骨形态发生蛋白-4对肝干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白-4(BMP-4)对大鼠肝干细胞系WB-F344的增殖及分化的影响.方法:采用50 ng/mL的基因重组BMP-4作用于WB-F344细胞,以BMP-4拮抗剂Noggin(200 ng/mL)阻断BMP-4的作用为对照.在实验不同时间点,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测BMP-4对WB-F...     

丁酸钠体外诱导大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞分化为胆管上皮细胞

目的:观察不同浓度丁酸钠对大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞生长、分化的影响,探讨丁酸钠体外诱导WB-F344细胞分化为胆管上皮细胞的条件及分化规律.方法:不同浓度丁酸钠(0.75、2.25、3.75、4.5 mmol/L)作用于WB-F344细胞(丁酸钠处理组),观察细胞形态学的变化,MTT法检测细胞生长情况,3.75 mmol/L丁酸钠作用WB-F344细胞后,免疫组化观察细胞角蛋白19(CK19)蛋白表达的变化;RT-PCR观察CK19、β4-整合蛋白、γ-谷胺酰转肽酶(GGT)以及甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB) mRNA表达的变化.以同期常规培养未作处理的WB-F344细胞作为空白对照组.结果:丁酸钠处理后,各组WB-F344细胞生长均受到抑制,3.75、4.5 mmol/L丁酸钠处理组光密度值明显低于空白对照组(P＜0.01),而0.75、2.25 mmol/L组与空白对照组无明显差异;3.75、4.5 mmol/L丁酸钠诱导后细胞变大变圆,细胞核增大,核质比减小,而0.75、2.25 mmol/L组细胞形态无显著变化.3.75 mmol/L丁酸钠处理组WB-F344细胞CK19阳性率为(92.3±1.1)%,明显高于空白对照组(1.3±0.2)%(P＜0.01).3.75 mmol/L丁酸钠处理组可见β4-integrin表达,而空白对照组未见表达;GGT、CK19表达较空白对照组增强;空白对照组见AFP表达,而3.75 mmol/L丁酸钠处理组未见表达;ALB在两组均未见表达.结论:3.75 mmol/L丁酸钠适合体外诱导大鼠肝卵圆细胞系WB-F344细胞向胆管上皮细胞分化.     

外源性和内源性结缔组织生长因子对大鼠肝脏前体细胞分化的影响

目的肝脏前体细胞(WB-F344)在不同的刺激下可以分化成肝细胞或胆管细胞。本研究旨在比较外源性和内源性结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对WB-F344细胞分化的影响。方法重组人CTGF直接刺激WB-F344细胞,MTT法观察CTGF对WB-F344细胞活性的影响;用Western blotting方法检测CTGF对WB-F344细胞分化的影响:包括肝系标志物甲胎蛋白(α-feto protein,AFP)、白蛋白和胆系标志物细胞角蛋白-19(CK-19)蛋白水平的变化。构建含CTGF全长编码基因的质粒(dl6-96-CTGF)转染WB-F344细胞,用G418筛选稳定表达CTGF的WB-F344细胞株,Western blotting方法同样检测上述标志物蛋白水平的变化。结果重组人CTGF作用于WB-F344细胞24h后,可以轻度抑制细胞活性,但剂量关系不明显。高剂量CTGF作用于WB-F344细胞24h后,可以明显改变WB-F344细胞表面标志物的表达:幼稚肝细胞标志物AFP的表达减少,而成熟肝细胞标志物白蛋白和胆管细胞标志物CK-19的表达均增加。成功构建CTGF全长编码基因的质粒,并用G418获得稳定转染CTGF全长质粒的WB-F344细胞株。稳定转染dl6-95-CTGF的WB-F344细胞,与转染dl6-95相比,AFP和CK-19表达均减少,白蛋白表达增加,但诱导程度没有外源性明显。结论与内源性结缔组织生长因子相比,外源性结缔组织生长因子可以明显改变肝脏前体细胞表面标志物的表达,具有诱导肝脏前体细胞向成熟肝脏细胞分化的潜能。     

人肝再生增强因子基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建携带人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)基因的慢病毒表达载体,并验证其安全性与有效性.方法 将以人胎肝cDNA为模板扩增得到的ALR与pLenti6/V5-D-TOPO重组慢病毒载体连接后,与慢病毒包装体系ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞,得到携带人ALR基因的慢病毒表达载体病毒颗粒,实时定量PCR法测定病毒滴度;转染BLR 3A大鼠肝细胞,观察细胞生长情况,并用RT-PCR法测定ALR基因表达的方法,验证构建的慢病毒载体的安全性与有效性.结果 扩增产物凝胶电泳、提抽质粒酶切电泳及基因测序结果均显示成功构建携带ALR基因的慢病毒表达载体,测得其病毒滴度为1.48×107 v.p./mL.转染BLR 3A大鼠肝细胞72 h后,仅少量细胞病变脱离,转染率为88.49％;RT-PCR结果显示,构建的携带ALR慢病毒表达载体可诱导BLR 3A大鼠肝细胞表达ALR基因.结论 慢病毒表达载体是一种兼具有效性与安全性,且适用于基因研究的病毒表达载体.     

