^99mTc标记抗癌胚抗原单抗C50片段Fab‘及其生物分布研究

目的：研究克服＾９９ｍＴｃ示记抗癌胚抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ,ＣＥＡ）单抗体内生物半衰期长、血液廓清速度慢、晚时相放射性信号弱等缺点的方法,用直接标记法进行了＾９９ｍＴｃ标记抗ＣＥＡ抗体Ｃ５０片断Ｆａｂ’的研究。方法：经胃蛋白酶切得的Ｃ５０片段Ｆ（ａｂ’）２用适量的２－巯基乙醇还原,Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０柱分离获得纯度大于９０％的Ｆａｂ’片断。取０．６～１．０ｍｇ纯化的片段Ｆａｂ’（体积〈１．０ｍｌ）,加入０．４～０．８ｍｇ葡庚糖酸钠及新鲜配制的ＳｎＣｌ２溶液５～１０μｇ,然后加入新鲜淋洗的Ｎａ＾９９ｍＴｃＯ４淋洗液,反应１０～１５ｍｉｎ。用高压液相色谱监测放化纯度和抗体纯度。荷ＣＬ－１８７（结肠癌）裸鼠静脉注射＾９９ｍＴｃ－Ｆａｂ’,观察标记抗体片段在不同时相的体内分布。结果：     

^99mTc标记抗癌胚抗原单抗用于卵巢肿瘤导向诊断的研究

应用＾９９ｍＴｃ标记癌胚抗原单抗对１２例１６例次放射免疫显像,结果阳性检出率１００％,提示放射免疫显像对卵巢肿瘤术前定性有一定意义。     

99mTc标记卵巢癌单抗片段F(ab'''')2 放射免疫显像的实验研究

目的：为了改进放射免疫显像（ＲＩＩ），进行９９ｍＴｃ标记卵巢癌单克隆抗体ＣＯＣ１８３Ｂ２Ｆ（ａｂ’）２ＲＩＩ的研究。方法：采用无花果酶制备单抗ＣＯＣ１８３Ｂ２片段Ｆ（ａｂ’）２，改进ＳｎＣｌ２法进行９９ｍＴｃ标记片段Ｆ（ａｂ’）２及正常鼠ＩｇＧ（ＮＭＩｇＧ）；９９ｍＴｃＣＯＣ１８３Ｂ２或９９ｍＴｃＮＭＩｇＧ标记物分别经腹腔注入荷人卵巢癌裸鼠体内，１８ｈ进行ＲＩ。显像后测定并计算肿瘤与非肿瘤组织放射性活度比值（Ｔ／ＮＴ）。结果：（１）无花果酶可制备ＣＯＣ１８３Ｂ２单抗片段Ｆ（ａｂ’）２；（２）改进ＳｎＣｌ２法进行９９ｍＴｃ标记Ｆ（ａｂ’）２，标记率达９０％以上；（３）１８ｈ后ＲＩ，可见９９ｍＴｃＣＯＣ１８３Ｂ２组荷瘤裸鼠较９９ｍＴｃＮＭＩｇＧ对照组移植瘤图像清晰，且Ｔ／ＮＴ值明显高。结论：应用片段Ｆ（ａｂ’）２可改善ＲＩＩ。     

99mTc螯合两种抗肝癌单链抗体的标记条件

目的:研究两种全新的抗肝癌基因工程单链抗体hdsFv和scFv-PE38的99mTc标记方法及适宜条件以应用于放免显像. 方法:选用二乙烯三胺五乙酸环酐(cDTPAa)作为螯合剂,沿用比较成熟的标记方法,以标记率和标记物免疫活性为指标分别测定两种单链抗体与99mTc偶联的适宜条件,并测定标记物的比活度和体外稳定性. 结果:其他理化条件不变,cDTPA与hdsFv的浓度比为20: 1～40: 1,99mTc活度37～148 MBq时,hdsFv标记率为62%～84%;cDTPA对scFv-PE38的浓度比为20: 1～100: 1,99mTc活度为37～148 MBq时,scFv-PE38标记率为68%～89%;且两种标记单链抗体的免疫活性均在60%以上. 结论:通过对这两种全新的单链抗体的标记和检测,得到了尽可能保持其原有免疫活性的标记条件,为通过放免显像在活体内检验单链抗体亲瘤性奠定了基础.     

