PCR—SSCR：一种检测突变的方法

聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分析是建立在ＰＣＲ技术基础上的用于检测突变的简便、灵敏的方法。本综述了这项技术的原理、方法及最新进展，并与现在广泛使用的其它检测基因突变的方法进行了比较。     

用PCR—SSCP方法分析白纹伊蚊线粒体DNA突变

应用PCR—SSCP(Polymerase Chain Reaction Single Strand Conformational Polymorphism，即聚合酶链反应产物单链构象多态性)分析技术，对湖南省的白纹伊蚊线粒体DNA进行分析。由于PCR—SSCP受DNA的结构(碱基组成和排列顺序)、胶的成分和电泳条件等诸多因素的影响，在具体操作时要得到清晰一致的结果，需要对各种条件进行控制。本文对影响PCR—SSCP实验室操作的因素进行了分析。并结合作者的经验给出了较长(350～400bp)DNA片段进行SSCP分析的操作条件。以期对该方法的选用提供参考。     

PCR/SSCP技术检测蜱体内斑点热群立克次体

斑点热群立克次体 (SFG立克次体 )是一组经蜱叮咬而传播的专性细胞内寄生菌 ,野生动物参与循环 ,在野生动物、节肢动物与 SFG立克次体三者的生态循环中 ,蜱既是重要的传播媒介 ,又是该立克次体的保菌宿主 ,所以目前立克次体的分离鉴定 ,主要是从蜱中分离出毒株。整个方法及过程     

应用PCR-SSCP检测耐异烟肼结核分支杆菌Kat G基因突变

结核分支杆菌对抗结核药物产生耐受性，已成为全球结核防治工作面临的一个严重问题［１，２］。传统的药敏试验需１～２个月，难以满足临床诊治的需要。近年来发展的ＢＡＣＴＥＣ法测定耐药性也需要３～４周，仍为生长依赖性，且需昂贵仪器设备，因而限制其推广应用。因此对结核分支杆菌耐药机制深入了解，并依此建立准确的药敏检测新方法已成为结核病防治工作的一项重要而紧迫的课题。异烟肼（ＩＮＨ）是一线抗结核药物，最近的研究结果表明，结核分支杆菌耐ＩＮＨ的产生与过氧化氢一过氧化物酶编码基因（Ｋａｔ Ｇ）改变有关。聚合酶链反…     

PCR和毛细管电泳技术检测沙门氏菌等5种病原菌的方法研究

目的采用多重PCR技术检测结合毛细管电泳成像技术建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的方法。方法根据沙门氏菌hilA基因、志贺氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌TDH基因、金黄色葡萄球菌的pSa-442 Sau3AI fragment基因及大肠杆菌O157的rfbE基因设计异性特PCR引物,被检样品经4 h振荡培养后金属浴裂解制备DNA模板,使用全自动毛细管电泳核酸检测系统分析PCR扩增产物。结果在580 bp、423bp、257 bp、245 bp和194 bp处分别出现预期的特异性DNA条带,且无非特异扩增条带出现。敏感性试验显示在模拟标本中的检测灵敏度,沙门氏菌为101-2cfu/ml、志贺氏菌为101cfu/ml、副溶血性弧菌为102cfu/ml、金黄色葡萄球菌为102cfu/ml、大肠杆菌O157为101cfu/ml。结论该方法操作方便、特异性和灵敏度高、分辨率高,可同时完成5种病原菌的检测,在公共卫生突发事件中具有实用价值。     

建立一种HBV突变检测的蝎子实时荧光PCR新方法

目的为HBV突变检测建立一种有效、快速、简捷的蝎子实时荧光PCR新方法。方法同时用蝎子实时荧光PCR新方法和Sanger测序法对比:对157例HBV患者的血清的DNA进行HBV基因rtN236T突变检测,统计其符合率;通过对混有不同比例的HBV基因rtN236T突变核酸的样本进行对照检测来比较两者的灵敏度。结果在157例HBV患者的血清样本中,蝎子实时荧光PCR新方法检测到rtN236T突变的有69例,而Sanger测序法检测的有68例,其符合率为98.6%;蝎子实时荧光PCR新方法能检测出混有5%突变的样本,其灵敏度达5%,比Sanger测序法高。结论蝎子实时荧光PCR新方法能有效检测到HBV突变,且比Sanger测序法更为简单、快速、灵敏度高,适合临床应用。     

