单链探针反向杂交试验技术检测结核分支杆菌链霉素耐药基因

用PCR-LiPA可简便、快速、灵敏、特异地检测出一部分结核分支杆菌链霉素耐药株的rpsl、rrs基因突变,可用于临床结核分支杆菌链霉素耐药性的辅助诊断手段.     

结核分支杆菌利福平耐药基因检测

利福平是结核病治疗的一线药物，但在临床上也常出现结核分支杆菌对利福平的耐药。目前检测耐药的方法较多的是采用改良的罗氏培养法加药敏试验，但由于培养基不同。检测方法不同，判定标准不一，国内目前尚缺乏有说服力的统一标准，由于药敏试验是建立在细菌培养基础上的，因此结核杆菌培养阴性的结核病患者无法做药敏试验，近年来，国内外学者不断报道较传统PCR更为灵敏、     

结核分支杆菌耐药分子机制的检测技术的研究

目的：探讨结核分支杆菌对异烟肼、利福平耐药的分子机制，建立快速检测耐药分支杆菌基因型的分子生物学方法。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR—SSCP)同时检测结核分支杆菌敏感株和耐异烟肼、利福平耐药株的KayG基因、rpoB基因突变。结果：78株结核分支杆菌临床分离株均未发现KatG、rpoB基因缺失。以结核分支杆菌H37RV为对照，36株药物敏感株的KarG、rpoB基因SSCP图谱均正常。42株同时耐异烟肼和利福平的多耐药株中，KatG和rpoB基因突变率分别为66．7％(28／42)，90．5％(38／42)。结论：结核分支杆菌耐异烟肼、利福平耐药性的产生是由于KatG基因和rpoB基因突变所致。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性。     

应用PCR—SSCP检测结核分支杆菌链霉素耐药基因的研究

结核病耐药问题十分严重，传统的药敏实验需1～2月。Sm是一线抗结核药物，结核分支杆菌耐Sm最常见的分子机制是由于核糖体S12蛋白编码基因（rpsL）突变。该文应用PCR－SSCP分析了62个结核分支杆菌临床分离株的rpsL基因，以H37Rv标准菌株为对照，13个药物敏感菌株中12个rpsL基因未见SSCP异常；37个耐Sm株中，31个（83．8％）有rpsL基因泳动异常；12个耐其它抗结核药物林中，仅1个单链DNA泳动异常。因此，PCR－SSCP有希望成为简便、快速地检测结核分支杆菌耐药突变株的方法，弥补常规药敏试验的不足，指导临床治疗。     

79株结核分支杆菌基因分型研究及耐药相关分析

目的通过多位点可变数目串联重复序列(MLVA)分型方法,结合流行病学资料,探讨绵阳地区结核分支杆菌的基因型特征,为本地结核病的防治研究提供科学依据。方法收集结核分支杆菌菌株和患者资料,采用国际上推荐的15个可变串联重复序列位点进行基因分型,应用BioNumerics(Version5.0)软件进行聚类分析,药物敏感性试验采用比例法,率的比较采用χ2检验。结果共对79株结核分支杆菌进行了基因检测,结果显示高度的基因多态性。QUB-11b、MIRU26、Mtub 21和MIRU 16分辨能力更高(HGI>0.7),位点MIRU 4、ETR-A和ETR-C显示分辨能力相对较低(HGI<0.4)。79株菌分为7个基因群,以Ⅲ群和Ⅴ群为主,Ⅲ群占46.8%,Ⅴ群占41.8%,其它群所含菌株较少。复治患者在Ⅲ群、Ⅴ群和其他群中所占比例分别为32.43%、21.21%和11.11%,差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅴ群中菌株耐药率高达36.36%,明显高于Ⅲ群(10.81%)和其他群(11.11%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论初步证实绵阳地区结核分支杆菌具有明显的基因多态性,主要流行型为Ⅲ群和Ⅴ群,主要耐药型为Ⅴ群,应加强Ⅲ群和Ⅴ群菌株的流行监控,加强Ⅴ群菌株的耐药性监测。     

结核分支杆菌异烟肼耐药基因的杂交检测

目的:探讨耐异烟肼结核分支杆菌的编码基因KatG和inhA基因的扩增以及突变情况.方法:采用PCR扩增技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因扩增;利用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因突变检测.结果:25株敏感株、35株耐药株KatG和inhA基因扩增均阳性;25例临床结核病人痰标本中KatG基因扩增阳性率为80%,inhA基因扩增阳性率为68%.结论:耐异烟肼菌株的基因突变率明显高于药物敏感株;PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏的特性能够为临床检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性提供初步依据.     

