噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库。方法利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库。由L inker-prim erm ix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体。再用RS prim erm ix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因。以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库。结果成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库。经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011pfu。结论rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础。     

噬菌体展示技术构建重组人TNF-α单链抗体库

目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)的单链抗体库.方法 利用噬菌体表面展示技术、绕过杂交瘤技术,提取经免疫BALB/c小鼠淋巴细胞总RNA,用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因,构建VH、VL抗体库.由Linker-primer mix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体.再用RS primer mix以单链抗体为模板进行第二次聚合酶链反应,从而获得全套抗rhTNF-α的单链抗体基因.以SfiⅠ/NotⅠ,位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,转化大肠杆菌TG1后,经M13KO7辅助噬菌体拯救,构建成全套抗rhTNF-α单链抗体表面展示文库.结果 成功构建了rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库.经M13KO7超感染后,噬斑计数滴度为2.1×1011 pfu.结论 rhTNF-α全套单链抗体噬菌体表面展示文库的构建,为研究rhTNF-α抗体结合位点,了解其结构与功能的关系以及研究用于临床免疫治疗的新型抗体打下了基础.     

鼠抗人TNF-α单域抗体基因在大肠杆菌中的融合表达

ＲＴ－ＰＣＲ法获得鼠抗人肿瘤坏死因子－α单克隆抗体Ｅ６轻,重链可变区基因序列,分别构建融合表达载体ｐＧＥ６ＶＨ和ｐＧＥ６ＶＬ,利用大肠杆框图 系统表达ＶＨ和ＶＬ单域抗体蛋白。方法：将ＲＴ－ＰＣＲ法获得的Ｅ６ＶＨ和Ｅ６ＶＬ基因分别克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中,使它们受控于Ｐｔａｃ启动子,转化大肠杆菌ＤＨ５α,经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,１００ｇ／ＬＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达     

抗人TNF-α单克隆抗体对银屑病患者血清TNF-α的中和研究

目的:研究抗人TNF-α单克隆抗体对寻常型银屑病患者血清TNF-α的中和效应。方法:应用双抗体夹心ELISA方法检测正常人及患者血清应用单克隆抗体中和前后TNF-α的浓度改变。应用L929细胞检测正常人和患者血清抗体中和前后的生物学活性变化情况。结果:正常人与银屑病患者血清TNF-α的浓度分别为:(3.146±6.184)pg/ml及(62.723±38.379)pg/ml;其生物学活性分别为:(6.817±5.086)%及(57.498±9.125)%。抗体中和后患者血清TNF-α的浓度为:(0.503±1.178)pg/ml;中和后的生物学活性为:(25.378±14.863)%。结论:寻常型银屑病患者血清中TNF-α的浓度及生物学活性均高于正常对照,而抗人TNF-α单克隆抗体在体外可以很好地中和患者血清中TNFα的浓度及其生物学活性。     

抗IL-2、抗TNF-α自身抗体的测定及临床初步观察

用γＩＬ－２和ＴＮＦ－α建立了检测抗ＩＬ－２和抗ＴＮＦ－α自身抗体的间接ＥＬＩＳＡ法。在１０．２％的ＳＬＥ患者血清中可检出自然存在的抗ＩＬ－２抗体，１８．８％～４０．０％的慢性肾炎、ＳＬＥ、ＲＡ、桥本甲状腺炎患者可检出抗ＴＮＦ－α自身抗体。经用中和试验证实，建立的方法具有特异性。抗此类细胞因子自身抗体有何免疫病理意义，尚待临床进一步研究     

抗人肿瘤坏死因子—α单链抗体基因的构建及序列测定

目的：构建鼠抗人肿坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）单链抗体基因。方法：从分泌ｈＴＮＦ－α单抗的小鼠杂交瘤细胞株Ｅ６中获得抗中变区基因的基础上，采用限制性内切酶酶切拼接法，并按ＶＨ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬ的结构将轻，重链可变区基因拼接单链抗体（ＳｃＦｖ）基因，荧光标记测序引物分析其核苷酸序列。结果：构建成长７４７ｂｐ的单链抗体基因。其中连接钛基因长４５ｂｐ，经序列测定和分析表明为拼接正确，完整的抗ｈＴＨＦ０     