风疹病毒气溶胶的逆转录－半套式PCR检测

将已知浓度的风疹病毒液通过ＴＫ发生器进行气溶胶发生于气溶胶转鼓中，搅匀后用ＡＧＩ－１０和Ｃａｓｅｌｌａ采样器进行气溶胶采样，采样样品以不同浓度稀释后分别进行ＲＴ－ＳＮ－ＰＣＲ和细胞培养。敏感性试验结果表明１００ＴＣＩＤ（５０）的ＲＶ病毒仍可被ＲＴ－ＳＮ－ＰＣＲ检测到，扩增片段为２９３ｈＰ，经ＨｉｎｃⅡ酶切成１２１和１７２ｈＰ的酶切片段与理论设计吻合。相应的Ｖｅｒｏ细胞培养结果均为阴性。通过气溶胶耐喷和耐压试验证明ＲＶ在空气采样过程中因高压冲击衰亡。ＰＣＲ检测微生物核酸，可不过多地考虑其生物衰亡，只要靶基因存在即有检测的可能性。     

PCR-SSCP检测白血病患者C/EBPζ基因突变方法学建立

目的建立一种快速、批量筛查白血病患者骨髓C/EBPζ基因外显子突变的多聚酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析方法。方法用Bio-Rad iCycler梯度PCR仪对25μL PCR反应体系中的Mg++、Taq酶等浓度及反应条件进行优化,并用2%琼脂糖电泳检验产物质量。在此基础上,再对中性聚丙烯酰胺凝胶浓度、上样缓冲液种类、上样量、上样次数及相隔时间、PCR产物稀释倍数、电压、电泳温度等因素进行探讨。同时比较80个健康体检者外周血与20个胸外科良恶性肿瘤患者肋骨骨髓DNA的PCR-SSCP图谱。结果 25μL PCR反应体系中的Mg++、Taq酶浓度分别为1.5～2.0mM和1.0～1.5U,退火温度为54℃～57℃时PCR扩增效率高;应用8%～10%非变性聚丙烯酰胺凝胶,低离子强度(LIS)上样缓冲液,PCR产物稀释4～5倍,上样量为5～10μL,同一块凝胶相隔0.5～1.0小时可上样2次产物,电压为320V挂冰,室温或4℃电泳5～7小时,SSCP分析可得到较为满意的图谱。80例健康体检者外周血与20例正常肋骨骨髓DNA的C/EBPζ基因图谱相同。结论可以用正常体检者外周血DNA代替正常肋骨骨髓DNA行SSCP分析,作为C/EBPζ基因突变检测的对照图谱,两次上样的PCR-SSCP方法节约了试剂、时间、人力,可用于快速大量筛查白血病患者C/EBPζ基因突变。     

一种快速检测副溶血弧菌的PCR方法

目的建立一种简便、快速、准确检测副溶血弧菌的方法。方法根据Genbank收录的副溶血弧菌tlh基因序列设计合成引物 ,扩增tlh基因 ,用该方法检测副溶血弧菌标准株和分离株。结果用快速检测副溶血弧菌的PCR方法 ,菌液稀释到 2 .4× 10 2 cfu·mL- 1作PCR仍可扩增出目的片断 ;所有副溶血弧菌标准参考株及待检的副溶血弧菌均可扩增出一大约 130 0bp的特异条带 ;将扩增的tlh基因测序结果与Genbank中已收录的tlh基因序列比较 ,两序列的同源性达99%。结论该检测方法快捷、特异性好、敏感性高 ,可以作为副溶血弧菌的常规检测方法     

白血病细胞WT瘤基因突变的检测

目的 瘤基因（WT1）突变与白血病发病的关系。方法 采用PCR-SSCP技术检测32例白血病人标本基本小于16岁的患者9例，成人23例（平均年龄33岁）；急性淋巴细胞白血病15例。慢性粒细胞性白血病8例；18例正常人血标本。结果 有3例白血病标本的PCR产物即WT1基因电泳迁移异常；1例为急性淋巴细胞白血病患者，2例为急性粒细胞性白血病患者；分别位于外显子7、6和10。临床追踪观察发现该3例白血病患者经化疗未能达到完全缓解。全部于发病后3个月内死亡。而WT1基因正常的白血病患者经化疗后大多数能达到部分缓解或完全缓解，生存期明显延长。正常血标本PCR产物和SSCP结果无明显异常。结论 WT1基因突变与白血病发病有关，有助于白血病辅助诊断和预后的分析。     