结核分支杆菌耐利福平耐药基因检测研究

目的评价应用DNA序列分析方法和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测rPOB基因突变在结核分支杆菌耐利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值.方法采用DNA序列分析法和PCR-SSCP法对80株结核分支杆菌临床分离株(其中药物敏感株32株,耐RFP或含耐RFP耐多药株48株)rpoB基因核心区域的突变情况进行检测.结果以结核分支杆菌H37RV为对照,所有32株药物敏感株的rPOB基因均无突变.用DNA序列分析方法检测48株耐药株中44株发生突变,敏感性为91.7%(44/48),其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸.PCR-SSCP检测48株耐RFP分离株中,45株rPOB基因SSCP图谱异常,其敏感性为93.1%(45/48).结论DNA序列分析可指导临床用药,PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP耐药性.     

结核分支杆菌异烟肼耐药基因的杂交检测

目的：探讨耐异烟肼结核分支杆菌的编码基因KatG和inhA基因的扩增以及突变情况。方法：采用PCR扩增技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因扩增；利用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因突变检测。结果：25株敏感株、35株耐药株KatG和inhA基因扩增均阳性；25例临床结核病人痰标本中KatG基因扩增阳性率为80％，inhA基因扩增阳性率为68％。结论：耐异烟肼菌株的基因突变率明显高于药物敏感株；PCR一寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏的特性能够为临床检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性提供初步依据。     

几种方法检测结核分支杆菌的比较

目的：评价聚合酶链反应（PCR）,细菌培养,抗酸染色,荧光染色对结核病的诊断价值。方法：PCR检测43例临床标本中结核分支杆菌（MTB）DNA,并与常规细菌学检测作对比。结果：PCR检测法敏感性为48.8%,荧光染色法为44.2%。细菌培养为32.6%,抗酸染色法为25.6%。结果表明,PCR法检测结核分支杆菌较抗酸染色法更敏感。结论：PCR法具有简便快速的特点。对结核病有较高的诊断价值。     

应用寡核苷酸探针膜杂交方法快速检测耐异烟肼结核分支杆菌基因型

目的应用寡核苷酸探针膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对异烟肼(isoniazid,INH)耐药性.方法设计与合成用于检测结核分支杆菌耐INH基因katG、inhA的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分支杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交,并与PCR-单链构象多态性(Polymerase chain reaction-Single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和PCR-直接测序(PCR-direct sequencing,PCR-DS)结果比较.结果 20株INH敏感株中,仅9株出现野生型探针K1阳性杂交,余11株中,10株K1b'杂交阳性,PCR-DS显示katG基因315位密码子AGC→ACC,1株K1c'杂交阳性,PCR-DS显示katG基因315位密码子AGC→AAC;15株出现野生型探针inh1阳性杂交,另5株Inha1探针杂交阳性,PCR-DS显示inhA基因-15位C→T突变.36株耐药株中,17株K1探针杂交阳性,18株K1b'杂交阳性,1株与所试探针不杂交,PCR-DS显示katG基因279位密码子GGC→GAC;11株与突变型Inha1探针阳性杂交,25株与野生型探针inh1杂交阳性.katG基因膜杂交突变检出率为 50 %,inhA基因膜杂交突变检出率为 30.56 %.结论寡核苷酸探针膜杂交技术可能成为检测部分结核分支杆菌耐异烟肼基因型简便、快速的方法.     

耐多药肺结核患者结核分支杆菌耐药基因检测及治疗观察

目的：检测肺结核患者痰标本的耐药基因，并观察其抗结核疗效。方法：用PCR－SSCP方法对43例初治和26例复治耐多药临床肺结核患者痰标本进行耐药基因检测，并观察化疗结果。结果：43例初治痰标本检测，4例rpoB基因突变，无KatG,rpsL基因突变；26例复治痰标本rpoB，KatG,rpsL检出分别为26／26（100％），13／26（50％），12／26（46％）；复发肺结核患者3个月及6个月痰阴转率为76．9％，76．9％，X线好转率为76．9％和84．6％，结论：PCR－SSCP法对耐多药临床肺结核患者痰标本进行rpoB，KatG,rpsL检测，可为临床肺结结核患者耐药情况辅助诊断，指导治疗。     

DNA探针杂交检测结核分支杆菌的研究

我们选用生物素标记了一段188bp的常链DNA探针,以碱性磷酸酶催化的显色反应检测,研究其检测结核分支杆菌基因组DNA及其PCR产物的敏感性与特异性。1材料和方法1.1菌种的来源及DNA提取方法24种分支杆菌来自中国药品生物制品检定所,11种非分支杆菌来自中国科学院微生物所。DNA提取     

结核分支杆菌耐药分子机制及快速检测的研究

目的：研究结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药的分子机制，探索快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性的分子生物学方法。方法：应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药株与katG基因、rpoB基因突变。结果：46例株结核分支杆菌临床分离株均未发现katG基因序列的缺失，17株检测到katG基因突变，耐药株中katG基因的突变率为57％；87株结核分支杆菌利福平耐药临床分离株的PCR－SSCP结果显示，所有39株利福平敏感菌无突变检出，48株利福平耐药菌中，36株高度利福平耐药菌和7株低度利福平耐药菌检测到rpoB基因突变；另5株低度利福平耐药菌未检测到rpoB基因突变，利福平耐药株中rpoB基因的突变检出率为89．6％。结论：证实katG和rpoB基因突变分别是结核分支杆菌异烟肼和利福平耐药的主要分子机制。应用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）可快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性，使应用传统耐药测定方法需时1－2个月缩短到2天内即可完成，使非生长依赖性分子生物学手段应用于快速检测结核分支杆菌耐药性成为可能。     

