宫颈癌单克隆抗体-葡聚糖-氨甲喋呤偶合物的制备及其体外抗肿瘤作用

以葡聚糖(Dex)氧化产物多醛基葡聚糖作为中间载体,将氨甲喋呤(MTX)共价偶联于抗小鼠宫颈癌单克隆抗体AU_(14-1)(IgG)上,制得AU_(14-1)-Dex-MTX偶合物;其中IgG与MTX摩尔比为1:20。间接膜免疫荧光试验表明,偶合物中AU_(14-1)对靶肿瘤U_(14)细胞的特异结合活性在3.75×10~(-8)M水平,与未偶合的AU_(14-1),相似。体外抗肿瘤实验表明,偶合物不仅获得了由单克隆抗体导向的选择性药物抗肿瘤作用,且对HeLa细咆的生长抑制作用强于U_(14)细胞,进一步证明了“进化抗原”理论。本研究提示AU_(14-1)-Dex-MTX偶合物具有临床应用的潜在性。     

白血病导向治疗的研究

本文报道制备的抗人淋巴白血病细胞表面分化抗原的单抗 HI30 CIgG1)与抗癌药柔红霉素、甲氨喋呤、丝裂霉素以及蓖麻毒素及其A链连接成免疫偶合物及免疫毒素。用间接免疫荧光法在体外测定这些免疫偶合物和免疫毒素与靶细胞—人白血病细胞CME细胞株特异     

抗白血病导弹药物研究

根据白血病类型多、分化阶段不同,临床多采用联合化疗的特点,我们制备了多种单抗,选多种类型药物,用不同连接方法制备出多种偶合物——抗白血病导弹药物,从中挑选2个偶合物进行系统研究。     

ICAM-1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:探讨ICAM1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞表达ICAM1的影响,为利用ICAM1反义寡核苷酸类药物治疗肾小管间质病变奠定基础。方法:小鼠ICAM1反义寡核苷酸及其对照物参照文献合成并行全硫代磷酸化修饰。部分ICAM1反义寡核苷酸在其5′端作FITC荧光标记。将ICAM1反义寡核苷酸单独或脂质体转染试剂DOTAP混合后转染至培养的肾小管上皮细胞之中,转染成功后加入IL1β诱导细胞产生ICAM1。采用对照寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。利用免疫组化染色的方法检测细胞ICAM1表达变化并提取细胞总RNA行逆转录PCR及Northern杂交观察ICAM1mRNA的表达的变化。结果:两个不同浓度的ICAM1反义寡核苷酸均可明显阻断IL1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM1及ICAM1mRNA的表达;对照的寡核苷酸不能减少IL1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM1及ICAM1mRNA的表达。结论:小鼠ICAM1反义寡核苷酸可明显抑制IL1β诱导的小鼠肾小管上皮细胞ICAM1及ICAM1mRNA的表达,提示ICAM1的反义寡核苷酸有可能应用于肾小管间质病变的实验治疗之中。     

ICAM—1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞ICAM—1表达的影响

目的：探讨ＩＣＡＭ－１反应寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞表达ＩＣＡＭ－１的影响，为利用ＩＣＡＭ－１反义核苷酸类药物治疗肾小管间质病变奠定基础。方法：小鼠ＩＣＡＭ－１反义寡核苷酸及其对照物参照文献合成并行全硫代磷酸化修饰。部分ＩＣＡＭ－１反义寡核苷酸在其５‘端作ＦＩＴＣ荧光标记。将ＩＣＡＭ－１反义寡核苷酸单独或脂质体转染试剂ＤＯＴＡＰ混合反转染至培养的肾小管上皮细胞之中，转染成功后加入ＩＬ－１β诱导细     

胃癌单克隆抗体—羟基喜树碱、鬼臼毒素偶合物体外细胞杀伤力研究

以抗人胃癌单克隆抗体RSF9分别与羟基喜树碱(HCPT,hydroxy Camptothecine及皂臼毒素(PPT,podo phyllotoxin)交联成植物毒素-单抗免疫偶合物,以胃癌细胞(SGC-7901及MKN-28)作单抗     

