应用差异显示技术克隆脑脓肿早期表达上调的新基因

本研究以大鼠脑脓肿模型为基础，利用mRNA荧光差异显示技术，比较正常组、对照组和脑脓肿组脑组织中基因表达的差异，以寻找脑脓肿发病的早期相关基因。     

脑胶质瘤中全长新基因PKIβ的克隆与表达

目前世界上在不同组织或不同病理样本中获取差异表达基因的方法有很多种。在各种技术中诸如:差异显示技术,只适用于少量样本,同时跑电泳的工作相当辛苦,并受限于一次电泳样品数量,而     

小干扰RNA沉默RHBDF1基因抑制胶质瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的初步研究

目的 检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞内的表达,以及小干扰RNA沉默C6胶质瘤细胞内RHBDF1基因后是否诱导C6细胞凋亡和抑制细胞生长,为基因治疗胶质瘤寻找新的靶基因. 方法采用Western blot检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞(包括C6、U251和MGR2)的表达情况:用脂质体转染法分别将RHBDF1 siRNA或对照siRNA转染入C6细胞内,RT-PCR和Western blot方法检测siRNA转染后对C6细胞内RHBDF1基因和蛋白的影响;Tune1法检测RHBDF1基因沉默后对细胞凋亡的诱导情况,Ki-67免疫荧光染色观察RHBDF1基因沉默后对细胞生长抑制的影响.结果 与正常胶质细胞比较,胶质瘤细胞内RHBDF1基因存在着过度表达.siRNA转染入C6细胞后.对照siRNA组凋亡率为2.96%±1.25%,而RHBDF1siRNA1组和RHBDF1 siRNA2的凋亡率分别为36.35%±4.85%和33.58%±4.08%:对照siRNA组细胞增殖率为95.96%±3.25%,而RHBDF1 siRNA1组和RHBDF1 siRNA2组的细胞增殖率分别为24.57%±5.53%和25.68%±4.08%;组间细胞凋亡率和增殖率比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 RHBDF1基因在胶质瘤细胞内存在过度表达,沉默该基因后可以诱导细胞凋亡和抑制细胞生长,RHBDF1基因可能成为基因治疗胶质瘤的一个新的靶基因.     

脂肪酸类药物诱导分化治疗脑胶质瘤分子机制研究

包括苯乙酸、苯丁酸和丙戊酸在内的脂肪酸类药物对多种肿瘤细胞具有一定的诱导分化作用。在胶质瘤方面，它们不但可以抑制细胞增殖和诱导细胞肜态向良性方向改变，而且能使细胞内的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)、激活蛋白-1（AP-1)等基因表达量发生变化，从而调控细胞分化。本文对脂肪酸类药物的药理作用、疗效及作用机制进行介绍。     

RNA干扰介导的胶质瘤细胞IGF-1R基因下调诱导肿瘤细胞凋亡

目的应用RNA干扰(RNAi)技术介导胶质瘤C6细胞株胰岛素生长因子1受体(IGF1R)基因下调诱导C6细胞凋亡的研究。方法体外化学合成靶向IGF1R基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C6细胞,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组:同时使用绿色荧光素标记的小干扰RNA(FITCsiRNA)转染细胞,荧光显微镜下观察siRNA转染效率;RT-PCR法半定量检测siRNA对IGF1R基因表达的抑制作用;流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见细胞质内清晰的绿色荧光,脂质体OligofectamineTM2000的转染效率接近100%;化学合成的siRNA明显抑制IGF1RmRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF1RmRNA表达水平可下调约10%～80%,流式细胞术检测细胞凋亡率转染组为22.47%±3.15%,与阳性对照组2.3%±0.9%和阴性对照组1.14%±0.79%比较有明显提高,而阳性、阴性对照组相比无明显差异。结论化学合成的靶向IGF1R的siRNA可以明显下调IGF1R基因的表达,胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