快速RT－PCR用于脊髓灰质炎病毒的检测及鉴定

用三对型特异引物（１Ｐ，２Ｐ，３Ｐ），对实验室标准病毒株及临床分离病毒株进行快速ＲＴ－ＰＣＲ，能够特异性地分别扩增同型脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）的疫苗病毒株、野病毒株和抗原变异株，并能进行分型鉴定。快速ＲＴ－ＰＣＲ除了具有高度特异性和敏感性的特点外，由于不需进行病毒的组织培养、纯化及ＲＮＡ提取等繁琐操作，因此又具有更为快速和经济的优点。     

PCR/SSCP在恙虫病东方体基因分型中的应用

目的采用优化聚合酶链反应/单链构象多态性分析(PCR/SSCP)方法分析恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)基因型的各项条件.方法对恙虫病东方体山东分离株、小盾纤恙螨匀浆及恙虫病人全血中提取的Ot Sta56基因进行分析.采用PCR/SSCP检测,并与Nested PCR基因分型的结果进行比较.结果山东地区35份标本提取的Ot-DNA群引物扩增产物呈现出2种不同的单链构象图谱,其中33份与国际参考株Gilliam,Karp,Kato均不相同,应属这3型以外的一种基因型,经Nested PCR分型证实为Kawasaki型;2份与Karp株相同.表明山东地区恙虫病东方体至少存在2种型别.检测结果与Nested-PCR基因分型结果相符.条件优化以8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,常温下,200V电泳3 h获得的电泳结果较为理想,并易于操作.结论PCR/SSCP条件优化后可用于快速分析恙虫病东方体基因型,且操作简便,结果准确.     

抗原捕捉一步RT—PCR检测HAV研究

甲型肝炎病毒 (ｈｅｐａｔｉｔｉｓＡｖｉｒｕｓ,ＨＡＶ)是环境中常见的肠道病毒 ,因其易引起爆发流行 ,给人民的身心健康以及国民经济的发展带来极大的危害。 1985年ＰＣＲ技术问世 ,并日益应用到微生物检测领域 ,目前已建立了许多ＲＴ -ＰＣＲ检测ＨＡＶ的方法。本研究将抗原捕捉 (ａｎｔｉｇｅｎｃａｐｔｕｒｅ ,ＡＣ)ＰＣＲ与一步ＲＴ-ＰＣＲ相结合建立了抗原捕捉一步ＲＴ -ＰＣＲ ,并对人为污染样品中的ＨＡＶ进行了检测 ,获得较好结果。现将有关结果报告如下 :1　材料和方法1 1　材料　ＨＡＶＮｊ株以及ＰＬＣ/ＰＲＦ/ 5细胞 ,由军事…     

非O1非O139群霍乱弧菌多重PCR和SYBR Green实时PCR检测方法的建立

目的建立检测非Ol非0139群霍乱弧菌的多重PCR和SYBRGreen实时PCR方法。方法分别以霍乱弧菌的外膜蛋白基因(ompW)、01和0139群O抗原编码基因(咖)设计引物,建立多重PCR和SYBRGreen实时PCR方法,评价两种方法检测非01非0139群霍乱弧菌的特异性、重复性和一致性及最低检测菌量。结果建立了检测非01非0139群霍乱弧菌的多重PCR和SYBRGreen实时PCR方法,根据特异性条带(多重PCR)和特异性熔解温度(SYBRGreen实时PCR),两种方法均能特异性检测非01非0139群霍乱弧菌,并能鉴别其他弧菌(5种)和肠道杆菌(3种);两种方法的最低检测菌量分别为7×10⁴ cfu／ml(多重PCR)和7×10²cftdml(SYBR Green实时PCR),差异有统计学意义(P<0.05);对实时PCR的重复性检测,批内变异系数(CV)为 0.22％～0.92％,批间cv为0.27％～1.41％;经370株非01非0139群霍乱弧菌的检测,两种方法的一致性均为100％。结论建立的两种方法其特异性、敏感性及重复性均好,可适用于不同条件下非0l非0139群霍乱弧菌的检测和鉴定。     

