)法将重组质粒pGL3E-P7瞬时转染入单核细胞THP-1,检测其活性,证明pGL3E-P7能在体外表达荧光素酶.人ACAT1基因P7启动子调控的荧光素酶报告基因表达载体的成功构建,为研究动脉粥样硬化过程中ACAT1基因的转录调控机制提供新手段.     

HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响

目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:(1)经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。(2)获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。(3)转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP(P0.01)。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

小鼠BCMA基因启动子活性研究

目的:探索B淋巴细胞成熟抗原(BCMA)基因5′上游序列的启动子活性, 为进一步研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据.方法:构建由BCMA基因5′上游-820～ 145、 -607～ 145、 -359～ 145、 -157～ 145、 -93～ 145 5个片段驱动的荧光素酶报告载体pGL3-B820、 pGL3-B607、 pGL3-B359、 pGL3-B157、 pGL3-B93, 通过转染J558L、 293T、 HeLa细胞检测荧光素酶的表达, 观察荧光素酶相对活性.结果:5种5′删除体的转录激活性由大到小为pGL3-B157>pGL3-B607>pGL3-B359>pGL3-B93>pGL3-B820.pGL3-B157在3种细胞中的转录激活能力为J558L>HeLa>293T, 且在J558L中的转录激活能力明显强于Hela和293T细胞.结论:BCMA基因5′上游序列"-820 bp～ 145 bp"具有启动子活性, 核心启动子可能位于-93～ 145区域中.     

MicroRNA143调节结肠癌细胞KRAS蛋白的表达

目的：探讨结肠癌细胞中microRNA143（miR-143）对KRAS蛋白表达的影响及其作用机制。方法: 从基因组DNA中克隆pri-miR-143基因，构建miR-143的表达载体。miR-143转染结肠癌细胞系SW480，用Northern blotting方法测定miR-143水平的变化，通过RT-PCR和Western blotting方法检测转染细胞中KRAS基因的表达。构建含miR-143结合位点的荧光素酶报告载体，与miR-143表达载体共转染，检测细胞中的荧光素酶活性。结果: 基因转染的SW480细胞中miR-143的表达显著升高， KRAS蛋白的表达水平下降约40%，KRAS mRNA则未受影响。miR-143表达载体与含miR-143结合位点的报告载体共转染可以抑制细胞中的荧光素酶活性。结论: 结肠癌细胞中microRNA143在转录后水平抑制KRAS蛋白的表达。     

特异性hTERT启动子在肿瘤细胞中启动效率研究

目的证明人端粒酶亚单位（hTERT）启动子可以引导目的基因在肿瘤细胞中表达。方法先使用RT-PCR检测各细胞系中hTERT mRNA的表达,再使用PCR方法扩增hTERT启动子基因的不同长度片段,并构建重组质粒,使用BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定重组质粒并测序。最后使用Dual-Glo Luciferase Assay System激发荧光检测各细胞系中重组质粒中hTERT启动子的启动效率。结果 pGL3-204、pGL3-378、pGL3-1375重组质粒中的hTERT启动子序列与预期一致,质粒构建成功。hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒在H460中启动效率最强可以达到SV40启动子的80%,而在FRO、U251中启动效率可以达到SV40启动子的30%左右。hTERT全长启动子序列的启动效率在ARO细胞系中比pGL3-204、pGL3-378中的启动子片段启动效率强,而在FRO、H460和U251细胞系中pGL3-204中的启动子片段启动效率最强。结论 hTERT启动子引导荧光基因的重组质粒,可以实现只在肿瘤细胞系中表达,但在正常细胞中不表达的效果。     

鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列转录调控特性的研究

目的:研究鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列的转录调控特性。方法:构建一系列携带ezrin基因-1541/-706序列的报告基因表达载体,ezrin基因-1541/-706序列以正向和反向分别连接至不含启动子的报告基因上游、ezrin启动子上游、SV40启动子上游、ezrin启动子或SV40启动子控制的报告基因下游,将质粒转染CNE2细胞,检测荧光素酶活性。结果:CNE2细胞中,当-1541/-706序列正向位于报告基因上游时表现出启动子活性,其转录激活作用约为ezrin启动子的50%;反向连接时无启动子活性。而且,当-1541/-706序列正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著提高荧光素酶表达;当反向位于启动子下游、正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。结论:CNE2细胞中ezrin基因启动子上游序列具有转录激活和转录增强作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性。     

Identification and analysis of the promoter region of the STGC3 gene

Introduction

Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is a common malignant tumor of the head and neck. The STGC3 gene is related to development of nasopharyngeal cancer. The aim of this study is to explore the promoter region of the STGC3 gene.