类风湿关节炎患者血清中抗CCP抗体和TNF-α表达的临床意义

目的 探讨类风湿关节炎(RA)患者的血清中抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体和肿瘤坏死因子α(TNF-α)在RA的诊断及疗效评价中的价值.方法 选取该院2012年1月至2015年12月收治的RA患者168例,分为活动期患者86例(活动组),缓解期患者82例(缓解组),另选取门诊健康对照80例(对照组),用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组的类风湿因子(RF)、抗CCP抗体和TNF-α等各项指标,进行比较分析.结果 活动组和缓解组患者血清的抗CCP抗体和TNF-α水平均高于对照组,活动组血清TNF-α和CCP水平明显高于缓解组,差异有统计学意义(P＜0.05).168例RA患者与对照组相比,TNF-α和抗CCP抗体联合检测的灵敏度和特异度分别为73.8%和97.5%,和其他两项联合检测相比,差异有统计学意义(P＜0.05).TNF-α的水平与患者疾病活动指数28(DAS28)评分呈正相关(P＜0.01).结论 联合检测RA患者血清中的抗CCP抗体和TNF-α水平对患者的诊断和病情的监测有重要临床价值.     

内障丸对抗精子抗体阳性小鼠TNF-α表达的影响

目的：探讨内障丸对抗精子抗体阳性小鼠TNF-α表达的影响。方法：将成年雌性小鼠随机分为4组,用主动免疫法进行造膜,造膜后1周开始给药,连续3周。用放射免疫法检测肿瘤坏死因子。结果：内障丸组与模型组相比肿瘤坏死因子明显降低。结论：内障丸可以抑制精子抗体的产生,内障丸可以降低血清和蜕膜中异常升高的肿瘤坏死因子,全面改善外周血和子宫局部内环境,调节机体失衡的免疫状态,内障丸可以明显提高抗精子抗体阳性小鼠的窝产仔数,恢复其生殖能力,且疗效优于醋酸泼尼松组。     

重组肿瘤坏死因子-α抗血清对大鼠实验性结肠炎的影响

目的 探讨灌胃给予肿瘤坏死因子-α(TNF-α)多克隆抗体对溃疡性结肠炎的作用。方法 以50mg／kg三硝基苯磺酸(TNBS)经肛门注入大鼠肠腔，复制大鼠溃疡性结肠炎模型；用兔抗人TNF-α多克隆抗体血清10mg／kg给大鼠灌胃，观察一氧化氮(N0)含量、髓过氧化物酶(MPO)活性及TNF-α在大鼠溃疡性结肠炎组织中的表达。结果 抗TNF-α多克隆抗体治疗可明显减轻溃疡性结肠炎的病理改变，抑制局部结肠组织NO的产生、MPO活性以及TNF-α表达。结论 抗TNF-α血清通过中和TNF-α，可抑制溃疡性结肠炎结肠组织表达TNF-α及炎性介质的释放，从而减轻溃疡性结肠炎的病理损伤。     

抗hTNF-α中和抗体识别表位的筛选和鉴定

目的:对噬菌体随机线性7肽库进行筛选,得到能与抗hTNF-α中和抗体特异性结合的表位肽.方法:以抗hT-NF-α中和抗体为靶,筛选噬菌体线性7肽库,双夹心ELISA,竞争抑制ELISA及MAP点杂交鉴定阳性噬菌体克隆.结果:经3轮筛选后随机挑取50个噬菌体克隆,经ELISA检测其中15个克隆显示与抗hTNF-α抗体有较强的结合能力,DNA测序结果得到的结构相似群为:WTFKMQP,WPFKMSP,WPYK-MIP和WNYKMLP,竞争性ELISA结果显示四个序列均能与TNF竞争性结合抗hTNF-α mAb,MAP点杂交结果显示筛选得到的多肽是能与抗hTNF-α抗体特异性结合的多肽.结论:筛选得到的7肽序列具有很高的同源性,并能与抗hTNF-α中和抗体特异性结合,为hTNF-α相关多肽疫苗的研究提供依据.     

Hsv-tk、重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的构建pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体,观察其在喉癌细胞Hep-2中的瞬时表达.方法应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序,利用逆转录病毒载体PLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK-rhTNF-α并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间,成功构建表达载体pEGFP-TK-rhTNF-α,并在该载体转染人喉癌细胞Hep-2后观察融合蛋白表达情况.结果酶切鉴定证实TK-rhTNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间,并在转染人喉癌细胞Hep-2中观察到TK-rhTNF-α融合基因及绿色荧光蛋白的表达.结论pEGFP-TK-rhTNF-α表达载体便于观察转染细胞中TK-rhTNF-α融合蛋白的表达情况及蛋白定位,为自杀基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件.     

