HLA-G突变分子对NK细胞抑制作用的研究

目的探索可溶性HLAG1分子结构对功能的影响,为其临床应用打下基础。方法通过分子克隆技术,去掉HLAG1重链分子α1功能区氨基端24肽,然后与轻链蛋白在体外与九肽共折叠复性形成复合物,并检测复合物对NK细胞杀伤活性的影响。结果成功构建突变的HLAG1重链分子的原核表达载体,表达的重链蛋白与轻链蛋白形成复合物,经Westernblot鉴定可与HLAⅠ类分子的单抗W6/32结合,并且可明显抑制NK细胞对K562细胞的细胞毒作用。结论α1功能区氨基端缺失24肽的HLAG1分子,可抑制NK细胞的细胞毒作用。     

HLA 基因复合体与传染病的发病机理

HLA 复合体为位于人第6号染色体短臂上的基因群,其编码分子在细胞表面,对抗原物质的自我—非我识别有重要性(图1):细胞表面分子有两类:一类由 HLA—A、HLA—B 和 HLA—C 基因决定的称Ⅰ类分子,它是由分子量45,000的重链非共价地联结分子量12,000的轻链即β_2微球蛋白而组成。HLA—A、HLA—B 和 HLA—C 位点构成Ⅰ类重链基因,而β_2微球蛋白的编码受控于第15染色体。Ⅰ类分子的作用与识别靶细胞有关,它存在于 T 细胞亚类,常用表面标记 T(?)表示,这样的细胞通常与抑制性 T 细胞和细胞毒性 T 细胞(包括杀伤病毒感染的靶细胞)     

野生型p53对胃癌细胞系的生长抑制作用

目的：观察野生型p53对胃癌细胞系的生长抑制作用。方法：以逆转录病毒为载体将野生型p53基因导入胃癌细胞系MKN28和BGC823，检测p53对肿瘤细胞的影响。结果：p53在转染细胞中表达水平提高。外源性p53的导入使肿瘤细胞增殖细胞核抗原（PCNA）水平明显降低；G0／G1期细胞数增加，S期降低。转染p53基因的MKN28细胞探鼠体内成瘤能力明显下降。结论：野生型p53基因参与调节DNA复制及细胞周期，抑制癌细胞过度增殖。     

印迹基因PEG10在胃腺癌组织中的表达及意义

目的：研究印迹基因PEG10在胃癌及癌旁组织中的表达情况,探讨其对胃癌细胞生长的影响。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测40例胃癌、癌旁组织及6例正常胃组织中印迹基因PEG10 mRNA表达;构建表达PEG10质粒,并将其转染到不表达内源性PEG10的胃癌细胞系MKN45中,应用噻唑蓝比色分析法（MTT）,测定转染PEG10后MKN45细胞的生长情况。结果：20例胃癌组织中9例（45.0%）PEG10表达阳性,对应的癌旁组织仅有2例（10.0%）表达阳性,2组间PEG10表达率比较差异有显著性(Ｐ<0.05),正常胃组织无PEG10表达;胃癌细胞系MKN45无内源性PEG10表达,经质粒转染PEG10基因后的MKN45细胞的生长速度加快。结论：印迹基因PEG10在胃癌组织中高表达,具有促进胃癌细胞生长的作用。     

nm23H1和S100A4mRNA表达与胃癌细胞体外侵袭力的关系

目的探讨S100A4、nm23H1基因mRNA表达与胃癌细胞体外侵袭力的关系.方法采用Boyden小室法测定4种胃癌细胞系MKN1、MKN45、GT3TKB、BGC823的体外侵袭力,RT-PCR检测4种细胞系的S100A4和nm23H1mRNA表达水平.结果胃癌细胞体外侵袭力高低的顺序依次为MKN45最高,BGC823、MKN1次之(二者无显著差异),GT3TKB最低(P<0.001).nm23H1、S100A4基因mRNA各自表达与胃癌细胞体外侵袭力无明显关系.nm23H1/S100A4mRNA相关表达水平的顺序依次为GT3TKB最高,BGC823和MKN1次之(二者无显著差异,P>0.05)、MKN45最低(P<0.001),其相关表达与胃癌细胞体外侵袭力呈反比关系.结论nm23H1/S100A4mRNA的相关表达在评价胃癌细胞体外侵袭力方面具有重要价值.     