人恶性胶质瘤细胞株U251三种克隆的分化特性和胶质瘤干细胞的初步鉴定

目的 观测U251细胞的克隆在形态和分化上的差异,鉴定含胶质瘤于细胞的克隆.方法 克隆形成实验观察U251细胞克隆的形态并分类,免疫细胞化学染色观测不同克隆GFAP和nestin的表达差异.分离低分化克隆,检测其自我更新能力、多向分化潜能及CD133表达情况.结果 U251细胞可形成紧密型、中间型和松散型三种克隆类型.紧密型克隆分化程度最低,此克隆在无血清培养基内形成神经干细胞样细胞球,具有自我更新能力、多向分化潜能,并表达CD133.结论 U251细胞的克隆在形态和分化程度上存在差异,紧密型克隆可能富含胶质瘤干细胞.     

靶向PTTG1基因的微小RNA转染后诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的研究

目的 构建表达靶向抑制垂体瘤转化基因1 (PTTG1)基因表达的RNA干扰载体microRNA,导入人脑胶质瘤细胞株U251中,研究靶向抑制PTTG1基因对U251细胞的凋亡诱导作用.方法 以PTG1为靶基因,根据pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体要求,设计针对PTIG1的microRNA序列,脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,采用荧光定量多聚酶链反应(PCR)以及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;膜联蛋白Ⅴ与碘化丙啶(annexinⅤ/PI)双色标记的流式细胞仪法检测microRNA诱导的细胞凋亡,碘化丙锭(PI)染色检测细胞周期阻滞.结果 实时荧光定量PCR以及Western blot检测显示,PTTG1基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;转染后,流式细胞仪检测分析显示,PTTG1基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞.结论 靶向PTTG1基因的重组microRNA干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-PTTG1介导的RNAi显著靶向抑制了PTTG1基因在人脑胶质瘤细胞中的表达,并明显地诱导了脑胶质瘤细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.     

人脑胶质瘤hMIBP1基因的克隆及序列分析

目的从人脑胶质瘤中克隆与肿瘤分化相关基因human c-myc内含子结合蛋白1 (hMIBPI),并测定其全序列。方法收集病理确诊的恶性胶质瘤样品,提取总RNA后用RT-PCR法分段克隆,所得片段经测序和组装后,获得全序列。结果提取的人脑总RNA质量好、纯度高,适合RT-PCR分析;克隆的基因命名为hMIBP1,长度为7 341bp,含一编码2 446个氨基酸的完整读码框,GenBank数据库登录号为DQ231041。结论从人胶质瘤标本中获得hMIBP1基因,为hMIBP1基因功能研究奠定基础。     

琼脂克隆法检测脑胶质瘤化疗耐药性的应用研究

目的化疗是脑胶质瘤术后综合治疗的主要措施,由于胶质瘤细胞存在原发或继发的化疗药物耐受性,致使化疗失败.本文试图寻求一种简便、敏感、准确的检测方法,确定肿瘤细胞的耐药程度,为合理制定化疗方案提供依据.方法采用软琼脂糖克隆法检测14例脑胶质瘤和U251MG细胞株对长春新碱的药物敏感性,通过VCRIC50估价肿瘤的耐药程度.同时采用以cRNA为内参照的RT-PCR方法同步检测胶质瘤MDR1基因mRNA含量,根据单位总RNA含MDR1 mRNA的分子数确定耐药程度.结果以U251MG细胞株为对照,确定脑胶质瘤的耐药程度,VCRIC50在1.73～28.80ng之间.MDR1 mRNA分数在0.80～14.59×105之间.两种方法相关性比较,r=0.77.琼脂糖克隆法其中度以上耐药的检出率为50%,而应用RT-PCR方法的检出率为33.50%.系统化疗后肿瘤细胞的MDR1 mRNA含量明显增高.结论琼脂克隆法可直接准确地检测脑胶质瘤的化疗耐药性,有较高的临床应用价值.     

