人组织激肽释放酶6的原核表达载体的构建及表达

目的：构建人组织激肽释放酶6原核表达系统。方法：采用RT-PCR技术从人乳腺癌组织中扩增出KLK6基因片段,克隆至原核表达载体pET28b中,经酶切和序列测定后,转化至E.coli BL21,IPTG进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,Ni-NTA亲和层析柱纯化,其纯化产物进行SDS-PAGE和Western-blot检测。结果：pET28b-KLK6原核表达载体构建成功,经IPTG诱导高效表达hK6蛋白,纯化后获得大量高纯度蛋白。结论：成功构建了KLK6的原核表达系统并在E.coli BL21中高效表达,获得高纯度的hK6融合蛋白。     

人胰岛素样生长因子在pET-DsbA载体中的克隆及表达

目的 通过重组技术,对胰岛素样生长因子IGF-Ⅰ基因进行缺失、突变以获得最有利于高水平表达的IGF-Ⅰ cDNA.构建原核表达载体,并进行表达,以获得能够高水平表达高活性产物的基因工程菌珠.方法 提取人肝脏组织总RNA,RT-PCR后琼脂糖电泳初步鉴定产物.将cDNA回收、补平后插入克隆质粒KS,酶切鉴定后,对IGF-Ⅰ基因进行序列分析.采用PCR法从克隆质粒中扩增IGF-Ⅰ片段,亚克隆至pET-DsbA原核表达载体,酶切鉴定,并进行序列测定.转化到大肠杆菌BL21(DE3)PLysS中,IPTG诱导表达,聚丙稀酰胺凝胶电泳、Western Blot分析目的蛋白.结果 成功构建原核表达载体pET-DsbA-IGF-Ⅰ,测序结果与预期序列完全一致,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS表达出IGF-Ⅰ融合蛋白.结论 IGF-Ⅰ融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3) PLysS中的表达,对进一步研究IGF-Ⅰ的功能及开发其生物制品具有重要意义.     

人蔗糖酶蛋白在大肠杆菌的诱导表达与纯化

目的构建人蔗糖酶(h SUC)基因原核表达载体,诱导表达获得融合蛋白。方法采用反转录PCR法扩增得到h SUC基因片段,并将其克隆到表达载体p ET-28a(+)中,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导在大肠杆菌中表达,采用Ni柱亲和层析纯化重组蛋白,对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果克隆得到1482 bp目的基因,酶切和测序证实h SUC基因片段成功插入到p ET-28a(+)表达载体。表达的融合蛋白质相对分子质量(Mr)为61 240,Western blot结果显示融合蛋白可以与h SUC抗体特异性结合。结论成功在大肠杆菌中表达和纯化h SUC融合蛋白。     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。     

人FOXP3 cDNA的克隆及在原核细胞中的表达

目的:克隆人FOXP3cDNA,构建其原核表达载体,在大肠杆菌中表达。方法:从新生儿脐带血获得FOXP3mRNA,用巢式RT-PCR技术扩增FOXP3cDNA,产物纯化后T-A克隆连接至pMD18-T载体,构建其原核表达载体pRSET-A-FOXP3,转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定。结果:获得FOXP3mRNA,并对其编码区cDNA序列进行扩增。PCR产物连接至原核表达载体pRSET,经DNA测序,证实与Gen-Bank中的人FOXP3编码序列一致。经SDS-PAGE及Western blot显示在相对分子质量(Mr)约为52000处出现融合表达条带,表达量约占菌体蛋白总量的20%。结论:成功地克隆人FOXP3cDNA,构建了其原核表达载体,并在大肠杆菌中得到有效表达。     

小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达

目的: 构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A 的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白.方法:以PMA 活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA 逆转录合成的cDNA为模板,PCR 法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T 载体和原核表达载体pGEX-4T-1 中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白. E3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶 鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出     