99mTc标记葡萄糖99mTc-EC-DG在正常小鼠体内的分布研究

目的研究^99mTc标记葡萄糖99mTc-EC-DG在正常小鼠体内的生物学分布规律,用于临床肿瘤显像作基础研究.方法正常昆明小鼠48只,分8组,每组6只,实验前小鼠禁食8 h以上.尾静脉注射^99mTc-EC-DG 3.7 MBq (100 μCi) 后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h放血处死,取心、肝、脾、肺、脑、肾、肌肉、骨、小肠、胃和血液等组织或器官,称重并测量其放射性,计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g).结果^ 99mTc-EC-DG主要经肾脏代谢,脑不吸收^99mTc-EC-DG,肌肉组织摄取亦较少.各组织、器官的百分剂量率在1 h内除血液下降稍慢外,其余均有明显下降.结论^ 99mTc-EC-DG标记方便,体内外稳定性好,小鼠体内生物学分布表明其可能是一种较好的葡萄糖代谢显像剂.     

^99mTc标记卵巢癌单抗的实验研究

用＾９９ｍＴｃ标记卵巢癌单抗，对标记方法，纯化手段，还原后抗体存时间与标记率关系，标记物免疫活性以及用该标记物对荷瘤裸鼠放免显象进行探讨，提示＾９９ｍＴｃ标记卵巢癌单抗的可行性。     

99mTc标记结肠癌单克隆抗体片段CEA．Fab的研制方法

目的　探讨一种高效便捷的99mTc CEA Fab标记化合物的研制方法。方法　采用 2 亚氨噻酚盐酸盐修饰CEA Fab ,通过GH转换 ,将99mTc标记在结肠癌单克隆抗体CEA Fab上。结果　已修饰抗体的标记率为 93.5 %,99mTc胶体含量为 2 .5 %,标记化合物有良好的稳定性和免疫活性。结论　成功地建立了结肠癌单抗片断CEA Fab的99mTc标记方法 ,该技术可以应用于其他抗体片段标记领域。     

^99mTc标记单克隆抗体及片段对荷人结肠癌裸鼠的放射免疫显像研究

目的 探讨单克隆抗体ND1对大肠癌的诊断价值。方法 利用放射免疫法对荷人结肠癌裸鼠模型进行显像研究。结果 ^99mTc直接标记抗人结肠癌单克隆抗体ND1及F（ab)2片段,标记率为94%和87%,标记后抗体的免疫活性良好。注入荷人结肠癌裸鼠体内16小时后。肿瘤组织中出现较高的特异性浓聚,肿瘤轮廓显示清晰,F（ab)2片段的放射本底消除快,图像质量优于ND1。体内分布显示：ND1及F（ab)2片段可与移植瘤特异性结合。肿瘤与正常器官组织的放射比值（T/NT）、F（ab)2片段显高于ND1,ND1在肿瘤,血液及器官组织均有较高的放射性摄取,不利于放射性本底的消除。结论 ^99mTc-F(ab)2,对大肠癌的放射免疫显像图像清晰,优于^99mTc-ND1,为其临床应用提供了实验依据。     

99mTc-PDGFR-β AODN的制备及其生物分布

目的:寻求一种理想的99mTc标记大鼠血小板衍化生长因子受体-β(PDGFR-β)反义脱氧寡核苷酸(AODN)的方法,并观察标记产物的生物学分布以探讨其用于防治冠状动脉再狭窄的可能性. 方法: 先使长度为18个碱基的单链PDGFR-β AODN与双功能螯合剂NHS-MAG3耦联,然后进行99mTc标记,测定不同条件下标记率,分析确定最佳标记条件.常规测定放化纯度和比活度,并对标记物进行稳定性和正常小鼠体内分布实验. 结果: ①最佳标记条件下平均标记率达70%(最高为73.2%),经P4层析柱纯化后放化纯度>95%,比活度7.4～11.1MBq(200～300μCi)/ μg;② 99mTc-MAG3-AODN在室温下生理盐水中及37℃下新鲜人血清中稳定性良好,与血清蛋白结合率为6%～8%;③ 99mTc-MAG3-AODN在正常小鼠体内稳定性良好,在肾、肝中摄取较高. 结论: 以NHS-MAG3为鳌合剂标记得到的99mTc-MAG3-AODN具有良好的稳定性,为下一步进行细胞和动物实验提供了基础.     

