肝细胞缺氧预处理细胞保护作用中热休克蛋白70表达的调控机制

目的　研究热休克蛋白 70 (HSP70 )表达与肝细胞缺氧预处理的关系及其调控机制。方法　建立肝细胞缺氧预处理模型 ,应用蛋白激酶C(PKC)抑制剂、激动剂和丝裂原激活的蛋白激酶 (MEK)的抑制剂 ,通过检测PKC磷酸化水平、p44 /4 2丝裂原激活蛋白激酶 (p44 /4 2MAPKs)、HSP70表达量、细胞存活率 ,同时在透射电镜下观察肝细胞超微结构改变 ,研究缺氧预处理与HSP70表达的关系及HSP70表达的影响因素。对相关数据进行统计学处理。结果　和缺氧复氧组 (HR)比较 ,预处理组 (HP)和PKC激动剂组的HSP70和 p44 /4 2MAPKs的表达量显著增加 ,同时PKC磷酸化水平显著增高 ,三者分别为每分钟 (4 2 .63± 4.73 )、(10 9.42± 16.0 9)、(15 2 .47± 19.5 9)pmol/g(P均 <0 .0 1) ,肝细胞结构改变较小 ;和缺氧预处理组相比 ,PKC抑制剂组相应的观察指标呈相反的变化 ,PKC磷酸化活性显著降低 ,为每分钟 (65 .2 8± 5 .3 6) pmol/g(P <0 .0 1) ;MEK抑制剂组HSP70表达量和磷酸化激活的p44 /4 2MAPKs表达量降低 ,肝组织细胞结构出现较明显的改变。结论　效应保护蛋白HSP70在缺氧预处理中参与对肝细胞的保护 ,HSP70受到PKC介导p44 /4 2MAPKs信号通路的调控。PKC处在p44 /4 2MAPKs上游 ,PKC对 p44 /4 2MAPKs起正性调控作用 ;p44 /4 2MAP     

利多卡因对缺氧/复氧后肝细胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响

目的探讨利多卡因预处理对肝细胞缺氧/复氧后Bcl-2、Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法将体外培养的肝细胞分为三组:缺氧/复氧组(Ⅰ组)、利多卡因预处理组(Ⅱ组)和正常对照组(Ⅲ组),每组10份。检测肝细胞缺氧/复氧培养后细胞培养液中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)浓度,肝细胞Bcl-2、Caspase-3蛋白表达、肝细胞凋亡率及超微结构变化。结果Ⅰ、Ⅱ组细胞培养液中ALT、AST浓度、肝细胞Caspase-3蛋白表达和肝细胞凋亡率较Ⅲ组均升高(P<0.05),透射电镜示肝细胞损伤,可见凋亡细胞;Ⅱ组细胞复氧后培养液中ALT、AST浓度、肝细胞Caspase-3蛋白表达和细胞凋亡率均低于Ⅰ组(P<0.05),而肝细胞Bcl-2蛋白表达较Ⅰ组升高(P<0.05),透射电镜观察也显示Ⅱ组肝细胞比Ⅰ组损伤轻微。结论利多卡因预处理可以在一定程度上减轻缺氧/复氧后肝细胞损伤,降低细胞凋亡率,保护机制可能与Bcl-2、Caspase-3蛋白表达有关。     

大鼠神经干细胞缺氧后的内源性促红细胞生成素表达规律

[目的]观察神经干细胞缺氧后的内源性促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）表达规律，初步探讨缺氧预处理诱导神经保护作用的机制。[方法]测定大鼠神经干细胞缺氧培养4h后不同时间的内源性EPO表达情况，以及预处理后不同时间，再次遭受致死剂量缺氧伤害后的EPO表达情况。[结果]缺氧时间为4h，EPO蛋白在处理后即刻出现表达，4h达高峰，8h仍有部分表达。再次遭受致死剂量缺氧伤害后，与预处理4h组相比，预处理24h组细胞的EPO表达量明显增多。[结论]缺氧预处理能够提高神经干细胞应对伤害刺激时内源性EPO的表达，并降低再次缺氧时诱导EPO表达的阈值。     

缺血预处理对肝细胞缺血再灌氧损伤的影响

缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)作为一种简易可行的内源性保护措施对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用已有文献报道,但对IP抵抗缺血再灌注损伤的细胞分子机制,目前仍不明了。为此,我们通过体外原代培养的肝细胞,利用人工造成的缺氧和富氧环境,来研究缺氧预处理对肝细胞缺氧再灌氧损伤的影响,从而建立IP保护肝脏的体外实验模型。     