Material and methods

The bioinformatic technique was applied to predict its promoter region and construct the gene promoter region luciferase for the gene vector and transfection of the human embryonic kidney epithelial 293T cell line, human nasopharyngeal carcinoma CNE2 cell line and immortalized nasopharyngeal epithelial NP69 cell line. The recombinant plasmid pGL3-en283, pGL3-en281, pGL3-en571, empty plasmid pGL3-control, negative control pGL3-enhance and internal control of marine intestine luciferase expression vector pRL-SV40 were transfected into NP69 cells, 293T cells and CNE2 cells. Dual luciferase activity detection showed luciferase luminescence values and marine intestine luciferase luminescence values. Relative luciferase activity (RLA) in each cell was calculated.

Results

We observed strong promoter activity of plasmid pGL3-en283, pGL3-en281 and pGL3-en571 in NP69, 293T and CNE2 cells compared with the negative control pGL3-enhance plasmid. Among them, pGL3-en281 showed the strongest promoter activity, and these three kinds of recombinant plasmids showed stronger promoter activity in 293T cells than in CNE2 cells.

Conclusions

The pGL3-en281 plasmid showed stronger promoter activity than pGL3-en571 in the three cells, indicating that –11048 bp to –653 bp might be the core promoter region.     

利用合适的启动子提高外源基因在Jurkat细胞中的表达

目的通过选择合适的启动子来实现外源基因在Jurkat细胞中的高效表达。方法以pGL3-MCS质粒为基础构建不同启动子(SV40、CMV、EF1α和UbC)驱动萤火虫荧光素酶Fluc报告基因表达的重组质粒,并将其与作为内参的表达海肾荧光素酶Rluc报告基因的质粒共转Jurkat细胞,检测Jurkat细胞中这两种荧光素酶与相应底物反应所产生的荧光强度,计算Fluc与Rluc荧光强度的比值即Fluc的相对酶活,通过比较Fluc相对酶活的大小来选取在Jurkat细胞中具有高表达活性的启动子。结果以pGL3-MCS质粒为基础成功构建了不同启动子驱动Fluc报告基因表达的重组质粒pGL3-CMV、pGL3-EF1α和pGL3-UbC。在Jurkat细胞中,不同启动了驱动的Fluc报告基因的相对酶活的强弱关系为pGL3-UbCpGL3-EF1αpGL3-CMVpGL3-MCS。结论可以选择高活性的人源泛素C启动子实现外源基因在Jurkat细胞中的高效表达,以利于Jurkat细胞系在哺乳动物T淋巴细胞以及免疫相关功能研究中的应用。     

人高密度脂蛋白受体基因3'UTR对其mRNA稳定性的影响

目的考察人高密度脂蛋白受体SR—BI基因3＇UTR对其mRNA稳定性的影响。方法以人肝癌细胞株HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增获得SR．BI基因mRNA3＇UTR全长序列,克隆至荧光素酶报告基因的下游,分别构建重组质粒pc．1uc．3’UTR以及pGL3-CLAp—luc-3’UTR。利用脂质体转染HepG2细胞,进而检测转染后细胞的荧光素酶活性、荧光素酶报告基因mRNA的表达水平以及荧光素酶报告基因mRNA的半衰期。结果通过PCR成功扩增获得人SR—BI基因3’UTR全长序列,分别构建重组荧光素酶报告质粒pc-luc-3’UTR以及pGL3一CLAp—luc-3’UTR,并以pGL3一CLap-luc-3’UTR转染HepG2细胞建立稳定转染细胞株CLAp-luc．3’UTRHepG2。通过荧光素酶活性检测、实时荧光定量RT-PCR以及mRNA半衰期检测,结果证实SR．BI基因的3＇UTR的存在可显著降低荧光素酶活性及其mRNA水平,mRNA半衰期也显著缩短。结论SR—BI基因3＇UTR对其mRNA的稳定性有显著的影响,是SR．BI基因转录后水平调控的关键,为SR．BI基因表达调控提供了一个新机制。