新型心肌灌注显像剂^99mTc—Q3的标记方法学研究

为获得高质量的心肌灌注显像剂,作者进行了９９ｍＴｃ－Ｎ,Ｎ'－亚乙基－二（乙酰丙 酮亚胺）二「三（３－甲氧基－１－丙基）膦」（＾９９ｍＴｃ－Ｑ３）的制备方法学研究。采用多元正交试验法进行了制备＾９９ｍＴｃ－Ｑ３最佳配方的筛选;用氯化亚锡化学还原法制备＾９９ｍＴｃ－Ｑ３;用柱沉析法进行＾９９ｍＴｃ－Ｑ３的分离和纯化、质量控制及体外稳定性试验;完成了无菌、热原、安全试验及家兔显像验证。制备９９ｍＴｃ－Ｑ     

以抗体竞争结合抗原测定单抗亲和力常数的研究

目的在Friguent方法基础上建立更加稳定可靠的基于抗原/抗体竞争结合原理的单抗亲和力常数(Kd)检测方法。方法以抗体对抗原进行竞争结合,通过双抗体夹心法检测在一定抗体浓度竞争下抗原的结合率计算Kd值。结果用改良方法在两次不同条件下检测抗IL-8单抗的Kd值分别为:2.61×10-12mol/L和2.39×10-12mol/L,而使用Friguent方法在两次不同条件检测抗IL-8单抗的Kd值分别为:5.57×10-10mol/L和1.41×10-10mol/L。结论相对于Friguent方法,本研究计算出的Kd值更能反映抗原/抗体结合的真实情况,而且在不同实验条件下检测结果重现性强。     

应用平阳霉素与单克隆抗体Fab片段偶联物抑制肿癌生长与肿瘤肝转移

目的 研制一种具有抑制肝癌生长和瘤肝转移作用的单克隆抗体Fab 片段与平阳霉素（PYM）偶联物。方法 以胃蛋白酶酶解结合二巯基苏糖醇（DTT）还原法制备单抗Fab片段。以葡聚糖T－40（ 拒T－40)为中介体制备Fab片段和PYM偶联物Fab-PYM;用间接ELISA法,2,3,5－氯化三苯基四氮唑（TTC）抑菌效价检测法,克隆形成法及动物移植性肿瘤模型测定F -PYM偶联物在体外的生物学活性与在小鼠体内的抗肿瘤作用。结果： Fab-PYM与BEL－7402,肝癌22（H22）及HP－29细胞呈免疫学阳性反应,但与KB细胞无反应;偶联物中PYM的抑菌活性为游离PYM的15％,Fab-PYM对体外培养的BEL－7402细胞,HT－29细胞和KB细胞的50％抑制浓度（IC50）分别为0．02,0．08及0．50umol/L;静脉注射10mg/kg Fab-PYM偶联物和PYM皮下接种对小鼠肝癌22的抑瘤率分别为86％和62％,腹腔注射,10mg/kg Fab-PYM偶联物和PYM对小鼠脾内接种的结肠癌26肝转移的抑制率分别为91％和62％,结论 Fab-PYM偶联物具有比游离平阳霉素更强的抑制肝癌生长与肿瘤肝转移作用。     

人源性噬菌体抗体库中抗CEA单抗的筛选与初步鉴定

目的：探讨利用噬菌体抗体库技术制备抗CEA的人源性单抗的可行性。方法：以纯化的CEA为抗原，应用噬菌体表面呈现技术，通过3轮亲和 富集及2轮淋巴细胞吸附实验，从已构建好的人源性噬菌体抗体库中筛选出抗CEA的人源性单抗，随机挑出10株单克隆在大肠杆菌中进行表达，并采用ELISA 、SDS－PAGE及基因测序进行初步鉴定。结果：ELISA显示有9株单抗具有与CEA特异性结合的能力，挑选其中2株具有较高亲和力的单克隆，经12％SDS－PAGE蛋白电泳，在分子量约为25kd处可见一新增蛋白带，与基因编码蛋白的理论计算相符合，基因测序结果与Gene Bank等相比对具有较高的序列同源性。结论：噬菌体抗体库技术是研制人源性单抗的有效途径。     

131I标记抗CEA单克隆抗体C50对荷人乳腺癌裸鼠局部放射免疫治疗效果

目的：观察放射免疫导向药物局部用药对荷人乳腺癌裸鼠的治疗效果。方法：将抗CEA单抗C50与¹³¹I偶联,制成放射免疫导向药物¹³¹I-C50。将已乳腺原位接种人乳腺癌MCF-7细胞且肿瘤直径已达0.5 cm的裸鼠16只随机分为实验Ⅰ组、实验Ⅱ组、实验对照组（Ⅲ组）及空白对照组（Ⅳ组）,每组4只。对荷人乳腺癌裸鼠进行肿瘤局部注射,Ⅰ组给予¹³¹I-C5018.5 MBq,Ⅱ组给予¹³¹Ⅰ-C50 3.7 MBq,Ⅲ组给予 ¹³¹I-mIgG18.5 MBq,Ⅳ组给予C50 0.75 μg,给药当日后6周内每周测定肿瘤大小,计算抑瘤率。结果:Ⅰ组和Ⅱ组与Ⅲ组之间的肿瘤体积、抑瘤率、重量比较差异有显著性（P<0.01）,Ⅰ组与Ⅱ组上述指标比较差异亦具有显著性（P<0.05）,Ⅲ组与Ⅳ组比较差异无显著性(P>0.05)。结论:放射性核素 ¹³¹I标记抗CEA单抗C50局部治疗可抑制荷人乳腺癌裸鼠肿瘤的生长。¹³¹I-C50具有潜在的临床应用价值。     