硫代bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞的增殖

目的探讨硫代修饰对bFGF寡核苷酸抑制HepG2和Hep2细胞增殖的影响。方法设计、合成bFGF寡核苷酸,聚乙烯亚胺(jetPEI)介导其转染入HepG2和Hep2细胞,荧光显微镜观察其在细胞中的定位,流式细胞仪分析转染效率,MTT法检测细胞增殖。结果bFGF反/正义硫代寡核苷酸被jetPEI介导高效转染入细胞内,主要位于细胞核。反/正义硫代寡核苷酸均呈剂量时间依赖地抑制细胞增殖,相同剂量时正硫代寡核苷酸的抑制效率高于反义硫代寡核苷酸。相应非修饰反义寡核苷酸较其互补正义链能更有效抑制两种细胞增殖。核苷酸突变明显降低反义硫代寡核苷酸对细胞抑制,并不影响正义硫代寡核苷酸的细胞抑制率。反义硫代寡核苷酸明显降低细胞中bFGF表达。结论硫代修饰bFGF反义寡核苷酸在细胞内特异性结合核酸以反义机制抑制肿瘤细胞增殖,正义寡核苷酸则因硫代修饰于细胞内以非核酸特异性机制抑制肿瘤细胞增殖。     

宫颈癌单克隆抗体-葡聚糖-氨甲喋呤偶合物的制备及其体外抗肿瘤作用

以葡聚糖(Dex)氧化产物多醛基葡聚糖作为中间载体,将氯甲喋呤(MTX)共价偶联于抗小鼠宫颈癌单克隆抗体AU_(14-1)(IgG)上,制得AU_(14-1)-Dex-MTX偶合物;其中IgG与MTX摩尔比为1:63。间接膜     

反基因技术中识别多聚嘌呤靶序列嘧啶断点的寡核苷酸

识别 CG断点的寡核苷酸包括 T* CG配对的顺向嘧啶 (TC)和 T* CG配对的反向嘌呤 (G、GA、GT) 寡核苷酸 ,其中以 T* CG配对的反向 GT寡核苷酸亲和性最高。识别 TA断点的寡核苷酸包括 G* TA配对的顺向嘧啶 (TC、TG)和 C* TA配对的反向嘌呤 (GA、GT)寡核苷酸 ,其中以 C* TA配对的反向 GA寡核苷酸亲和性最高。识别 CG和 TA断点的同时存在的寡核苷酸包括 T* CG和 G* TA配对的反向 GA和 T* CG和 T* TA配对的反向GT寡核苷酸 ,以 T* CG和 G* TA配对反向 GA寡核苷酸亲活性较高     

胃癌单克隆抗体偶合物导向化疗的实验研究

胃癌单克隆抗体偶合物导向化疗的实验研究祝金泉王崇文张昆和谢勇胡伟（江西医学院消化内科研究所，南昌３３０００６）本文采用Ｂ淋巴细胞杂交瘤方法制备的鼠抗人胃癌单克隆抗体（代号８７１１Ｃ１ＭｃＡｂ），经盐析和ＤＥＡＥ－５２离子交换层析法纯化后，以Ｉｏｄｏｇ...     

急非淋M_2单克隆抗体与高三尖杉酯碱偶合物的制备及其体外活性检测

急非淋白血病在我国是一种常见的白血病,至今还没有一种特效的治疗方法.为寻找对白血病细胞有特异性杀伤能力而对正常造血干细胞没有严重损害的药物,我们用急非淋 M_2单克隆抗体与高三尖杉酯碱偶联形成偶合物进行导向治疗.     

NaCl浓度和茎环内的碱基结构对shRNA退火影响的研究

目的优化DNA寡核苷酸单链退火条件,提高单链DNA寡核苷酸退火效率,加速shRNA表达载体构建速度。方法将茎环内部碱基结构不同DNA寡核苷酸链在不同浓度（50、100、150、200mmol/L）NaCl退火缓冲液中进行退火,通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA寡核苷酸链在退火前后电泳速度的变化,利用Gene Tools分析软件对电泳图像进行分析比较退火效率。结果当退火缓冲液中NaCl浓度为200mmol/L时,DNA寡核苷酸单链退火效率明显提高,茎环内部碱基互补的DNA寡核苷酸单链退火效率46.00%±3.33%,茎环内部碱基不互补DNA寡核苷酸单链退火效率97.00%±1.49%。结论NaCl浓度和茎环内的碱基设计是影响shRNA退火主要因素,优化shRNA的退火条件,提高退火效率,可以加速载体构建。目的优化DNA寡核苷酸单链退火条件,提高单链DNA寡核苷酸退火效率,加速shRNA表达载体构建速度。方法将茎环内部碱基结构不同DNA寡核苷酸链在不同浓度（50、100、150、200mmol/L）NaCl退火缓冲液中进行退火,通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA寡核苷酸链在退火前后电泳速度的变化,利用GeneTools分析软件对电泳图像进行分析比较退火效率。结果当退火缓冲液中NaCl浓度为200mmol/L时,DNA寡核苷酸单链退火效率明显提高,茎环内部碱基互补的DNA寡核苷酸单链退火效率46.00%±3.33%,茎环内部碱基不互补DNA寡核苷酸单链退火效率97.00%±1.49%。结论NaCl浓度和茎环内的碱基设计是影响shRNA退火主要因素,优化shRNA的退火条件,提高退火效率,可以加速载体构建。     