siRNA靶向抑制ATDC蛋白对胃癌细胞生物学行为的影响

目的通过比较ataxia—telangiectasiagroupDcomplementinggene（ATDC）在永生化胃黏膜细胞GES与胃癌细胞系MNK45、AGS中的表达差异,探讨其对胃癌细胞生长、增殖及侵袭能力的影响。方法应用Westernblot实验检测ATDC在胃癌细胞系MKN45、AGS及永生化胃黏膜细胞系GES表达差异,利用慢病毒携带的siRNA下调ATDC在MKN45细胞表达水平,采用MTT实验检测细胞生长能力、流式细胞术检测细胞周期、平板克隆实验检测细胞克隆形成能力以及transwell实验检测细胞侵袭能力。结果ATDC在人胃癌细胞系MKN45与AGS细胞中的表达水平均明显高于永生化胃黏膜细胞GES（均P〈0．05）;转染siRNA慢病毒后,与Con—MKN45及MKN45比较,Si—MKN45细胞的表达水平明显下降（P〈0．05）：下调ATDC表达后MKN45细胞的生长能力明显受到抑制（P〈0．05）,S期细胞明显减少、增殖指数克隆形成率及侵袭能力均明显降低（均P〈005）。结论慢病毒携带的siRNA下调ATDC表达后能够抑制胃癌细胞MKN45的生长、增殖与侵袭能力,可为胃癌的基因治疗提供新的靶点。     

启动子甲基化致OPCML基因失活在胃癌发病中的作用

目的探讨OPCML基因在胃癌细胞株中的失表达及其与基因启动子CpG岛甲基化的关系,并分析OPCML对胃癌细胞增殖的影响。方法 (1)实验组为胃癌细胞株(SGC7901、AGS、MKN28、MKN45、N87、KATOⅢ和SNU1),对照组为正常胃组织,分别采用RT-PCR检测两组细胞OPCML mRNA的表达。(2)用亚硫酸盐修饰正常胃组织的DNA和胃癌细胞MKN45的DNA,分别采用甲基化特异性PCR法检测OPCML基因启动子区甲基化情况。(3)实验组为药物处理组,即5-氮胞苷(5-AZA)去甲基化处理胃癌细胞MKN45,对照组为未经药物处理的MKN45,分别采用RT-PCR检测OPCML mRNA的表达变化。(4)RT-PCR检测转染OPCML表达载体及pcDNA3.1空载体后mRNA的表达情况。(5)实验组为OPCML表达载体转染胃癌细胞AGS,对照组为空载体转染胃癌细胞AGS,使用浓度为0.5 mg/mL的新霉素(G418)对转染细胞进行筛选,观察OPCML对胃癌细胞AGS集落形成的影响。结果 (1)在胃癌细胞株中OPCML mRNA的表达率显著低于正常胃组织。(2)胃癌细胞AGS和MKN45的甲基化程度明显高于正常胃组织。(3)5-AZA处理MKN45细胞后,OPCML表达上调。(4)OPCML表达载体转染HEK293A、AGS、MKN45细胞后,RT-PCR检测显示OPCML高表达。(5)外源性表达OPCML可抑制胃癌细胞AGS的集落形成率。结论 OPCML基因作为肿瘤抑制基因,在胃癌细胞中的表达下调。OPCML表达下调与该基因启动子区甲基化密切相关。药物性去甲基化处理能够恢复OPCML的表达。在表达沉默的AGS细胞中外源性表达OPCML,抑制集落形成率。     

