人重组成釉蛋白C端肽在大肠杆菌中的表达及初步纯化

目的 :在大肠杆菌中表达人重组成釉蛋白C端肽 ,并对重组蛋白进行纯化 ,为进一步制备抗人成釉蛋白抗体和功能研究奠定基础。方法 :将编码人成釉蛋白C端肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pRSET -A上 ,构建表达质粒 pRSET -A -AMBN ,以大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)为宿主菌进行诱导表达 ,表达产物经镍 -次氮基三乙酸 (Ni -NTA)柱进行亲和层析纯化。结果 :工程菌在IPTG诱导 3h后 ,在SDS -PAGE上出现一条新的蛋白带 ,相对分子量 (Mr)为 5 2× 10 3 ,以可溶形式存在 ,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度大于 95 %的人重组成釉蛋白C端肽。结论 :获得Mr为 5 2× 10 3 的人重组成釉蛋白C端肽。     

变形链球菌ComE蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的:构建变形链球菌comE基因原核表达载体,诱导ComE 融合蛋白高效表达,获取高质量的ComE 融合蛋白.方法:提取变形链球菌基因组,PCR 扩增得到变形链球菌comE基因片段,BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后定向克隆到pET28a(+) 表达载体中,并转化入E. Coli BL21(DE3).IPTG 诱导融合蛋白表达,Western blot 鉴定表达产物.进行蛋白表达的可溶性鉴定,并优化诱导时菌液的A600值、IPTG 浓度、诱导时间和温度4 个表达条件.然后用优化的条件大量诱导表达ComE 融合蛋白,采用镍柱和分子筛两步法进行纯化.结果:经PCR、双酶切反应以及测序鉴定,重组质粒中的插入序列为comE基因的全长片段(753 bp),无碱基的突变与读码框架的偏移.Western blot 证实表达产物确为6×His-ComE 融合蛋白,相对分子质量约为33 000.目的蛋白在上清和沉淀中均有表达,且当A600 为0.4 时,加入IPTG 至终浓度0.10 mmol/L,37 ℃诱导4 h后表达量最大.结论:成功构建pET28a(+)-comE 原核表达载体,用优化后的6×His-ComE 融合蛋白在E. Coli BL21(DE3) 中的表达条件,获得纯化的变形链球菌ComE 融合蛋白.     

大鼠釉原蛋白基因的融合表达及其纯化

目的：观察釉原蛋白（Ａｍｅｌｏｇｅｎｉｎ,Ａｍ） 基因ＰＣＲ 产物在大肠杆菌中的表达。方法：利用原核表达载体ＰＲＳＥＴ,转化大肠杆菌ＪＭ１０９ ,通过ＩＰＴＧ 诱导,收菌。聚丙烯酰胺凝胶电泳。过柱纯化。结果：电泳分析表明,釉原蛋白基因ＰＣＲ产物在大肠杆菌中成功的获得了表达。结论：表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在。利用Ｎｉ－ ＮＴＡ 金属螯合亲和层析在变性条件下对表达的蛋白进行纯化,获得纯化蛋白。     

人β防御素3重组表达的优化

目的:通过对β防御素3(HBD3)重组表达实验方法的改进,获得大量有活性的重组人β防御素3(rhBD3),为抗菌肽rhBD3的获得提供新的实验依据。方法:将构建好的原核表达质粒pET32a/hBD3在E.coli BL21(DE3)中表达,筛选HBD3优化表达条件,并对其抗菌活性进行评价。结果:含有重组质粒的菌株经IPTG诱导后,表达产物经SDS-PAGE显示在约26 kD处看到预期的条带;对不同诱导时间、温度、IPTG浓度时融合蛋白表达率分析的结果表明:rhBD3在35℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导6 h表达量分别达高峰。表达蛋白纯化后,带His-Tag的重组hBD3融合蛋白和酶切纯化的重组hBD3的体外抑菌试验结果显示,该蛋白对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抗菌活性。结论:通过基因工程方法,在本实验设定的表达条件下,可以制备出大量具有抑菌活性的rhBD3,为今后rhBD3的研究应用提供实验基础。     

c-Jun调控成釉细胞Amelotin基因表达的研究

目的:通过过表达及knockdown c-Jun基因,观察小鼠成釉细胞中釉成熟蛋白(amelotin)的表达变化,以初步确定c-Jun对amelotin的调控作用。方法:①应用免疫组化和细胞免疫荧光方法观察体内外成釉细胞中的c-Jun及amelotin的表达情况;②RT-PCR获得c-Jun基因,克隆至pcDNA3.1/myc-hisA,瞬时转染成釉细胞,real time RT-PCR观察其对amelotin表达的影响;③化学合成c-Jun siRNA,瞬时转染成釉细胞,re-al time RT-PCR观察其对amelotin表达的影响。结果:①体内外成釉细胞中c-Jun和amelotin均有表达,c-Jun主要在成釉细胞胞核中表达,amelotin在成釉细胞和釉质全层均有表达;②成功构建c-Jun真核重组表达载体pcDNA3.1/myc-hisA-c-Jun,转染成釉细胞后amelotin mRNA表达水平显著上升;③成功沉默c-Jun,amelotin在转染c-Jun siRNA组表达水平显著下降。结论:在成釉细胞中,c-Jun在转录水平调控amelotin基因的表达。     