抗人跨膜型肿瘤坏死因子-α多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备特异的能区分人跨膜型肿瘤坏死因子（TM—TNF—α）和分泌型肿瘤坏死因子（sTNF—α）的多克隆抗体。方法借助抗原肽预测软件对TM—TNF—α的抗原表位进行预测，合成TM—TNF—α特异的20个氨基酸的多肽，将之与匙孔碱血蓝蛋白（KLH）耦联。BALB／c小鼠皮背部多点注射，收集分离血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术鉴定其特异性。结果成功免疫BALB／c小鼠，ELISA证实该抗血清与免疫多肽有良好的结合，而与sTNF-α、白细胞介素-2（IL-2）和γ-干扰素（IFN-γ）无交叉反应，流式细胞术显示该抗血清可与细胞系U937表达的TM—TNF—α发生特异性结合。结论成功制备了TM—TNF—α特异性多克隆抗体。为制备TM—TNF—α特异性单克隆抗体莫定了基础，为区分TM—TNF—α和sTNF—α的生物学作用提供了有力的工具。     

大鼠AChR抗体致中枢受损与IL-1和TNF-α的相关性

目的　探讨重症肌无力 (MG)患者中枢神经系统(CNS)损害与白细胞介素 1(IL 1)和肿瘤坏死因子 (TNF α)之间的关系 ,旨在阐明部分MG伴有CNS损害的机制 .方法　将MG患者血中提取的IgG注入大鼠脑室系统 ,建立大鼠CNS受损模型 ,然后用放免方法检测大鼠脑、胸腺、血清中IL 1和TNF水平的变化 .结果　脑室内注入IgG后第 1周起脑、胸腺及血清中IL 1和TNF α水平显著升高 .IL 1在脑组织上升最为明显达 (196± 41) μg·kg-1;而在胸腺及血中上升则相对缓慢 ,分别为 (190± 47) μg·kg-1和 (174± 31) μg·L-1.TNF α在脑、胸腺和血中的水平分别为 :(19± 4) μg·kg-1,(2 3± 5 ) μg·kg-1和 (2 6± 5 ) μg·L-1.结论　大鼠CNS受损MG模型脑、胸腺及血中IL 1和TNF α水平显著升高 ,表明在MG患者CNS损害过程中可能起重要作用     

重组人穿孔素协同TNF-α对HIV感染CD4+细胞的影响

目的 观察重组人穿孔素协同TNF-α对HIV感染CD4 细胞的影响.方法 HIV-1SF33感染MT4细胞,加入重组人穿孔素和TNF-α作用24 h.倒置显微镜观察细胞形态,单细胞凝胶电泳技术观察DNA损伤情况,吖啶橙/溴乙啶双荧光染色和原位(缺口)末端标记法检测细胞凋亡.结果 HIV感染MT4细胞形态尚好,仅出现荧光团,可见个别凋亡细胞;单纯TNF-α作用后,胞浆内可见少量颗粒,部分细胞核出现弥散和微量的彗星拖尾现象,凋亡细胞较正常对照组增多;穿孔素和TNF-α协同作用后,部分细胞体积变小,细胞内颗粒增多,明显的彗星拖尾现象,凋亡细胞数增多.结论 穿孔素协同作用可明显增强TNF-α致HIV感染CD4 细胞的凋亡.     

结核性脑膜炎脑脊液TNF-α和可溶性TNF受体的动态变化

目的：了解结核性脑膜炎（简称结脑）患者脑脊液中肿瘤坏死因子（TNF－α）和可溶性肿瘤坏死因子受体（sTNFR-I和sTNFR-Ⅱ）在抗结核治疗中的变化及意义。方法：用夹心ELISA法检测24例结脑患者治疗前和其中12例在治疗后第10、20、30d的脑脊液TNF－α、sTNFR-1和sTNFR-Ⅱ含量。结果：结脑患者脑脊液中TNF－α、sTNFR-I和sTNFR-Ⅱ显著高于对照组，抗结核治疗一个月后仍维持较高水平，但是与治疗前相比sTNFR-1和sTNFR-Ⅱ水平呈明显下降，而TNF－α水平变化不明显。结论：TNF－α、sTNFR-I和sTNFR-Ⅱ与结核感染有关；sTNFR-I和sTNFR-Ⅱ对抗结核治疗的反应较敏感，其水平的动态变化可作为判断结脑病情及治疗效果的一种指标.     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗类风湿性关节炎的效果