中国恒河猴Mamu-B*1703/EGFP在K562和B16细胞中的表达及分布

目的分析恒河猴主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子重链的亚细胞分布,建立适于体外研究恒河猴MHCⅠ类分子表达和抗原呈递功能的细胞系。方法将含Mamu-B*1703重链基因真核表达载体pEGFP-N1分别转染K562和B16细胞,细胞收集后以W6/32单克隆抗体或抗Mamu-B*1703抗血清及PE标记二抗染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析Mamu-B*1703复合体在细胞内和细胞表面的表达。结果在K562和B16细胞的细胞质内均可观察到与Mamu-B*1703重链基因融合表达的绿色荧光蛋白激发后的绿色荧光,即2种细胞均可表达外源Mamu-B*1703重链分子;但通过藻红蛋白标记的抗MHCⅠ类分子复合体抗体染色显示,Mamu-B*1703复合体仅表达于K562细胞表面,而不表达于B16细胞表面。结论Mamu-B*1703重链可与人K562细胞而不能与小鼠B16细胞内的βm轻链结合组装成复合体,表达于细胞表面,提示研究恒河猴的MHCⅠ分子表达应利用人类的细胞株。     

人β2m基因的克隆及表达

目的 克隆和表达HLA Ⅰ类分子轻链(β2m)基因，为人工制备HLA Ⅰ类分子提供基础。方法 利用逆转录PCR技术从Jeg-3细胞株中克隆β2m基因，与质粒pET22b( )重组，构建原核表达载体pET22b( )-β2m，转化宿主菌E．coli BL2l(DE3)，诱导β2m基因高效表达，并采用双抗体夹心ELISA法对表达产物进行抗原性和功能鉴定。结果 酶切和测序证实β2m基因克隆和载体构建成功，目的蛋白在宿主菌中高效表达于包涵体中；通过包涵体的分离和纯化获得初步纯化的β2m，所制备的β2m能够与特异性抗体结合，并能与HLA 0281类分子重链形成具有天然构象的HLA 0281类分子。结论 人β2m基因能够在原核宿主中高效表达，表达产物具有形成HLA Ⅰ类分子的功能。     

Promoter methylation-induced OPCML expression silence in progression of gastric cancer

目的 探讨OPCML基因在胃癌细胞株中的失表达及其与基因启动子CpG岛甲基化的关系,并分析OPCML对胃癌细胞增殖的影响.方法 (1)实验组为胃癌细胞株(SGC7901、AGS、MKN28、MKN45、N87、KATOⅢ和SNU1),对照组为正常胃组织,分别采用RT-PCR检测两组细胞OPCML mRNA的表达.(2)用亚硫酸盐修饰正常胃组织的DNA和胃癌细胞MKN45的DNA,分别采用甲基化特异性PCR法检测OPCML基因启动子区甲基化情况.(3)实验组为药物处理组,即5-氮胞苷(5-AZA)去甲基化处理胃癌细胞MKN45,对照组为未经药物处理的MKN45,分别采用RT-PCR检测OPCML mRNA的表达变化.(4)RT-PCR检测转染OPCML表达载体及pcDNA3.1空载体后mRNA的表达情况.(5)实验组为OPCML表达载体转染胃癌细胞AGS,对照组为空载体转染胃癌细胞AGS,使用浓度为0.5 mg/mL的新霉素(G418)对转染细胞进行筛选,观察OPCML对胃癌细胞AGS集落形成的影响.结果 (1)在胃癌细胞株中OPCML mRNA 的表达率显著低于正常胃组织.(2)胃癌细胞AGS和MKN45的甲基化程度明显高于正常胃组织.(3)5-AZA处理MKN45细胞后,OPCML表达上调.(4)OPCML表达载体转染HEK293A、AGS、MKN45细胞后,RT-PCR检测显示OPCML高表达.(5)外源性表达OPCML可抑制胃癌细胞AGS的集落形成率.结论 OPCML基因作为肿瘤抑制基因,在胃癌细胞中的表达下调.OPCML表达下调与该基因启动子区甲基化密切相关.药物性去甲基化处理能够恢复OPCML的表达.在表达沉默的AGS细胞中外源性表达OPCML,抑制集落形成率.     