人TREM-1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的系统地研究TREM-1的生物学功能,克隆TREM-1的cDNA,构建原核表达载体后,使其在大肠杆菌中得到表达。方法用RT-PCR从临床患者外周血白细胞中扩增TREM-1 cDNA,将其克隆到克隆载体pGEM-3Z上。经酶切及PCR扩增鉴定、测序后,再克隆到原核表达载体pT7-PL上,转化大肠杆菌BL21(DE3 plys),以IPTG诱导大肠杆菌表达带有氨酸和人TREM-1蛋白组成的融合蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳初步鉴定,并对融合蛋白进行纯化。结果酶切电泳和DNA测序结果表明,成功地克隆了人TREM-1 eDNA;SDS-PAGE电泳结果显示相应分子质量37ku处有含人TREM-1融合蛋白的初步表达,证明了TREM-1原核表达的可行性。     

抗HIV-1 gp120单链抗体和白喉毒素融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 构建人源抗HIV-1单链抗体和白喉毒素融合基因的原核表达质粒,并诱导其在大肠杆菌中表达重组蛋白.方法通过PCR扩增,获得目前应用较多的DAB389基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot方法分析鉴定.结果酶切及DNA序列测定鉴定正确.SDS-PAGE和Western Blot分析证实,重组质粒可表达出相对分子质量为75 200的蛋白,与DT-hs120融合基因子量一致,其表达量约占菌体总蛋白的21%,表达形式主要为包涵体.结论 成功构建了DT-hS120表达载体,并获得了高效表达.     

组氨酸标签人β干扰素在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定

目的 在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白,并进行蛋白纯化和生物活性测定.方法 提取人Bel-7402细胞总DNA为模板,经PCR获得人β干扰素编码基因片段.将此基因插入表达载体pET-16b,重组克隆,经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和条件优化.表达产物经West...     

人LIGHT胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:构建人LIGHT胞外段基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:从人外周血单核细胞来源的未成熟树突状细胞中提取总RNA,通过RT-PCR得到LIGHT胞外段基因,并将其克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果:RT-PCR扩增出了大小为543 bp 的LIGHT胞外段基因,经测序证明序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的蛋白.结论:成功地克隆了人LIGHT胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达为进一步研究LIGHT的功能打下了基础.     

内皮型一氧化氮合酶运输诱导物NOSTRIN基因的克隆与表达

目的构成内皮型一氧化氮合酶运输介导物(endothelial nitric oxide synthase traffic inducer,NOSTRIN)基因的原核表达重组体,并进行初步表达.方法从人胎盘组织中提取总RNA,经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出NOSTRIN基因;将NOSTRIN基因克隆入pGEM-T载体中,经DNA测序确认后,构建原核表达重组体pRSET-NOS,在工程菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达.结果所获得的NOSTRIN基因测序正确,并表达重组蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量为58KD.结论构建的原核表达重组体pRSET-NOS能高效表达重组NOSTRIN蛋白.     

小鼠B7-DC胞外段原核表达载体的构建及表达

目的: 构建小鼠B7-DC胞外段基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21中诱导表达.方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(DC)中提取总RNA, 经RT-PCR扩增B7-DC胞外段, 并将其克隆至原核表达载体pET32a( )中, 构建重组表达质粒pET32a( )-B7-DCECD.重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达目的蛋白, 并用SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因, 经测序证实其序列正确.SDS-PAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41 000的B7-DC胞外段蛋白.结论: 成功地构建了小鼠B7-DC胞外段基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中进行表达, 为进一步研究B7-DC的功能奠定实验基础.     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。     

白细胞介素-24基因重组表达载体的构建及原核表达

目的：构建人白细胞介素-24(hIL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：用PCR从质粒TRAP-IL-24中扩增hIL-24 cDNA片段，并将该片段插入pGEX-KG原核表达载体中，实现插入基因的融合表达。用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GST-IL-24融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实，成功地构建了pGEX-KG-IL-24原核表达载体，并在大肠杆菌中获得稳定的表达，表达产物的相对分子质量(M1)同预期值相-致。GST-IL-24融合蛋白能够抑制THP-1细胞的生长。结论：成功地构建了重组表达载体pGEx-KG-IL-24，并在E．coli BL21中表达了具有生物学活性的GST-IL-24融合蛋白，为下-步研究人IL-24的功能奠定了基础。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a( )中,构建重组质粒pET28a( )-CIDE-3。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长为516bp的人CIDE-3基因片段。以构建的重组质粒pET28a( )-CIDE-3转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为23000的重组CIDE-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,表达量约占全菌蛋白的32%。结论:成功地构建了原核表达载体pET28a( )-CIDE-3,并表达出重组CIDE-3蛋白,为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础。     

铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核表达载体构建及其鉴定

目的 构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定.方法 采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、PCR扩增鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后及蛋白免疫印迹法分别测定其大小和特异性.结果 经鉴定证实原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了PE38KDEL与GST的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被PE的特异性抗体所识别.结论 PE38KDEL在大肠杆菌中获得了高效的融合表达,为下一步研究其功能奠定了基础.     

OPG与MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人骨保护素（OPG）成熟肽段编码区基因，并在大肠杆菌中表达。方法 采用RT－PCR法，扩增人OPG成熟肽段编码区cDNA，并克隆入原核表达载体pMAL-c2x中，转化BL21（DE3）PlysS大肠杆菌感受态细胞，经0.1mmol/L IPTG诱导后，收集菌体蛋白，进行SDS－PAGE及Western blot鉴定。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，以构建的原核表达载体pMAL-OPG转化菌株后，可表达人OPG和麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白，相对分子质量（M）为85000。表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的13％。Western blot表明，融合蛋白能与抗人OPG多克隆抗体特异性结合。结论 获得人OPG成熟肽全长cDNA，并在大肠杆菌中以OPC－MBP融合蛋白的形式表达。     

人可溶性DC-SIGN的原核表达及鉴定

目的构建可溶性DC-SIGN（sDC-SIGN）原核表达载体,获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。方法采用PCR方法,从含人DC-SIGNcDNA的重组质粒pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN胞外区基因片段,插入原核表达载体pET17b,构建重组表达载体pET17b-sDC-SIGN,经酶切图谱和测序鉴定,转入E.coliBL21（DE3）诱导表达蛋白,用抗人DC-SIGN抗体-Sepharose4B亲和层系纯化表达产物,以SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果从重组质粒pGM-DC-SIGN扩增获得1300bp目的基因片段,构建重组表达质粒pET17b-sDC-SIGN,其酶切图谱和序列与预期相符。纯化表达产物sDC-SIGN,鉴定其分子质量为38000,Westernbolt证明其可与抗人DC-SIGN抗体特异性结合。结论获得了能高效表达重组人sDC-SIGN的大肠杆菌菌株和不带任何标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的功能奠定了基础。     

轮状病毒VP7基因的克隆与表达

目的构建轮状病毒VP7的重组表达质粒，在大肠杆菌中对其进行表达。方法克隆编码轮状病毒VP7的基因，并在原核表达系统中表达了带有6xHis标签的融合蛋白。结果经双酶切鉴定和基因测序证明成功重组了轮状病毒VP7基因的pQE-30重组质粒；蛋白质PAGE电泳表明，获得了分子量约为48000Mr的蛋白质。结论本研究获得了重组的轮状病毒VP7蛋白。     

Ficolin-A的克隆、蛋白表达和抗体的制备与鉴定

目的: 克隆小鼠ficolin-A(mouse ficolin-A)基因, 构建在真核及原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白, 并制备其抗体, 以进一步用于研究小鼠ficolin-A的功能.方法: 用RT-PCR的方法从新生7 d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacer kit扩增ficolin-A cDNA片段, 并将该片段分别插入pVAX-1真核表达载体及pGEX-KG 原核表达载体中, 实现插入基因的融合, 在IPTG的诱导下在大肠杆菌中表达.用GST-Sepharose 4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化, 用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.制备ficolin-A的多克隆抗体并对其效价进行测定.结果: 成功地构建了pVAX-1-ficolin-A真核表达载体及pGEX-KG-ficolin-A原核表达载体, 并在大肠杆菌中获得高效的表达, 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致.并且成功制备了多克隆抗体.结论: 成功地构建了重组表达载体pVAX-1-ficolin-A及pGEX-KG-ficolin-A, 并在E.coli BL21中表达了ficolin-A蛋白, 为下一步研究小鼠ficolin-A的功能奠定了基础.