缬沙坦预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨缬沙坦预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制.方法:常规方法培养心肌细胞,培养72小时后,分为三组:正常对照组、心肌细胞缺氧/复氧损伤组、缬沙坦预处理后心肌细胞缺氧/复氧损伤组.分别观察心肌细胞结构,测定心肌细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)水平.结果:与对照组比心肌细胞缺氧/复氧损伤组细胞存活率明显下降、培养液中LDH、MDA含量明显增高,SOD含量明显下降;与心肌细胞缺氧/复氧损伤组比,缬沙坦预处理组心肌细胞存活率明显提高,培养液中LDH、MDA含量明显下降、S0D含量明显上升.结论缬沙坦通过抗氧化、抗脂质过氧化反应,清除氧自由基对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用.     

异氟醚对缺氧或复氧肝细胞能量平衡的保护作用

目的观察异氟醚对不同缺氧时间以及复氧后肝细胞能量平衡的保护作用。方法将新鲜分离肝细胞置于krebs缓冲液中,密封容器中通人O2／CO2或N2／CO2(95％：5％)制造有氧或缺氧环境,加或不加异氟醚。实验分六组：有氧组、有氧加异氟醚组、缺氧组、缺氧加异氟醚组、缺氧后复氧组、缺氧后复氧加异氟醚组,观察配对各组用异氟醚后的变化。用高效液相技术测肝细胞内ATP、ADP、AMP水平并计算总腺苷酸和反映ATP供需平衡的能荷(=[ATP 1／2ADP]／[ATP ADP AMP])。结果(1)缺氧30min肝细胞中能荷、ATP的下降与AMP的升高被异氟醚部分逆转,而被复氧完全逆转。(2)缺氧90min肝细胞能荷、总腺苷酸明显下降,复氧可部分提高能荷而不提高总腺苷酸,异氟醚对缺氧和复氧期间的能荷、总腺苷酸均有部分逆转作用。结论临床当量的异氟醚对长期和短期缺氧肝细胞均有能量保护作用,并有效改善复氧后的能量失衡状况。     

果糖在微囊化肝细胞制作过程中的细胞保护作用

目的 为了减少肝细胞在微囊化过程中的缺氧损伤,研究在缺氧状态下果糖对肝细胞的保护作用。方法 将ＳＤ大鼠分为三组;Ａ组,细胞分离的灌流液和消化液中均加果糖２０ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｂ,Ｃ两组不加果糖;细胞分离及微囊化后,检测细胞的活率,微囊化肝细胞体外培养,Ｃ组培养液中加果糖１０ｍｍｏｌ／Ｌ,Ａ,Ｂ两组不加。     

大鼠肝细胞低氧预处理后蛋白质分子的二维电泳实验研究

目的 利用二维电泳技术对大鼠肝细胞蛋白进行分离,以进一步探讨低氧预处理保护肝细胞的机制.方法 将原代培养的肝细胞分成对照组和低氧预处理组,用固相化pH梯度等电聚焦的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术展示并比较两组细胞表达的所有蛋白质,银染法显示两组细胞差异表达的蛋白质分子.结果 两组肝细胞的蛋白质图谱分别可分辨出约260个蛋白点,绝大多数蛋白点在位置、大小和形状上几乎一致.对照组和预处理组间有11个明显差异的蛋白点,初步确定其等电点和分子量.其中5个蛋白质点仅在对照组中表达,而在预处理组中未出现;6个蛋白质点在预处理组中表达,而在对照组中未出现.结论 二维电泳可以对肝细胞蛋白进行较精确的分离;低氧预处理引起肝细胞蛋白质分子的改变,在预处理组中新增加的蛋白质分子可能与细胞耐受低氧有关.     