重组PinX1真核表达载体的构建及其对胃癌MKN28细胞增殖的抑制作用

目的 探讨PinX1基因对胃癌MKN28细胞生长及周期的作用,初步探讨该基因用于胃癌治疗方面的可能性.方法 构建重组PinX1真核表达载体,酶切及测序鉴定无误后,应用脂质体转染法转染入胃癌MKN28细胞,建立稳定转染PinX1基因的MKN28细胞系;应用Western blot技术从蛋白水平检测转染前后目标蛋白PinX1的改变;MTT法检测转染前后细胞生长曲线的变化;流式细胞仪检测转染目的 基因后细胞生长周期的改变.结果 成功构建重组PinX1真核表达载体;建立了稳定转染入PinX1基因的胃癌MKN28细胞系;转染PinX1基因后,胃癌细胞细胞生长明显减缓(P＜0.05),增殖变慢(P＜0.05),细胞生长阻滞于G0/G1期.结论 PinX1基因可抑制胃癌MKN28细胞的生长和增殖.     

ZNF139通过抑制miR-181a-5p增加胃癌细胞耐药性的机制

目的:探讨ZNF139通过抑制miR-181a-5p表达增加胃癌细胞耐药性的机制.方法:检测ZNF139和miR-181a-5p在胃癌组织和细胞系中的表达情况,ZNF139-siRNA、miR-181a-5p模拟物或pcDNA-ZNF139转染MKN45、MKN45/ADR细胞系.MTT法测定细胞活性,Real-time PCR和Western blot分别检测ZNF139、miR-181a-5p和P-gp、GST-π、MRP-1、Bcl-2、TS和Bax等耐药相关基因mRNA和蛋白表达水平.ChIP和双荧光素酶活性试验验证ZNF139、miR-181a-5p之间的调控作用.结果:ZNF139 mRNA和蛋白相对表达量在胃癌组织和细胞系较癌旁组织升高(P<0.05),miR-181a-5p mRNA相对表达量降低(P<0.05).转染ZNF139-siRNA后,MKN45/ADR细胞中miR-181a-5p mRNA表达升高,化疗药物阿霉素(ADR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、奥沙利铂(L-OHP)处理后,MKN45/ADR细胞存活率降低(P<0.05).MKN45细胞系转染pcDNA-ZNF139后,ZNF139 mRNA和蛋白表达水平升高,miR-181a-5p mRNA表达水平下降,同时细胞对ADR、5-FU、L-OHP的耐药性增强(P<0.05).双荧光素酶活性试验表明,ZNF139抑制了miR-181a-5p启动子的转录活性(P<0.05).抑制ZNF139可降低MKN45/ADR细胞中P-gp、MRP-1、Bcl-2的表达(P<0.05);miR-181a-5p模拟物转染MKN45/ADR细胞后,P-gp、LRP和Bcl-2的表达降低(P<0.05).结论:ZNF139通过抑制-miR-181a-5p诱导胃癌中P-gp、MRP-1和Bcl-2的表达来增加细胞的耐药特性,有望成为防治胃癌细胞耐药的新的策略.     

PinX1在胃癌中的表达及其对胃癌细胞生物学行为的影响

目的 探索PinX1基因在胃癌中的表达情况,并观察PinX1表达水平改变对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。 方法 通过PinX1质粒转染及RNAi干扰技术,分别上调和下调胃癌细胞中的PinX1基因表达水平,然后运用Western Blot技术在蛋白水平检测正常胃癌细胞、PinX1基因上调组和PinX1基因敲低组胃癌细胞目标蛋白PinX1的表达情况,并通过CCK8法检测不同处理组胃癌细胞增殖曲线。选取36对胃癌组织和癌旁正常胃黏膜的组织,检测PinX1的表达情况并计算其与肿瘤分期之间的相关性。采用SPSS软件进行统计分析并绘制统计图。 结果 胃癌细胞系SGC7901及MKN28中PinX1的表达水平低于正常胃黏膜细胞株GES-1中PinX1的表达水平,PinX1基因在MKN28转染组胃癌细胞较正常MKN28细胞中表达上调,MKN28胃癌细胞生长速度相应的减缓(P＜0.05),而干扰组胃癌细胞PinX1基因表达下调,SGC7901胃癌细胞生长速度相应的增快(P＜0.05)。PinX1在胃癌组织中的表达率低于癌旁组织的表达率(P＜0.05),且PinX1表达水平与胃癌T分期呈现出一定的相关性。 结论 PinX1在胃癌组织和胃癌细胞中低表达并负性调控胃癌细胞恶性生物学行为。      