中药复方调控肝干细胞分化及机制的实验研究

目的研究中药复方牛黄、西洋参（简称牛黄参）含药血清对大鼠肝干细胞系WB-F344增殖、分化的影响,探讨益气解毒法体外诱导肝干细胞分化为肝细胞的内在机制。方法采用中药血清药理学方法,以不同浓度的牛黄参含药血清（5%、10%、20%）作用于WB-F344,以正常大鼠血清（5%、10%、20%）处理的WB-F344为空白对照组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组;噻唑兰（MTT）比色法检测不同浓度含药血清对WB-F344增殖的影响;取增殖的最佳浓度,蛋白印迹法（western blot）检测含药血清对WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGFβ1R、TGFβ2R表达的影响;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测含药血清对WB-F344肝细胞表面标志物白蛋白（ALB）的mRNA表达的影响。结果牛黄参含药血清能促进WB-F344的增殖（P〈0.01）,且10%为增殖的最佳浓度梯度;能刺激WB-F344细胞HGFR、EGF、EGFR、TGF-β1R、TGF-β2R的表达量上调（P〈0.01）;能促进WB-F344肝细胞表面标志物ALB的mRNA表达（P〈0.01）。结论牛黄参含药血清可以通过细胞因子体系对肝干细胞WB-F344的增殖、分化进行调节,为利用中药复方制剂调控肝干细胞,促进肝再生和肝损伤修复提供实验与理论基础。     

大鼠BMP-7基因慢病毒载体构建及其在肝星状细胞中的表达

目的 构建携带大鼠BMP-7基因的慢病毒载体并实现该基因在肝星状细胞株HSC-T6中的稳定高表达,为进一步研究BMP-7的抗肝纤维化功能奠定基础.方法 从大鼠细胞基因中提取并用PCR方法扩增BMP-7目的基因,构建BMP-7重组表达载体Lenti-copGFP/puro-BMP7,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物共转染293TN工具细胞,包装产生慢病毒颗粒.慢病毒感染H1299细胞,根据细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达水平测定病毒滴度.将HSC-T6细胞分为空白组、空病毒对照组及BMP-7慢病毒感染组,分别用Real-Time PCR和Western blotting方法检测BMP-7 mRNA和蛋白的表达.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建大鼠BMP-7基因重组慢病毒载体.倒置荧光显微镜下观察可见,H1299细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为1×104 ifμ/μL.重组慢病毒感染HSC-T6后,Real-time PCR和Western blotting方法分别检测到BMP-7 mRNA和蛋白均稳定高表达.BMP-7慢病毒感染组与空病毒对照组比较,差异有统计学意义（P〈0.01）;空病毒对照组与空白组比较,差异无统计学意义（P〈0.05）.结论 成功构建了带有大鼠BMP-7基因的慢病毒载体,并实现其在HSC-T6的稳定高表达.     

人细胞色素P4502A13与GFP融合基因共表达慢病毒载体的构建与表达

目的:构建人细胞色素P450 2A13(CYP2A13)基因与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)共表达的慢病毒载体,并转染肺腺癌A549细胞使之持续高表达CYP2A13基因.方法:采用基因重组技术,将CYP2A13基因与GFP连接,构建慢病毒载体.转染293T细胞,包装后产生病毒...     

TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建TIEG基因siRNA慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的TIEG基因siRNA有效靶序列.合成靶序列的Oligo DNA退火形成双链DNA与经BamH Ⅰ和EcoRl酶切后的PshRNA-copGFP-lendvector慢病毒载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生psiRNA-TIEG慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆.测序鉴定,用psiRNA-TIEG和病毒包装系统共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;用包装病毒颗粒注射大鼠,通过RealTime-PCK检测大鼠肾组织TIEG mRNA的表达水平.结果 PCR和测序证实,成功构建TIEG siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×10<'5>ifu/μL;实验组大鼠TIEGmRNA的表达水平明显低于对照组(50.7%).结论 成功构建大鼠TIEG基因siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG.     