二氮嗪预处理对大鼠海马神经细胞缺氧复氧损伤的影响

缺血预处理(IPC)被认为是所能得到的最强的心肌内源性保护之一。研究表明，这种奇异的预处理保护还存在于神经组织。本研究拟采用原代培养海马神经元的离体模型，排除活体状态下复杂的多因素(如血管、侧支循环、血液、血压、体温以及周围环境等)干扰，直接观察KATP通道开放剂二氮嗪对细胞缺氧复氧损伤的影响。     

缺血预处理对骨骼肌再灌注损伤保护作用研究进展

研究发现缺血预处理可调动机体内源性保护机制,明显提高组织细胞自身对缺血缺氧的耐受能力。本文就缺血预处理对骨骼肌再灌注损伤保护作用及其作用机制的研究进展作了综述。     

异氟醚预处理改善大鼠海马脑片缺氧损伤

目的以大鼠海马脑片为研究对象,采用微电极记录技术,观察异氟醚预处理对海马脑片缺氧损伤后顺向群锋电位(OPS)以及缺氧损伤电位(HIP)的影响。方法 SD大鼠60只,随机均分为五组:空白对照组(C组);实验对照组(EC组);异氟醚预处理组(IP组);iNOS阻断剂氨基胍(AG)组(AG组);异氟醚预处理+iNOS阻断剂组(IPAG组)。IP组给予3h异氟醚预处理,AG组给予iNOS阻断剂处理,IPAG组给予3h异氟醚预处理,同时给予iNOS阻断剂,取脑片后分别给予14min的缺氧处理,观察不同处理对海马脑片OPS恢复以及HIP的不同效应。结果 IP组的OPS的恢复程度、恢复率明显高于C组、EC组、AG组和IPAG组(P<0.05),IP组HIP持续时间明显长于C组、EC组、AG组和IPAG组(P<0.05),HIP的出现时间五组差异无统计学意义。结论异氟醚预处理可明显减轻海马脑片缺氧损伤;用iNOS阻断剂可去除这种保护作用,证明这种预处理作用与异氟醚预处理产生的iNOS有关。     

地氟醚、七氟醚和异氟醚预处理对缺氧/复氧心肌细胞损害的保护作用

目的　研究地氟醚、七氟醚和异氟醚预处理对心肌细胞缺氧／复氧损害的保护作用。方法　原代培养乳鼠心肌细胞，随机分为对照、单纯缺氧／复氧及 １．５ＭＡＣ地氟醚、七氟醚和异氟醚预处理５组。实验结束测定乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）和肌酸激酶（ＣＫ）活性、细胞存活和凋亡率。结果　与对照组比，单纯缺氧／复氧使ＬＤＨ、ＣＫ和细胞凋亡率升高及细胞存活率显著下降（Ｐ＜０．０１）；１．５ＭＡＣ地氟醚、七氟醚和异氟醚预处理显著减轻ＬＤＨ、ＣＫ和细胞凋亡率升高及细胞存活率下降，其中七氟醚减轻作用最强。结论　地氟醚、七氟醚和异氟醚预处理对心肌细胞缺氧／复氧损害有一定的保护作用，七氟醚的保护作用可能更强。     

PE P-1-血红素加氧酶-1融合蛋白预处理对L02肝细胞缺氧复氧损伤的影响

目的：评价细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶-1（HO-1）预处理对L02肝细胞缺氧复氧损伤的影响。方法利用基因工程手段表达和纯化融合蛋白PEP-1-HO-1（PEP-1-heme oxy-genase-1,PEP-1-HO-1）。使用人肝细胞株（HL-7702）建立培养人肝细胞缺氧复氧模型。按实验需要以10％新生牛血清的DMEM液静置培养L02肝细胞,将细胞进行随机分为7组：A组,正常对照组（常规培养）;B组,缺氧复氧组（缺氧复氧组细胞缺氧18 h,复氧6 h）;C组,PEP-1-HO-1预处理组,按PEP-1-HO-1浓度分为5亚组（C1,0．125μmol/L;C2,0．25μmol/L ;C3,0．5μmol/L;C4,1．0μmol/L;C5,2．0μmol/L,缺氧前以PEP-1-HO-1融合蛋白预处理2 h,缺氧18 h,复氧6 h）。复氧结束后,收集各组细胞及培养液上清,检测MDA、LDH、AST、ALT含量及SOD活性。结果缺氧复氧组较正常对照组相比,MDA、LDH、AST及ALT水平明显升高（P＜0．05）,而 SOD 水平下降（P＜0．05）;PEP-1-HO-1预处理组与缺氧复氧组相比,预处理组能明显降低MDA、LDH、AST及ALT水平（P＜0．05）,使得SOD水平上升（P＜0．05）,且在一定浓度下与剂量呈正相关。结论 PEP-1-HO-1融合蛋白预处理可减轻细胞缺氧复氧损伤。     