低密度脂蛋白受体LDLR基因在胃癌中的表达及意义

目的 检测低密度脂蛋白受体LDLR在胃癌肿瘤细胞系和组织中基因水平的表达,并探讨其与胃癌的相关性.方法 利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测7株胃癌细胞系及其56对胃癌组织和癌旁配对组织中LDLR基因的mRNA水平表达状况.并对所得数据做相关性研究分析.结果 LDLR在7株胃癌细胞系的mRNA水平均有表达且有差异,其中N87、MKN45表达较高.LDLR在56对胃癌和癌旁配对组织中的mRNA水平表达有差异,肿瘤组织表达水平71.4％ （40/56）,高于癌旁配对组织39.3％ （22/56）,差异有显著性（P＜0.01）.结论 LDLR基因在不同胃癌细胞系和胃癌组织中高表达,且胃癌肿瘤组织表达高于癌旁组织,提示低密度脂蛋白受体LDLR基因表达与胃癌相关.     

O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在顺铂激活的胃癌细胞自噬中的作用

目的 探讨DNA修复酶O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)在顺铂(cisplatin)激活的胃癌SGC-7901细胞自噬中的作用.方法 Western blot法检测自噬底物蛋白p62水平、自噬标志分子Ⅱ型和Ⅰ型微管相关蛋白轻链3(mircotuble-associated protein light chain 3,LC3)的比值变化、MGMT蛋白水平;GFP-LC3表达质粒转染胃癌SGC-7901细胞后用激光共聚焦显微镜观察顺铂对细胞自噬小体形成的影响.qRT-PCR法检测MGMT基因mRNA表达水平.结果 顺铂剂量依赖性激活胃癌SGC-7901细胞自噬水平,显著增加SGC-7901细胞中自噬小体数量;MGMT mRNA及蛋白水平随顺铂浓度的增加而降低(P＜0.05);过表达MGMT抑制胃癌SGC-7901细胞的基础自噬水平;过表达MGMT抑制顺铂激活的胃癌SGC-7901细胞自噬.结论 DNA修复酶O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抑制顺铂激活的胃癌SGC-7901细胞自噬.     

特异性siRNA抑制HPV16 E7基因表达的实验研究

目的筛选针对HPV16 E7基因有效的siRNA,探讨其对HaCaT E7 细胞中HPV16 E7 mRNA及细胞表面HLA Ⅰ类分子表达的影响。方法采用化学法合成3条HPV16 E7特异性siRNA,应用转染试剂Lipofectamine2000将其转染入HaCaT E7细胞,采用实时荧光定量PCR（RT PCR）检测HPV16 E7 mRNA的表达,采用流式细胞术（FCM）检测细胞表面HLA Ⅰ类分子的表达。结果3条siRNA均能有效抑制HaCaT E7细胞中HPV16 E7的转录表达,以siRNA2作用效果最明显,抑制率达75%,细胞膜表面HLA Ⅰ类分子的表达明显上调,平均荧光强度(MFI)为130.18±1.07,高于空转染对照组（100.32±3.01）和非特异性siRNA对照组（100.82±2.87）。 结论化学合成的HPV16 E7特异性siRNA能有效抑制HaCaT E7细胞中E7 mRNA的表达,同时使细胞表面HLA Ⅰ类分子表达上调。     