cDNA微阵列与寡核苷酸芯片的制备方法

c DNA微阵列和寡核苷酸芯片是常见的合成后点样的 DNA微阵列 ,点样方法主要是通过物理吸附或共价结合的方式将探针固定于载体上。本文总结了近年来国内外文献报道的 c DNA微阵列制备方法 :在多聚赖氨酸包被的玻璃基片表面制备 c DNA微阵列 ;用琼脂糖包被的玻璃基片制备 c DNA微阵列 ;在氨基或醛基修饰的玻璃基片表面制备 c DNA微阵列 ;寡核苷酸芯片的制备方法 :氨基修饰的玻片与 5 `末端带氨基的寡核苷酸探针通过不同的 linker连接 ;硅烷化寡核苷酸直接点样于玻片上制成寡核苷酸微阵列 ;硫代寡核苷酸通过二硫键与巯基修饰的玻片连接 ;水凝胶芯片固定寡核苷酸 ;丙烯酰胺硅烷化的基片与 5′丙烯酰胺修饰的寡核苷酸连接。并展望了基因芯片的应用前景     

反意寡核苷酸的治疗作用机理及其应用

反意寡核苷酸作为治疗的新方法正受到广泛重视。它设计合理,合成及纯化方便,作用敏感、特异。由于其作用机制的多重性及普遍性,应用范围较广。目前,在原核及真核生物中的抗病毒、抗肿瘤作用以及基础研究等方面均做了大量的工作。本文介绍了反意寡核苷酸的作用机理及其应用方面的研究近况。     

反义寡核苷酸阻断多巴胺转运体表达的大鼠对MPTP反应性的改变

目的 了解反义寡核苷酸阻断大鼠黑质多巴胺神经元多巴胺转运载体表达的效果,观察阻断后大鼠对神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)反应性的改变.方法 在立体定向仪下埋管至SD大鼠黑质致密部,4组大鼠分别接受反义寡核苷酸、正义寡核苷酸、错义寡核苷酸及生理盐水注射5d,之后接受MFTP注射,进行行为学、病理免疫组化染色观察多巴胺转运载体表达及多巴胺神经元凋亡.结果 大鼠黑质多巴胺转运载体表达(阳性单位,PU)反义寡核苷酸组(PU=6.65±1.67)较生理盐水对照组(PU=12.41±2.46)、正义寡核苷酸组(PU=11.45±1.17)及错义寡核苷酸组(PU=10.35±2.89)明显降低(免疫组化染色面积减少及强度降低)(P＜0.01);阿扑吗啡诱导的大鼠旋转反义寡核苷酸组较其余3组慢(P＜0.05);其余3组间差异无统计学意义(P＞0.05).反义寡核苷酸组黑质200×视野凋亡细胞个数(21.4±5.6)较其他3组(生理盐水组61.6±19.7,正义寡核苷酸组56.5±16.3,错义寡核苷酸组52.2±12.5)明显减少(P＜0.01).结论 反义寡核苷酸能有效阻断大鼠黑质多巴胺转运载体表达,阻断后大鼠对MPTP毒素反应性减弱.     

IL-1R相关激酶-1和磷脂酰肌醇3-激酶协同调控IL-1诱导的NF-κB活化

为研究IL 1R相关激酶 1(IRAK 1)和磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI 3 激酶 )在IL 1诱导NF κB活化中的作用 ,本文采用Lipo fectin介导反义IRAK 1寡核苷酸或反义PI 3 激酶寡核苷酸转染HEpG2细胞后 ,用Western杂交检测IRAK 1和PI 3 激酶表达水平 ,以SandwichELISA法检测NF κB的活化。结果表明 ,①反义IRAK 1寡核苷酸和反义PI3 激酶寡核苷酸分别抑制IRAK 1和PI3 激酶表达 ;②反义IRAK 1寡核苷酸或反义PI 3 激酶寡核苷酸部分抑制NF κB活化 ;③与反义IRAK 1寡核苷酸或反义PI 3 激酶寡核苷酸单独转染HEpG2细胞相比 ,反义IRAK 1寡核苷酸和反义PI 3 激酶寡核苷酸共转染HEpG2细胞对NF κB的抑制作用明显增强。表明IRAK 1或PI3 激酶调控NF κB活化但不能完全激活NF κB ,IRAK 1和PI3 激酶在调控NF κB活化时协同作用。     