不同缺氧条件下大鼠肝细胞能量代谢变化

目的：观察缺氧对大鼠肝细胞能量代谢的影响。方法：利用体外培养的肝细胞缺氧模型，模拟创伤后的缺血、缺氧环境，以正常生长的大鼠肝细胞为对照，采用生物化学的方法，分析氧的不同浓度及缺氧时间下肝细胞内ATP、ADP、AMP以及能荷的变化。结果：与正常对照组相比，缺氧肝细胞内ATP含量下降，4h达到最低水平，以后逐渐回升，其中O2浓度为15%组16h与正常对照无显性差异。ADP和AMP的变化与ATP相反，与正常对照相比，缺氧后水平增高，4h达到高峰，以后逐渐下降，16h仍未能完全恢复正常水平。能荷及ATP/ADP比值的变化与AMP相似。结论：缺氧后肝细胞能量代谢明显受到影响，呈现出双相变化的趋势，ATP和能荷水平先降低，后增高。     

缺氧诱导肝癌细胞释放高迁移率族蛋白B1及其机制

目的 探讨缺氧对肝癌细胞高迁移率族蛋白B1(HMGB1)释放的诱导作用及其机制.方法 采用正常肝细胞株QSG-7701和肝癌细胞株SMMC-7721,观察缺氧(1％O2)培养3～24h后对HMGB1胞外释放、HMGB1基因表达和HMGB1胞内分布的影响,使用丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制剂探讨缺氧诱导HMGB1释放的机制.观察28例肝细胞癌患者血清HMGB1水平的改变.结果 肝细胞癌患者血清HMGB1水平[(19.3±7.2) μg/L]明显高于健康对照者[(4.1±1.6) μg/L,P＜0.01].QSG-7701和SMMC-7721细胞经缺氧培养后,3h即见培养上清液中HMGB1含量明显升高,HMGB1 mRNA表达于6h后显示增强,且SMMC-7721株改变更为显著.SMMC-7721细胞经缺氧培养12 h后,核浆HMGB1分布发生明显改变,胞质HMGB1蛋白表达量升高.SB203580、SP600125和PD98059对缺氧诱导HMGB1释放均显示不同程度的抑制作用.结论 缺氧能诱导肝癌细胞表达、释放HMGB1,其诱导HMGB1释放机制与MAPK信号通路有关.     

丙泊酚预处理或后处理对缺氧鼠脑神经元保护效应的研究

目的：制作缺氧鼠脑神经元缺氧反应的模型，采用丙泊酚进行预处理或后处理，观察比较两种方法的脑保护效应，从细胞水乎阐明丙泊酚的脑保护机制。方法：取培养12天的胎鼠大脑神经元，随机分为四组：①正常对照组；②缺氧组：置于37℃95％N2 5％CO2的环境中30min；③丙泊酚预处理组：于缺氧前60min换入含有14μmol／L和56μmol／L丙泊酚的培养液。随后缺氧30min④丙泊酚后处理组：于缺氧后即刻加入含有14μmol／L和56μmol／L丙泊酚的培养液，作用60min。三组在缺氧后1h、2h、4h、6h和24h分别采用MTT(改良四甲基偶氮唑盐)细胞酶学分析法、硝酸还原酶法和分光光度法，分组比较各组神经元神经细胞活力(OD值)、NO(一氧化氮)产量和NOS活性。结果：①缺氧30min可使神经细胞活力下降，NO产量增高，NOS活性增强；②用14μmol／L和56μmol／L丙泊酚预处理和后处理的缺氧鼠脑神经元，其神经细胞活力在复氧后各时段均增加，两浓度之间无显着性差异；③用14μmol／L和56μmol／L丙泊酚预处理缺氧鼠脑神经元，在复氧后的前4h细胞NO产量和NOS活性降低，两浓度之间无显着性差异，而用14μM和56μM丙泊酚后处理的缺氧鼠脑神经元，在复氧后的前4h，只有56μM丙泊酚组细胞NO产量和NOS活性降低，而14μM组与单纯缺氧组无显着性差异。结论：在缺氧条件下，用较低浓度丙泊酚预处理神经元，就可阻断缺氧造成的神经细胞损伤，保护时间窗延长至缺氧后4h，故可产生早期的神经保护作用。如果采用丙泊酚后处理的方法，则必须提高丙泊酚的浓度。丙泊酚早期的神经保护作用可能是通过降低NOS活性和抑制NOS合成而实现的。     