人釉原蛋白基因在大肠杆菌中的融合表达

目的建立人釉原蛋白（AMG）成熟肽基因在大肠杆菌中融合表达和纯化的技术路线。方法利用已构建并经鉴定的重组质粒pGEX- 4T- 1/AMG转化大肠杆菌BL21,分别对诱导时间、异丙基- β- D硫代半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导温度进行优化,在最佳诱导表达条件下,分别对菌液上清、周质、胞质和包涵体中的目的蛋白表达进行分析,在可溶性蛋白中发现大量目的蛋白,随后利用GSTrapFF亲和层析柱进行人AMG融合蛋白的过柱纯化。结果pGEX- 4T- 1/AMG重组质粒的双酶切凝胶电泳鉴定结果和测序鉴定结果和预期一致。最佳诱导时间为14.5 h、最佳诱导剂浓度为1.0 mmol/L、最佳诱导温度为20 ℃,在此条件下目的蛋白的表达量达到峰值。在最佳诱导条件下,胞质蛋白和包涵体中都有大量的目的蛋白。提取大量胞质蛋白,经GSTrapFF亲和层析柱纯化,收集纯化液,进行SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,显示成功纯化了AMG融合蛋白,在提取液洗涤2次后,可获得高纯度的融合蛋白。结论利用pGEX- 4T- 1/AMG原核表达体系成功获得纯化的人AMG融合蛋白。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :在大肠杆菌中表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因 (glucanbindingproteinB ,gbpB) ,并对重组蛋白进行初步纯化 ,为下一步制备多抗和进行相关的研究奠定基础。方法 :将克隆到的gbpB全长编码区基因克隆到表达载体 pPROEXTMHTb ,构建表达质粒 pPROEXTMHTb - gbpB ,以大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)为宿主菌进行诱导表达 ,表达产物经镍 -次氮基三乙酸 (Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化。结果 :工程菌经IPTG诱导 3h后 ,在SDS -PAGE上出现一条新的蛋白条带 ,相对分子量 (Mr)为 4 .5～ 5 .0× 10 3 ,以可溶形式存在 ,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度较高的重组葡聚糖结合蛋白B。结论 :获得Mr为 4 .5～ 5 .0× 10 3 的重组葡聚糖结合蛋白B     

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建原核表达载体,诱导其在大肠杆菌中融合表达,并鉴定、纯化其表达产物。方法克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因,构建表达载体pET15b-FimA,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLyS感受态细胞;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白,以抗6×His Tag单克隆抗体为一抗,Western blot鉴定、Co2+柱亲和层析纯化融合蛋白。结果克隆的FimA基因序列及插入表达载体中的FimA序列均与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后Western blot鉴定4.1×104处有目的蛋白表达;Co2+柱亲和层析法获得纯化的高浓度FimA蛋白。结论本实验成功构建了牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白FimA基因的原核表达载体pET15b-FimA,并在大肠杆菌中获得成功表达和纯化,为进一步制备牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白单克隆抗体和研制开发预防牙周炎的亚单位蛋白疫苗奠定了实验基础。     

变形链球菌CH43变链素Ⅰ基因片段的克隆及表达

目的:获得编码变形链球菌CH43变链素Ⅰ前体肽基因片段,并诱导其在不杀伤工程菌的前提下高效表达。方法:用PCR技术从变形链球菌CH43基因库中扩增出编码变链素Ⅰ成熟肽mutA基因片段相应大小的DNA片段,将片段与pMD18 T载体连接后测序。将测序正确的mutA按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pProEX,将连接产物转化入E.coliDH5α,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白。以IPTG浓度、A600值、诱导时间各梯度优化表达。结果:PCR获得的mutA序列与GenBank报道的一致(为147bp)。优化了诱导条件使重组载体在E.coliDH5α中高效表达,融合蛋白经SDS PAGE,在相对分子质量为5. 7×103处有特异的蛋白条带,在A600为1. 666时,加入IPTG至终浓度为1. 0mmol/L,诱导6h,目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白量的20%左右。结论:成功克隆变形链球菌CH43变链素ⅠmutA基因片段,并在E.coliDH5α中高效表达。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白D基因的分子克隆及其原核表达和初步纯化

目的:克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白D(gbpD)基因,在大肠杆菌中表达并对重组蛋白进行初步纯化,为进一步的蛋白功能研究奠定基础。方法:体外培养变形链球菌UA159菌株并以其基因组为模板,对gbpD基因编码区进行PCR扩增,连接pMD-18T载体并测序。随后将该片段克隆入原核表达载体pPROEX HTb中,构建表达质粒pPROEX/gbpD,转化大肠杆菌DH5α并用IPTG诱导表达。表达产物经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化。结果:成功克隆变形链球菌gbpD基因并在大肠杆菌中得到可溶性表达,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度大于95%、相对分子量(Mr)为76×103的变链菌GbpD蛋白。结论:获得Mr为76×103的变形链球菌GbpD蛋白。对进一步确定GbpD的葡聚糖结合能力,探讨其在变链菌致龋过程中的作用,以及在龋病预防领域的应用前景都具有重要的意义。