RNA-21为靶标的反义寡核苷酸对人白血病K562细胞的抑制作用

目的： 探讨以microRNA-21为靶标的反义寡核苷酸对白血病K562细胞的生长抑制效应及可能的作用机制。方法：依据与microRNA-21序列互补的原理,设计反义寡核苷酸,人工合成并全硫代修饰,在LipofectamineTM 2000介导下,转染K562细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选最佳作用浓度,台盼蓝拒染法检测其对细胞生长抑制的作用,姬姆萨染色观察细胞的形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的变化。利用荧光定量PCR技术检测反义寡核苷酸作用后细胞内microRNA-21表达水平的改变。结果：MTT结果显示反义寡核苷酸有效抑制细胞生长,分别与随机组、空白对照组进行比较有显著差异（P<0.05）,反义寡核苷酸作用的最佳浓度是0.6 μmol/L。台盼蓝拒染法结果显示从转染K562细胞24 h开始,反义寡核苷酸组细胞生长明显受到抑制,抑制效应持续到72 h。姬姆萨染色显示反义寡核苷酸作用K562细胞24 h后,可在细胞中见凋亡小体。流式细胞仪检测结果显示反义寡核苷酸组出现明显的亚二倍体峰,细胞周期无发生明显变化。荧光定量PCR结果显示,反义寡核苷酸可有效抑制细胞内microRNA-21的表达水平。结论：以microRNA-21为靶标的反义寡核苷酸可有效抑制人白血病K562细胞的生长,并显著促进细胞凋亡。     

WT1反义寡核苷酸对卵巢癌细胞的抑制作用

目的观察WT1反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用。方法以人卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象,应用ASODN技术,将WT1-ASODN转染到SKOV3细胞中,利用MTT法检测WT1寡核苷酸的最适作用浓度和作用时间及WT1反义寡核苷酸对SKOV3细胞的杀伤活性,流式细胞仪检测分析WT1反义寡核苷酸对SKOV3细胞周期和细胞凋亡的影响。结果脂质体介导的WT1反义寡核苷酸在体外能够明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,诱导细胞凋亡。结论 WT1反义寡核苷酸能诱导卵巢癌细胞凋亡,从而抑制卵巢癌细胞的增殖,可望成为一种卵巢癌临床有效的治疗方法。     

Survivin反义寡核苷酸联合化疗药物诱导儿童急性白血病细胞凋亡的实验研究

目的研究Survivin基因在儿童急性白血病细胞中的表达,Survivin反义寡核苷酸对儿童急性白血病细胞凋亡的影响,并探讨反义寡核苷酸与传统化疗药物对白血病的协同治疗作用。方法用PCR的方法检查儿童白血病细胞Sur-vivin表达,将Survivin基因反义寡核苷酸转染入白血病细胞,用TUNEL及流式细胞仪检查各组细胞的凋亡率。结果Sur-vivin基因在儿童急性白血病细胞中高表达,Survivin反义寡核苷酸及足叶乙甙均能够单独诱导白血病细胞凋亡,两者合用时细胞凋亡率更高。结论Survivin在儿童急性白血病细胞中高表达;Survivin反义寡核苷酸可诱导白血病细胞凋亡;Sur-vivin反义寡核苷酸可促进足叶乙甙诱导的儿童急性白血病细胞凋亡。     

Bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCI-H69化疗敏感性的检测

目的:研究Bcl-2反义寡核苷酸对以NCI-H69为标记的人小细胞肺癌细胞化疗药物敏感性的促进作用.方法:将NCI-H69细胞培养传代,细胞共分4组,反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组,通过脂质体转染将不同寡核苷酸导入细胞中,Western-Blot法检测Bcl-2蛋白的表达.化疗药物依托泊甙(Vp-16)分别以不同浓度加入4组细胞.MTT法测定细胞存活分数.结果:4组细胞中加入Vp-16后,反义寡核苷酸组细胞在Vp-16浓度0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/ml的凋亡率明显高于空白对照组,统计结果差异具有显著性(P＜0.05),正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组相比则无统计学差异(P＞0.05).转染反义寡核苷酸组在不加入Vp-16和加入Vp-16不同剂量后细胞的存活分数均明显低于空白组,且有统计学差异(P＜0.01),而转染正义链和无义链组与空白组比较则无统计学差异(P＞0.05).结论:Bcl-2反义寡核苷酸能有效封闭Bcl-2基因的表达,增强小细胞肺癌细胞NCI-H69对化疗药物的敏感性.