胶质瘤细胞分化与恶性进展相关分子研究

目的 探讨胶质瘤细胞分化与恶性进展的分子变化,为进一步研究胶质瘤发生的分子病因创造条件.方法 在自建的人脑胶质瘤细胞诱导分化和神经节细胞胶质瘤恶性转化相关基因表达谱中,采用生物信息学聚类方法筛选胶质瘤细胞分化与恶性进展密切相关的新基因,进而分别用反向多点杂交和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术在分化程度不同的临床胶质瘤标本中加以验证.又将最感兴趣的基因用脂质体法转染胶质瘤细胞,观察其调控分化效应.结果 随胶质瘤细胞诱导分化而表达量增高的基因有ADP核糖转移酶样蛋白3(ADP-ribosyltransfrase like protein3, Adprt3)、NESH蛋白(new molecule containing SH3 domain)、维甲酸和干扰素诱导的细胞凋亡调控蛋白(genes associated with retinoid IFN induced mortality-19, GRIM-19)、半胱胺天冬酶-1(Caspase-1)和erbB-2转导蛋白-1(transducer-1 of erbB-2, TOB1)共5条;表达量下降的有p8蛋白(p8 protein)、Src样结合蛋白(Src-like adoptor protein, SLAP)、过氧化物酶体增殖受体结合蛋白(peroxisome proliferation-activated receptor binding protein, PPARBP)、尤文肉瘤断列点区-1(Ewing sarcoma breakpoint region-1, EWSR-1)、细胞呼吸因子-1(nuclear repiratory factor-1, NRF-1)、单核细胞超化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)共6条.随神经节细胞胶质瘤恶化表达量增高的有锌指蛋白157(Zinc finger protein 157)、胆碱转运因子-2(CTL2)、T54蛋白(T54 protein)、血清素(albumin)、肌球蛋白轻链(myosin light polypeptide)、血清蛋白P(serum amy loid P component)、肿瘤坏死因子受体调节因子-1(TNF receptor shedding regulator, ARTS-1)、嗜酸细胞源性神经毒素(eosinophil-derived neurotoxin, EDN)和剪切刺激因子(cleavage stimulation factor, CstF)共9条基因,下降的有胆碱激酶样蛋白(choline kinase-like protein)和DNA多聚酶p12亚基(DNA polymerase epsilon p12 subnit)共2条.结论 我们筛选到的与胶质瘤细胞分化或恶性进展密切相关的新基因共22条,尤其是ARTS-1、TOB1等基因可进一步用于基因转染、RNA干扰和基因敲除等作为调控胶质瘤细胞分化的关键基因进行研究.     

苯乙酸钠对脑胶质瘤细胞诱导分化的实验研究

目的 用苯乙酸钠（NaPA)在体外处理P-168人胶质瘤细胞，观察其诱导分化治疗效果。并对其作用机制进行初步探讨。方法 对不同浓度NaPA处理后的P-168细胞进行四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）分析及流式细胞仪检测，并观察肿瘤细胞的超微结构变化。结果 NaPA能明显抑制人胶质瘤细胞生长。呈现时间，浓度依赖性抑制作用，经流式细胞仪测定发现，NaPA处理的细胞S期为11.99%或13.17%，而未经处理的细胞S期为20.17%。电镜下显示NaPA处理后的胶质瘤细胞中线粒体，内质网，弹力丝丰富，而未经NaPA处理过的肿瘤细胞中有大量游离核糖体。结论 NaPA在体外不仅能够抑制人胶质瘤细胞的生长。而且对肿瘤细胞有明显的诱导分化作用。     