牛黄参含药血清对肝干细胞WB-F 344增殖和凋亡的影响

目的研究牛黄参含药血清对大鼠肝干细胞WB-F344增殖及凋亡的影响,探讨益气解毒法诱导肝干细胞的作用机制。方法采用中药血清药理学方法,以不同浓度的牛黄参含药血清（5%、10%、20%）作用于WB-F344,以正常大鼠血清（5%、10%、20%）处理的WB-F344为空白对照组,以单纯培养体系处理的WB-F344为正常对照组;四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测细胞的增殖,取药物血清的最佳增殖浓度,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果经牛黄参含药血清干预后,MTT检测结果显示10%、20%浓度的牛黄参含药血清均能促进WB-F344的增殖（P〈0.01）,且10%为增殖的最佳浓度梯度;10%牛黄参含药血清作用的WB-F344细胞凋亡率与空白、正常对照组相比显著下降（P〈0.01）,且以10%牛黄参含药血清成分组效果最佳。结论牛黄参含药血清可在一定程度上促进WB-F344细胞的增殖,抑制其凋亡,这可能是益气解毒法作用于肝干细胞的机制之一。     

KIR2DS2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.     

不同途径移植大鼠骨髓间充质干细胞对大鼠肝硬化的作用研究

目的探索不同途径移植绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）在慢性肝纤维化中的作用,以及移植后细胞在肝脏组织内的存活、分布情况。方法全骨髓差速贴壁法分离、培养BMSCs,利用携带GFP基因的慢病毒载体感染P3代BMSCs,建立四氯化碳慢性肝纤维化大鼠模型,通过不同途径移植GFP标记的BMSCs,移植后维持四氯化碳肝损伤,1月后处死大鼠,行肝脏功能相关指标白蛋白（albumin,ALB）、谷丙转氨酶（alaninotransferase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotrans-ferase,AST）检测,观察肝脏局部组织标本苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）、胶原纤维染色和荧光分布情况。结果不同途径BMSCs移植对大鼠四氯化碳所致慢性肝纤维化肝脏功能无明显改善,移植后GFP标记的BM-SCs均可向损伤肝脏迁移或停留,不同途径移植的BMSCs在肝脏内分布不同。结论大鼠骨髓间充质干细胞移植对大鼠慢性肝纤维化无明显治疗作用,可能参与了肝纤维化的形成。     

急性肝衰竭模型构建及细胞移植途径初探

目的优化急性肝衰竭模型的构建方法，探讨细胞移植的最佳途径。方法以D-氨基半乳糖胺（D-gal）作为肝脏毒剂，构建雌性SD大鼠急性肝衰竭模型。以病理形态学和多项血生化指标综合评估肝功能损伤的状态，确定模型构建的最优方案。以此为基础，通过脾内和腹股沟静脉两种途径植入雄性SD大鼠的骨髓间质干细胞（BMSCs）。以sry基因为分子标志，采用PCR技术检测植入细胞在肝脏内的存活状态，并对两种不同的植入途径综合评估。结果（1）不同剂量的D-gal可导致不同程度的肝损伤，而1．4g/kg剂量较好地模拟了急性肝衰竭的病理生理改变且稳定性较好。（2）移植后7～30天在两组细胞移植组大鼠肝脏内均能检测到sry基因阳性细胞的存在，而相应对照组未能检测到sry基因阳性细胞的存在。结论（1）D-gal 1．4g/kg腹腔注射可以很好构建SD大鼠急性肝衰竭模型。（2）骨髓间质细胞经腹股沟静脉移植和脾内移植均可在受体肝脏内存活至少1个月。经腹股沟静脉进行移植是治疗大鼠急性肝衰竭的一种较好的途径。     

不同途径移植间充质干细胞对大鼠急性肝损伤的修复作用

目的:评价骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对大鼠急性肝损伤的修复作用,探讨其可行性和有效性.方法:四氯化碳(CCl4)腹腔注射复制Wistar大鼠急性肝损伤模型,造模后随机分为实验组及对照组,实验组分别通过尾静脉、门静脉、肝内注射移植经Hochest33342标记的大鼠骨髓MSCs悬液0.5 mL(约1×10 6个细胞...     

同种异体移植骨髓基质干细胞修复大鼠急性化学性肝损伤的组织学观察

目的 探讨同种异体移植骨髓基质干细胞修复大鼠急性化学性肝损伤的可行性。方法 采用CCl4喂养制作SD大鼠急性化学性肝损伤模型，通过肝实质局部注射同种BMSCs（肝损伤移植组），或不行细胞移植（肝损伤对照组）。分别在造模前、BMSCs移植术后6h、1周、5周取肝组织石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察。结果 肝损伤大鼠造模后肝内出现弥漫性分布的点片块坏死，肝血窦充血明显，弥散性炎性细胞浸润。BMSCs移植组大鼠移植术后6h肝内坏死、充血、炎性细胞等改变与肝损伤对照组组织学改变基本类似，移植术后1周、5周上述组织学改变逐渐好转，但BMSCs移植组较肝损伤对照组好转更明显。结论 同种异体移植BMSCs有助于修复大鼠急性化学性损伤的肝组织。     