肝缺血预处理细胞保护效应中P44/42MAPKs信号通路的作用

缺血预处理肝脏保护作用机制的研究报道较少，P44／42丝裂原蛋白活化激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)信号通路是否参与缺血预处理肝脏保护作用尚未定论，为获得可为临床肝脏外科借鉴的资料，本实验拟建立肝细胞体内和体外的缺血(氧)预处理模型，对P44／42 MAPKs的作用进行初步的探讨。     

低温对二氮嗪预处理减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的作用

脑缺血再灌注损伤是一个多因素、多环节的恶性级联过程，针对不同环节发挥作用的保护措施联合应用比单一保护措施更有效。低温简单易行，安全范围大，是当前较为重要的脑保护措施，但低温并不能完全消除脑损伤。有研究表明，选择性线粒体内膜ATP敏感性钾通道（Mito-KATP）开放剂二氮嗪可减轻缺氧复氧性脑损伤。但低温对二氮嗪预处理减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的作用尚需进一步探讨。本研究拟观察低温对二氮嗪预处理减轻大鼠海马神经元缺氧复氧损伤的作用，为临床研究提供理论依据。     

急性缺血缺氧诱导肝癌细胞自噬及其相关机制

目的:研究急性缺血/缺氧时肝癌细胞HepG2增殖率及自噬的变化,探讨自噬的作用及机制。方法 :以Western印迹法检测缺氧诱导因子-1(hypoxia induced factor-1,HIF-1)表达并确定体外模拟模型的可靠性;吖啶橙染色后采用荧光显微镜定性观察自噬;以自噬特异性蛋白LC3及P62(P62/SQSTM1)信号蛋白的变化表明自噬的诱导和可能的调控机制;以CCK8检测3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬前后急性缺血/缺氧下HepG2细胞的增殖率变化。结果:急性缺血/缺氧2 h后,HepG2细胞显著表达HIF-1α蛋白,表明体外急性缺血/缺氧模型的可靠性。急性缺血/缺氧可快速诱导肝癌细胞HepG2产生自噬,继而出现HepG2细胞显著增殖活跃;3-MA抑制自噬后,可特异性抑制急性缺血/缺氧所诱导的HepG2细胞增殖;急性缺血/缺氧条件下HepG2细胞P62信号蛋白表达显著下调,自噬抑制后逐渐恢复正常表达水平。结论:自噬在肝癌体外急性缺血/缺氧过程中对肿瘤起到保护作用,其机制可能与P62蛋白的清除有关;抑制自噬可显著降低肝癌细胞增殖率。自噬可能成为肝癌治疗的新靶点。     

异丙酚预处理对乳鼠肝细胞氧-糖缺失/恢复时凋亡的影响

目的探讨异丙酚预处理对乳鼠肝细胞氧-糖缺失/恢复时凋亡的影响及其机制。方法出生1～3 d健康SD乳鼠30只、体重7～11 g,雌雄不拘,提取乳鼠肝细胞,用10%胎牛血清的高糖DMEM培养基孵育6 d后,随机分为5组（n=6）,空白对照组（C组）;单纯氧-糖缺失/恢复组（O组）建立氧-糖缺失/恢复模型;不同浓度异丙酚预处理组（P25组、P50组、P100组）分别用含终末浓度为25、50、100μmol/L的异丙酚培养液预处理后建立氧-糖缺失/恢复模型。观察肝细胞凋亡情况,采用免疫组织化学方法测定肝细胞Bcl-2蛋白、p53蛋白的表达。结果与C组比较,O组、P25组、P50组、P100组的肝细胞凋亡率增加,Bcl-2蛋白表达下调,p53蛋白表达上调;与O组比较,P25组、P50组、P100组的肝细胞凋亡率降低,Bcl-2蛋白表达上调,p53蛋白表达下调（P〈0.01）,且呈浓度依赖性。结论异丙酚25、50、100μmol/L预处理对氧-糖缺失/恢复的乳鼠肝细胞具有保护作用,且呈浓度依赖性,其机制可能与下调p53蛋白的表达和上调Bcl-2蛋白的表达有关。