胶质瘤细胞c-fos基因表达水平对其增殖和凋亡的影响

目的原癌基因c-fos属快反应即刻早期应答基因，其编码蛋白是真核细胞内重要的转录因子．可诱导下游报道基因mRNA的转录和蛋白表达，参与细胞增殖和凋亡的调控，当其表达异常增加时可干扰细胞增殖和凋亡的动态平衡，诱导细胞转化和肿瘤形成。通过检测胶质瘤c-fos基因的表达水平观察c-fos基因与肿瘤恶性程度的关系以及对胶质瘤细胞增殖活性和凋亡程度的影响。方法用原位杂交、原位细胞凋亡检测和免疫组织化学染色方法观察73例不同级别人胶质瘤组织标本。结果73例胶质瘤均不同程度地表达c-fosmRNA和c-Fos蛋白（100％），这两种阳性肿瘤细胞密度均随肿瘤恶性程度的升高而相应增加，Ⅰ～Ⅱ级组、Ⅲ级组及Ⅳ级组间比较，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。73例胶质瘤标本的增殖细胞核抗原阳性肿瘤细胞和凋亡肿瘤细胞的检出率均为100％．增殖细胞核抗原阳性肿瘤细胞密度随肿瘤恶性程度的升高而相应增加，Ⅰ～Ⅱ级组低于Ⅲ级组，Ⅲ级组低于Ⅳ级组，3组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）；凋亡肿瘤细胞密度随肿瘤恶性程度的升高而相应减低，Ⅰ～Ⅱ级组高于Ⅲ级组，Ⅲ级组高于Ⅳ级组，3组间比较差异均有统计学意义（均P〈0．01）。直线相关分析证实，c-fos mRNA阳性肿瘤细胞密度、c-Fos蛋白阳性肿瘤细胞密度及增殖细胞核抗原阳性肿瘤细胞密度彼此间均呈显著性正相关（r=0．648～0．917，P〈0．001），这3种阳性肿瘤细胞的密度均与凋亡肿瘤细胞密度呈显著性负相关（r-=-0．727--0．775，P〈0．001）。结论c-fos基因表达水平对评价胶质瘤生物学行为有重要参考价值。胶质瘤细胞c-fos基因表达异常增加可能是促进肿瘤细胞增殖和抑制其凋亡的重要因素．并在胶质瘤发生及恶性进展过程中起重要作用。     

胶质瘤恶性进展相关基因PASG敲除后基因表达谱的改变

目的探索胶质瘤恶性进展相关PASG基因与胶质瘤发生发展的关系。方法选择性敲除PASG基因7.126kb基因组DNA序列(含该基因第10～12个外显子),并从形态学及全基因组基因表达水平观察基因敲除后的改变。结果PASG基因敲除鼠全基因组表现为低甲基化水平。海马区皮层的大锥体细胞存在细胞形态、排列层次和数量的异常。鼠脑全基因组差异基因表达谱分析显示:PASG基因敲除后,表达差异超过1.6倍的基因共有123条,其中61条表达下调,62条表达上调。结论PASG基因作为上游调控基因,通过改变基因组甲基化水平调控下游一系列细胞增殖分化相关基因表达。PASG基因表达异常导致下游相关基因的表观遗传修饰改变可能是胶质瘤发生发展的早期分子事件,值得进一步深入研究。     

胶质瘤c-myc基因表达水平与其细胞增殖和凋亡关系的研究

目的探讨胶质瘤细胞c-myc基因表达水平与肿瘤恶性程度、细胞增殖活性以及凋亡程度的关系。方法选择67例脑胶质瘤患者,其中Ⅰ～Ⅱ级者24例,Ⅲ级22例,Ⅳ级21例。应用原位杂交、原位细胞凋亡检测(TUNEL法)和免疫组织化学染色方法对其标本进行观察。结果67例患者中57例(85.1%)表达c-mycmRNA,56例(83.6%)表达c-Myc蛋白,两者表达水平呈正相关(rs=0.999,P<0.01),并均显示表达水平Ⅰ～Ⅱ级<Ⅲ级<Ⅳ级者(P<0.05或P<0.01);肿瘤细胞增殖活性和凋亡程度之间呈负相关(r=?0.775,P<0.01)。肿瘤细胞增殖活性随着肿瘤细胞c-Myc蛋白表达水平的升高而相应增强,而肿瘤细胞的凋亡则相应减少,c-Myc蛋白表达强阳性组与阳性组间,以及此两组与弱阳性组及阴性组之间比较,肿瘤细胞增殖活性和凋亡程度的差异均有显著性意义(均P<0.01)。结论c-myc基因表达水平对评价脑胶质瘤生物学行为具有临床参考价值。胶质瘤细胞c-myc基因表达异常增加可能会促进其细胞增殖和抑制其凋亡,并在胶质瘤的发生及恶性进展过程中起重要作用。     