单克隆抗体Mab03.2C1-C2靶抗原性质的初步研究

目的分析抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单抗Mab03.2C1-C2靶抗原的性质,探讨该抗原用于实验室检测的可行性.方法制备单克隆抗体,通过SDS-PAGE及Western Blotting法分析该单抗所识别的抗原的分子量.体外诱导形成不同长度的芽管,分析其表面靶抗原的形成情况.不同的生化方法处理芽管,采用间接免疫荧光方法,对单抗靶抗原表位性质进行分析.取口腔念珠菌病患者的真菌涂片标本,用IIF方法观察体外诱导培养之芽管与体内白念芽管表面抗原分布异同.结果体外诱导30 min后白念珠菌芽管表面方可检测到靶抗原.体内白念菌丝与体外诱导菌丝表面靶抗原分布不同.靶抗原表位可能位于N-糖链上.结论Mab03.2C1-C2靶抗原为白念菌丝形成过程中生成的新成分,可能参与白念致病过程.靶抗原为糖蛋白,抗原性显著,对临床应用于系统性白念珠菌感染的检测有意义.     

抗癌胚抗原单抗与生物素及链霉亲和素偶联物的制备及性能鉴定

目的　 研究抗癌胚抗原(CEA)单抗与生物素及链霉亲和素(streptavidin, SA)偶联物的制备方法。方法　 将CEA单抗按抗体与生物素活化酯物质的量之比为1:15～1:50进行生物素化。抗CEA单抗与SA的偶联采用3-（2-吡啶二巯基丙酸）-N-琥珀酰亚胺酯（SPDP）化学偶联法制备。抗CEA单抗偶联物的生物活性及免疫活性分别采用间接ELISA方法和放射免疫分析法进行测定。 结果　生物素化单抗每分子抗体中约偶联3分子生物素,具有良好的SA结合活性,经SDS-PAGE电泳证实为单一蛋白条带,仍保留95%的免疫活性。SA每分子中含有1～2个巯基,而抗CEA单抗每分子中含有2～3个3-（2-吡啶二巯基丙酸）-N-琥珀酰亚胺酯间接ELISA方法证实偶联物具有良好的生物素结合活性, SDS-PAGE电泳显示单抗-SA偶联物相对分子质量为210 000左右,仍保留着原单抗活性的70%左右。结论　所制备的两类抗CEA单抗偶联物基本保持完整的特异性结合肿瘤CEA的性质,可为进一步的预定位显像和治疗应用提供可靠的靶向载体。     

HCV核心抗原C33肽单克隆抗体的研制与初步鉴定

用ＨＣＶ核心抗原（Ｃ３３肽）与鼠血清白蛋白交联后免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，用杂交瘤技术获得有实用价值的二株ＭｃＡｂ。此二株ＭｃＡｂ除与免疫抗原有较强的抗原－抗体反应外，与ＨＣＶ核心抗原ＣＰ１０也有很好的反应；但与ＨＣＶＮＳ３、ＶＳ５及核心区ＣＰ９抗原无反应性。在竞争ＥＬＩＳＡ中对抗ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性血清有较好的抑制作用。     

人鼠嵌合型抗IL-2R单克隆抗体诱导肾移植受者sHLA-G5的表达上调

目的 探讨可溶性人类白细胞抗原G5(sHLA-G5)的表达上调是否为肾移植受者应用抗白细胞介素2受体(IL-2R)单克隆抗体的一个新的作用机制.方法 选取2006年1月至2007年12月解放军第三○九医院全军器官移植中心施行初次肾移植受者215例,根据是否使用抗IL-2R单克隆抗体分为:抗体使用组141例,抗体未使用组74例.健康对照组69例.采集外周血用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测sHLA-G5表达含量,并应用蛋白印迹方法和实时定量聚合酶链反应(Realtime PCR)进行验证.结果 移植术前,抗体使用组抗体使用后sHLA-G5的表达[(56±30)μg/L]高于抗体使用前[(34±20)μg/L],也高于健康对照组[(35±17)μg/L]和抗体未使用组[(36±19)μg/L,均P＜0.05].移植术后1 d、4 d、1周、2周,抗体使用组sHLA-G5表达随时间呈现上升趋势;而抗体未使用组sHLA-G5的表达术前术后波动很小,但术后各时间点抗体使用组sHLA-G5的表达均明显高于抗体未使用组[(95±35)μg/L比(54±16)μg/L;(131±24)μg/L比(75±22)μg/L;(167±44)μg/L比(62±17)μg/L;(172±35)μg/L比(45±16)μg/L,均P＜0.01].蛋白印迹法和PCR结果与ELISA法结果相一致.结论 肾移植受者早期应用抗IL-2R单克隆抗体能够诱导sHLA-G5的表达上调,这种调节利于移植物存活,降低排斥反应发生的可能性.