TAP基因转染提高其在肿瘤细胞系的表达

目的　筛选TAP1、TAP2表达下调的肿瘤细胞系 ,将TAP1、TAP2基因分别转染其表达下调的肿瘤细胞系 ,检测基因转染后的mRNA表达水平。方法　用RT -PCR方法检测肺腺癌细胞系Anip 973,AGZY83a ,LH - 7,BE - 1,胃癌细胞系BGC - 82 3TAP1及TAP2mRNA水平 ,筛选TAP1、TAP2表达下调的肿瘤细胞系。用脂质体法 (LipofectaminTM2 0 0 0 )将TAP1、TAP2分别转染人肺腺癌细胞系Anip 973,经G4 18筛选 4～ 6周 ,通过RT -PCR检测TAP1及TAP2的表达。结果　Anip 973,AGZY 83a细胞TAP1、TAP2mRNA表达下调 ,LH - 7,BE - 1TAP1PCR产物均为 2条带 ,BE - 1TAP 2mRNA表达下调 ,而LH - 7与B细胞相同。转染后的Anip 973细胞TAP1、TAP2的mRNA表达明显增加。结论　基因转染可恢复肿瘤细胞TAP1及TAP2的表达 ,为增强MHCⅠ类分子提呈肿瘤抗原奠定了基础     

鼠抗CD4抗体轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

为获得鼠抗人T细胞分化抗原4分子单抗的轻链及重链可变区基因。采用RT－PCR技术，从WuT4细胞总RNA中扩增出轻链和重链可变区基因，进行克隆并作核苷酸序列分析，发现RT－PCR扩增出来的两条轻链和一条重链可变区基因分别为400bp左右，构建的pMD18T-VL和pMD18T-VH重组克隆载体，酶切与预期结果相符。测序得到它们的DNA序列。结果表明，克隆的两条轻链可变区基因序列一致，长度均为324bp，属于鼠轻链Ⅳ亚类。克隆的重链可变区基因长度为375bp，属于鼠重链Ⅱ(C)亚类。     

MHCⅡ类反式激活因子在上调HepG2细胞HLAⅡ类分子表达中的作用

目的探讨主要组织相容性复合物(major histocom patibility complex,MHC)Ⅱ类反式激活因子(classⅡtrans-activator,CⅡTA)在调控HepG2细胞HLAⅡ类分子表达中的作用。方法将含CⅡTAcDNA的真核表达载体EBS-NPL-CⅡTA和不含CⅡTAcDNA的空载体EBS-NPL分别转染至HepG2细胞。用RT-PCR技术检测未经转染的HepG2细胞、转染EBS-NPL-CⅡTA及空载体EBS-NPL的HepG2细胞CⅡTA mRNA的表达,并用间接细胞免疫荧光技术及流式细胞技术检测其3种HLAⅡ类分子(HLA-DR、DP、DQ)的表达。结果未经转染的HepG2细胞和转染空载体EBS-NPL的HepG2细胞均无CⅡTA mRNA和HLAⅡ类分子的表达。转染EBS-NPL-CⅡTA后的HepG2细胞出现CⅡTA mRNA表达,并表达3种HLAⅡ类分子。结论CⅡTA是调控HepG2细胞是否表达HLAⅡ类分子的关键因子,HepG2细胞不表达HLA-Ⅱ类分子与其缺乏CⅡTA表达有关,为进一步研究CⅡTA在肝癌治疗中的作用奠定基础。     

LIVIN基因调控胃癌细胞增殖及凋亡

目的 评估LIVIN基因在不同人胃癌细胞系中的表达,并研究抑制LIVIN基因表达对胃癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 通过Western Blot检测多个胃癌细胞系中LIVIN基因的表达,筛选出高表达的细胞系.设计并合成针对LIVIN的siRNA(siLIVIN),转染胃癌细胞,分析其细胞增殖和凋亡的影响.结果 Western Blot 表明MKN45细胞中LIVIN基因高表达.设计合成的siRNA转染MKN45细胞后能显著沉默LIVIN基因的表达.克隆形成实验表明siLIVIN对MKN45细胞的抑制率为63.53％(P＜0.05);MTT实验表明siLIVIN对MKN45细胞的抑制率72h为47.36％(P＜0.05).TUNEL检测表明siLIVIN能引起(34.62±3.21)％(P＜0.05)的细胞凋亡率.Western Blot结果表明siLIVIN能抑制抗凋亡蛋白JNK的表达和活化.结论 LIVIN在MKN45细胞中能显著促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,LIVIN可能是一个潜在的胃癌基因治疗靶点.