神经胶质瘤E-cd、MMP-2和CD44v6的表达及临床意义

目的 探讨钙粘素(E-cadherin,E-cd)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)和粘附分子(CD44v6)在脑神经胶质瘤中的表达及临床意义。方法 采用免疫组织化学方法对50例神经胶质瘤患者和9例对照者脑组织中E-cd、MMP-2和CD44v6蛋白表达进行检测。结果 (1)对照组脑组织E-cd的阳性表达率为100％;神经胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级和Ⅲ～Ⅳ级组阳性表达率分别为40％(10/25)和24％(6/25),两组差异无显著性意义(P>0.05);对照组与神经胶质瘤组之间差异有显著性意义(P<0.05)。(2)对照组MMP-2阳性表达率为11％;在经胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级组为32％(8/25),Ⅲ～Ⅳ级组为64％(16/25),两组比较差异有显著性意义(P<0.05)。对照组与神经胶质瘤组相比,MMP-2的表达差异亦有显著性意义(P<0.05)。(3)CD44v6在对照组及神经胶质瘤组均无表达。结论 E-cd和MMP-2在神经胶质瘤的牛物学行为中起重要作用,且可能与其侵袭性有关,而CD44v6则与神经胶质瘤的生物学行为无关。     

神经干细胞分化过程中c-myc内含子结合蛋白1与c-myc基因表达研究

目的研究神经干细胞分化为胶质细胞过程中c-myc内含子结合蛋白1(MIBP1)基因与c-myc基因的表达变化。方法从孕16d胚胎鼠脑组织中分离神经干细胞,以专用培养基IMDM(含有B27添加剂,重组人上皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子-2、L-谷氨酸和黄体酮)进行培养。应用胶原及含10%胎牛血清、抗生素的分化培养基,诱导细胞向胶质细胞及神经元方向分化,第1天细胞贴壁启动分化,第7天明显分化,第14天进入终末分化。经过振荡处理,进一步得到纯化星形胶质细胞,采用胶质纤维酸性蛋白免疫组化方法鉴定细胞分化。分别提取分化前及分化后第1、7和14天神经干细胞的RNA,应用逆转录-多聚酶链反应方法检测神经干细胞中MIBP1与c-myc基因的表达,以β-actin作为内参照物,应用图像分析仪对电泳条带进行定量分析,观察两基因在神经干细胞分化中的作用。结果在神经干细胞分化过程中,MIBP1基因表达逐渐增强,其中未分化神经干细胞为(63.53±11.97)%,培养第1、7和14天表达率分别为(70.04±16.10)%、(79.09±15.40)%和(99.65±0.54)%。而c-myc基因表达呈逐渐降低,未分化神经干细胞为(99.76±7.62)%;培养第1、7和14天表达率分别为(75.20±12.33)%、(45.65±10.11)%和(33.31±4.34)%。两基因分别与相应未分化组比较,差异具有极显著性意义(均P<0.001)。星形胶质细胞纯化前后MIBP1基因表达量无明显变化。结论在神经干细胞分化为胶质细胞的过程中MIBP1基因表达逐渐增强,同时c-myc基因表达受到抑制。提示MIBP1基因与胶质细胞的分化过程相关,可能通过抑制c-myc基因的表达而实现调控作用。     

人脑胶质瘤尿激酶型纤溶酶原激活因子基因表达及意义

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活因子（ｕＰＡ）基因在人脑胶质瘤中的表达及临床意义。方法 采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分子杂交和免疫组方法检测４３例人脑胶质瘤和５例正常脑组织ｕＰＡ ｍＲＮＡ的蛋白表达,并与临床床生物学参数进行综合分析。结果 上述组织或细胞均可表达２．５Ｋｂ的ｕＰＡ ｍＲＮＡ转录物,高级另胶质瘤较低级别和正常脑组织ｕＰＡ ｍＲＮＡ表达水平明显增高（Ｐ〈０．０１）,低级别胶质瘤与正常脑组织的