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的 探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药性。方法 用PCR-SSCP技术分析对35例耐INH(或含耐异烟肼)，63例耐RFP(或含耐RFP)的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果 以结核分支杆菌H37RV为对照，63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性，其中46例SSCP图谱与H37RV标准株有差异，rpoB突变率为65．2％。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性，15例SSCP图谱与H37RV标准株有差异，突变率为42．8％。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论 PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的为了解新疆地区结核分支杆菌耐异烟肼（INH）分离株KatG基因突变情况，探讨其在INH耐药性中的可能作用。方法采用PCR和PCR—SSCP方法对60株结核分支杆菌临床分离株KatG基因突变进行检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，28株药物敏感株的KatG基因PCR扩增产物273bp片段28例SSCP图谱正常。32例耐INH分离株中KatG基因扩增均阳性，其中11株SSCP图谱异常，其敏感性为34．37％。结论新疆地区结核分支杆菌INH耐药株存在KatG基因突变，其突变对INH耐药性的影响有待于进一步研究。     

结核分支杆菌的耐药性分析

目前,全世界已有近20亿人口受到结核分支杆菌的感染,结核患者约2000万人,每年新发患者约800～1000万人[1].近年来,由于人口流动普遍增加、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核分支杆菌伴发感染以及耐药菌株的出现等原因,使结核杆菌感染和结核病发生率有上升趋势,给全球结核病防治提出了新的挑战.及时诊断并检测分离株的耐药性对治疗结核非常重要.但结核分支杆菌生长十分缓慢,传统的检测方法往往需要7～10d后才能确定其耐药性.近年来,核酸检测技术被广泛应用于结核杆菌耐药性的分析,综述如下.     

应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分支杆菌

目的：建立双重ＰＣＲ技术快速鉴定的结核与非结核分支杆菌。方法：通过试验选择双重ＰＣＲ最佳反应条件,检测引物Ａ１,Ａ２和Ｂ１,Ｂ２扩增分支杆菌的特异性及扩增结核分支杆菌的敏感性,并对３４例结核分支杆菌和非结核分支杆菌临床分离株鉴定。结果：引物Ａ１,Ａ２能扩增所试２４种分支杆菌,Ｂ１,Ｂ２仅扩增结核分支杆菌复合体菌种,两对引物扩增１２种非分支杆菌均为阴性。     

青岛地区结核分支杆菌吡嗪酰胺耐药基因pncA的检测

目的 了解青岛地区结核分支杆菌耐吡嗪酰胺（PZA）分离株pncA基因突变的情况,探讨其与耐PZA之间的关系。方法 应用BACTEC-460培养系统对76例结核分支杆菌临床分离株进行结核分支杆菌常规培养和药敏检测,聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术检测pncA基因的突变。结果 76株结核分支杆菌临床分离株均经PCR扩增出结核分支杆菌复合群保守序列IS6110基因片段,69株扩增出pncA基因的特异序列。后者包括：SSCP泳动异常者18株,其中耐药株13株,敏感株5株;SSCP泳动正常者51株,其中耐药株14株,敏感株37株。结论 青岛地区结核分支杆菌临床分离株耐PZA主要分子机制之一为pncA基因的突变;PCR—SSCP技术能快速准确地检测结核分支杆菌耐PZA基因pncA的突变,可弥补常规药敏试验的不足。     

临床实验室结核分支杆菌检测现状与进展

我国现有活动性结核病人近500万,全国有5.5亿人感染过结核菌,结核病发病率和患者人数均居世界第二位。WHO公布的世界38个国家和地区结核病耐药率检测资料中,我国在引起警示的国家和地区居第一位。我国结核耐药率高达46%,耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis,MDR-TB）和广泛耐药结核病（extensively drug resistant tuberculosis,XDR-TB）的传播和流行,已严重威胁到公众安全。这也是临床实验室分支杆菌检测面临的新挑战和新任务。     

结核分支杆菌rpsL基因突变的快速检测

目的建立快速检测结核分支杆菌rpsL基因突变的方法。方法用聚合酶链反应(PCR)直接从结核分支杆菌基因组扩增rpsL基因,并直接进行测序鉴定。结果用引物P1,P2扩增H37Rv DNA获得约460bp片段,经序列测定后,显示与GeneBank中公布的序列一致(同源性99％)。28株结核分支杆菌耐SM分离株中,20株rpsL基因突变位于43住密码子,另8株分离株未出现rpsL基因突变。结论rpsL基因突变是SM耐药性的重要分子机制,本研究为进一步研究链霉素作用方式和耐药机制提供了有力手段。