结核分支杆菌药敏和耐药基因检测的临床应用和分析

目的 采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）检测结核分支杆菌耐药基因（rPOB、katG和rPSL),评估它的临床应用价值。方法 通过Bactec-960快速培养,PCR－SSCP和药物敏感试验了解114例肺结核病人结核分支杆菌耐药情况,分析了临床治疗效果。结果 近1／3的初治肺结核病人至少耐一种抗结核药物,RFP、INH和SM敏感株rPOB、katG和rPSL基因突变率分别为6．5％、11．4％和27．2％,耐药株基因突变率分别为60．2％、45．7％和62．7％,耐药基因突变率随着耐药浓度增而高而增高。药敏试验联合耐药基因检测指导治疗效果满意。结论 耐药基因检测指导治疗是一种新探索,与药敏试验联合应用可互相弥补,可能成为临床指导用药的好方法。     

荧光置换探针多重实时PCR检测结核杆菌3种耐药突变

[目的]建立单管检测结核分枝杆菌3种耐药突变的多重实时PCR检测方法,考察其敏感性并应用于痰标本的检测。[方法]将荧光双链置换探针、实时PCR和多重PCR相结合,针对3种一线药物链霉素、异烟肼和乙胺丁醇中最常见的且都是由于点突变而导致的耐药突变位点进行检测。[结果]该检测体系可以检测到5个菌/test。用该体系检测9份已知基因型的结核分枝杆菌培养标本和118份痰标本,所有检测结果均通过ARMS体系验证。[结论]该检测体系具有很高的敏感性和特异性,检测快速,测定突变位点范围较其它技术有较大提高,且操作简便,有利于结核病菌的早期耐药检测和指导医生用药。     

一种通用型肠道病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

目的 建立一种肠道病毒通用型微滴式数字PCR（ddPCR）的定量检测方法,以实现肠道病毒的量化检测。方法 利用肠道病毒标准品对ddPCR反应中的探针浓度、退火温度进行优化,并确定ddPCR的检测范围。利用已优化好的反应条件对28份临床样本进行病毒载量检测。结果 本研究确定ddPCR的最佳探针浓度为0.4 μmol/L,退火温度为51.0 ℃,核酸检测范围为3.02~3.59×10⁶ copies/μL,检出限为3.02 copies/μL。ddPCR方法线性相关系数为0.993 8,呈良好的线性关系。结论 本研究建立基于ddPCR肠道通用型的定量方法,可有效地对临床样本中不同血清型的肠道病毒临床样本进行拷贝数定量分析,为临床研究病毒载量的测定提供一种技术。     

煤工尘肺结核病耐药性的研究

目的 了解煤工尘肺结核患者所染结核杆菌对异烟肼、利福平及链霉素耐药情况和基因突变情况，以便探寻更有效的药物治疗方法。方法 从96份尘肺结核患者痰标本中分离出结核杆菌，测定异烟肼、利福平及链霉素的耐药情况，并用聚合酶链反应－单链构象多态性分析法（PCR－SSCP）扩增出KatG、rpoB及rpsL片段，再将这些片段的8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图与标准株的电泳图进行对照分析。结果 常规药敏试验检测出各种耐药株共67株，其中链霉素、利福平和异烟肼的耐药株构成比分别为80．5％（54／67）、58．2％（39／67）和50．7％（34／67）；经PCR－SSCP法分析，66株（98．5％）rpsL泳动异常，47株（70．1％）出现rpoB泳动异常，42株（62．7％）KatG泳动异常。结论 大部分尘肺结核患者的结核杆菌耐药分离株有基因突变，其突变率高于常规药敏试验结果。     

西尼罗病毒PCR检测方法的建立

[目的]应用通用引物建立快速、敏感、特异的PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染相关疾病的实验室监测和早期诊断。[方法]以西尼罗病毒感染者血清分离得到的病毒RNA逆转录cDNA为检测样本,通过对多株病毒基因组序列各区段保守性进行分析比较,在基因组非编码区设计引物和探针,分别用巢式PCR和荧光定量PCR方法对样本进行扩增。[结果]以西尼罗病毒RNA逆转录cDNA为模板,采用所建立的两种PCR方法,均可得到阳性检测结果。[结论]本研究设计的PCR扩增引物具有较好的通用性;建立的实时荧光定量PCR结合巢式PCR用于检测WNV的分析方法具有互补性,为研制成熟的西尼罗病毒检测试剂盒提供实验基础。