恒磁场对Feridex-GFP 双标记BMSC 在损伤肝脏中定植的影响

目的：评价体外恒磁场作用下,双标记干细胞经外周静脉、门静脉、肝动脉移植在损伤肝脏中的定植 率及治疗急性肝损伤的有效性。方法：分离骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),经培 养传代纯化、体外诱导,分化为肝样细胞,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和菲立磁(Feridex)体外双标 记BMSCs,不同途径移植双标记BMSCs至肝脏,于移植后第1,2,3,4周处死大鼠,测定血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)水平,并取肝组织做苏木精-伊红染色(HE染色)、荧光显微镜下观 察肝内GFP阳性率。结果：双标记BMSCs通过尾静脉、门静脉、肝动脉3种途径及其外加恒磁场作用下,移植后第4周 均能定植于肝脏,改善肝功能;在远期疗效不变的前提下,肝门静脉移植+恒磁场组、肝动脉移植+恒磁场组促进肝 功能的早期恢复。结论：BMSCs移植可有效治疗急性肝损伤,首选经门静脉+恒磁场、肝动脉+恒磁场途径,次选外 周静脉或外周静脉+恒磁场途径。     

人骨髓间充质干细胞在大鼠体内转化为肝样细胞的实验研究

目的 探讨诱导人骨髓间充质细胞在大鼠肝损伤模型中转分化为肝样细胞的可能性。方法 建立肝叶切除和亚致死量照射两种肝脏损伤模型,植入人间充质干细胞,检测大鼠谷丙转氨酶、总胆红素和凝血酶原时间的变化;聚合酶链反应检测大鼠肝脏内人特异性DNA序列Alu-sx。结果 造模后行干细胞移植组大鼠肝功能均有明显改善。聚合酶链反应显示各干细胞移植组大鼠肝脏中均能同时检测人特异性DNA序列Alu sx和大鼠特异性DNA序列Sox11。结论 人骨髓间充质干细胞能在肝损伤大鼠肝脏内存活,表达人特异性抗原,并能在肝损伤大鼠肝脏内分化为具有肝功能的肝样细胞,有助于肝损伤大鼠肝功能恢复。     

转基因骨髓源性肝干细胞移植对大鼠肝纤维化的影响

目的探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化的影响。方法采用淤胆型肝损伤大鼠模型和含5%淤胆血清的培养液筛选和扩增BDLSC,使用RT-PCR方法检测培养2周时肝干细胞标志表达。体外将携带人uPA基因的腺病毒(AduPA)转染BDLSC并移植入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内,观察大鼠肝功能、胶原面积及病理组织学的变化。结果病理条件培养液培养2周的骨髓细胞形成肝细胞样集落,并表达胚胎期肝干细胞特征性蛋白。体内研究显示,与模型组和BDLSC组相比,BDLSC-uPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)及总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低,凝血酶原时间(PT)时间缩短,白蛋白(ALB)水平升高,肝组织细胞外基质(ECM)水平及羟脯氨酸(Hyp)含量明显降低;肝组织结缔组织增生程度减轻,假小叶形成不明显,胶原面积明显减少。结论uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,从而为转基因BDLSC移植治疗肝纤维化的临床应用提供理论依据和实践基础。     

经大鼠脾动脉行肝细胞移植建立动物模型

 目的 建立经SD大鼠颈动脉途径脾动脉插管行肝细胞移植的动物模型,并探讨其临床意义。方法 采用D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-gal)诱导大鼠急性肝损伤(acute liver injury,ALI),24 h后40只SD大鼠分为两组:A组(n=20)经左侧颈动脉插管,进入腹腔干,通过脾动脉移植1×107个肝细胞;B组(n=20)通过同样的方法经脾动脉注射0.5 mL Hank′s液作为对照,观察不同时间点（1、3、6、10、15天）大鼠肝功能的变化情况以及脾内白蛋白合成作用,HE染色观察脾内肝细胞分布情况。结果 经颈动脉途径脾动脉插管成功率约90%,荧光示踪剂CFDA SE标记的肝细胞脾内移植1天后,受体大鼠脾脏可以看到散在绿色荧光分布。A组移植10天后,HE染色可以看到肝细胞在脾脏散在分布;A组移植15天后,共聚焦白蛋白免疫荧光结果表明,脾内有白蛋白绿色荧光信号。结论 经大鼠颈动脉途径脾动脉插管移植的肝细胞能在脾内存活,证实该途径是肝细胞有效移植途径之一。