Abstract：

Objective To find whether the up-regulation of soluble human lecocyte antigen-G5 (sHLA-G5) levels is a new function mechanism of anti-interleukin-2 receptors (anti-IL-2R) monoclonal antibody treatment in kidney transplantation. Methods A total of 215 recipients at our centre from January 2006 to December 2007 were divided into antibody use group ( n = 141 ) and antibody non-use group ( n =74) and another healthy group (n =69). The sHLA-G5 level in peripheral blood was detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). And the expression of HLA-G5 was confirmed by Western blot and Real-time polymerase chain reaction (PCR). Results sHLA-G5 levels was (56 ± 30)μg/L in using antiIL-2 receptor monoclonal antibody before transplantation, It was higher than that before use antibody [(34 ±20) μg/L], also higher than healthy group [(35 ± 17) μg/L] and antibody non-use group [(36 ± 19)μg/L, P ＜0. 05, respectively]. At Day 1, Day 4, Week 1, Week 2 post-transplantation, the level of sHLA-G5 of recipients with antibody use was significantly higher than that of those with antibody non-use. The values were as follows: (95 ±35) μg/L vs (54 ± 16) μg/L , (131 ±24) μg/L vs (75 ±22) μg/L ,(167±44) μg/L vs (62 ± 17) μg/L, (172 ±35) μg/L vs (45 ±16) μg/L(all P＜0.01). And the results of Western blot and RT-PCR corresponded to those of ELISA. Conclusion The preoperative use of first dose of anti-IL-2R monoclonal antibodies results in the up-regulated level of sHLA-G5. Thus it is beneficial for protecting the kidney survival and reducing the risks of acute rejection.     

云克治疗类风湿性关节炎30例临床分析

目的　探讨联合用药 (瑞力芬、甲氨喋呤、柳氮磺胺吡啶 )加云克 (99锝—亚甲基二磷酸盐 ,99mTc MDP)治疗类风湿性关节炎 (RA)的临床疗效。方法　对 6 0例活动性RA患者随机分为 2组 ,每组各 30例 ,治疗组联合用药加云克 ,对照组仅联合用药治疗。分别观察起效时间、临床疗效 ,并进行统计学处理。结果　治疗组平均起效时间为 (7± 3)d ,与对照组的 (9± 4 )d比较 ,2组差异有显著意义 (P<0 .0 5 ) ,治疗组各项观察指标在 2周时较对照组缓解改善明显 (P <0 .0 5 ) ,但在 4周及 12周时 2组差异无显著意义 (P >0 .0 5 ) ,治疗组近期疗效及中、远期疗效均优于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　云克为一安全有效治疗RA的联合配伍用药。     

一种可溶性单抗ScFv片段的表达及鉴定

目的　利用E .coliHB2 15 1表达结肠癌单抗MC3的单链可变区片段 (Singlechainvariablefragment,ScFv) ,纯化并鉴定其抗原结合活性 ,为结肠癌体内诊断和治疗性研究提供靶向载体分子。方法　利用呈现ScFv抗体的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2 15 1进行可溶性抗体表达 ,经点印迹和Western印迹检测可溶性单抗ScFv的表达水平 ,经ELISA检测可溶性ScFv的抗原结合活性。用双脱氧法对组成ScFvDNA的VH和VLDNA进行序列测定。结果　可溶性MC3ScFv获得了成功表达 ,表达产物主要位于周质腔中 ,其分子量约为 3 2× 10 3。来自所获得的 3个克隆周质提取物均能抑制单抗与高水平表达MC3结合抗原的AGS细胞结合 ,抑制率分别为 41.19%、3 6.89%、3 3 .77%。对ScFv的VH和VLDNA的测序结果表明所获抗体的可变区基因属IgG1亚族 ,κ型。结论　利用大肠杆菌HB2 15 1成功表达了具有抗原结合活性的MC3ScFv ,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。