目的 探讨重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rh-TNFR:FC)联合甲氨蝶呤(MTX)治疗类风湿性关节炎(RA)的效果.方法 选取2018年6月至2019年12月河南科技大学第一附属医院收治的115例RA患者作为研究对象,按照随机数表法分为对照组(n=57)与联合组(n=58).对照组采取单纯MTX治疗,联合...     

人HMGB1诱导单核细胞分泌TNF-α的规律

目的 :探讨人高迁移率族蛋白 1 (HMGB1 )诱导人单核细胞TNF α的分泌规律和HMGB1在脓毒症中的作用 .方法 :HMGB1的剂量效应组分别用含有 0 .1 ,1 .0 ,1 0 ,2 0和5 0mg·L-1 HMGB1的培养基孵育与人单核巨噬细胞系THP1 ,共培养 6h ,用双抗体夹心ELISA法测其上清中的TNF α含量 ,采用流式细胞技术观察细胞的凋亡 .HMGB1的时间效应组以含有 2 0mg·L-1 HMGB1的培养基、对照组以不含HMGB1的培养基、另外以含有 2 0mg·L-1 HMGB1和10 0mg·L-1 脂肪多糖 (lipopolysaccharide ,LPS)的混合组的培养基分别培养THP1细胞 0 ,2 ,4 ,6 ,8,1 0 ,1 2和 2 4h ,同上留取离心后的培养液上清 ,用双抗体夹心ELISA法测其上清中的TNF α含量 .结果 :将HMGB1加入到单核细胞培养液中能明显刺激其TNF α的分泌 .在 0 .1～ 5 0mg·L-1 范围内 ,HMGB1诱导THP1的TNF α分泌增加 ,呈显著剂量依赖性关系 ,5 0mg·L-1 HMGB1能明显诱导THP1细胞的凋亡 ;HMGB1组和HMGB1与LPS的混合组THP1的TNF α分泌在 0～ 2 4h间呈双相性规律 .结论 :人HMGB1能诱导人单核细胞的TNF α分泌与凋亡 ,初步证实HMGB1在脓毒症的发生、发展中发挥重要作用     

抗TNF-α单克隆抗体对VMC小鼠影响的实验研究

目的:了解肿瘤坏死因子α(TNFα)在病毒性心肌炎小鼠发病中的作用及抗TNFα单克隆抗体对心肌损伤的保护效应。方法:BalB/c小鼠随机分为正常对照组、病毒感染组和病毒感染加抗体治疗组,测定感染后7d和14d心肌组织TNFα的表达、病理变化、超微结构改变和小鼠生存率。结果:①治疗组TNFα表达较感染组低(P<0.05);②治疗组心肌病理变化和超微结构改变减轻,生存率提高;③感染组TNFα表达与心肌病变积分呈正相关(P<0.05)。结论:TNFα在病毒性心肌炎发病中发挥重要作用,抗TNFα单克隆抗体对受损心肌有保护作用。     

人重组IL—2G与TNFα抗肿瘤的实验研究

观察ｒｈＩＬ－８和ＴＮＦα对肿瘤的作用。用ＭＴＴ法检测ｒｈＩＬ－８和ＴＮＦα体外对ＥＬ－４，Ｂ１６瘤细胞的细胞毒作用；小鼠体内抑瘤试验。结果：ｒｈＩＬ－８对ＥＬ－２，Ｂ１６瘤细胞体外无直接杀伤作用，ｔｈＩＬ－８和ＴＮＦα联合运用可有效抑制同种异体ＥＩＬ－４，Ｂ１６瘤细胞在Ｃ５７小鼠成瘤及生长。     

TNF-α所致的胰岛素抵抗

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于正常。表现为外周组织，尤其是脂肪、肌肉组织对葡萄糖的摄取减少和抑制肝脏葡萄糖输出的作用减弱。IR作为2型糖尿病(tyloe 2 diabetes，T2DM)发展过程中一个早期和重要的特征，同时也是动脉硬化和x综合征(syndrome X)的重要危险因素．