兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯(PHB)的细胞相容性实验研究

目的：探索血管平滑肌细胞和新型可降解材料聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性，为组织工程血管的构建寻找理想的支架材料。方法：将组织块法体上培养与兔血管平滑肌细胞种植在PHB膜片和PHB三维微孔支架上，在相差显微镜下观察细胞的粘附和生长情况。用MTT法测定细胞粘附率和细胞增殖指数，复合培养7天后进行扫描电镜观察并用流式细胞仪（FCM）的测定细胞周期，DNA指数。结果：兔血管平滑肌细胞在PHB膜片上粘附率为77％，细胞增殖符合细胞的生长曲线，在PHB三维微孔支架上生长情况良好，并被证实为二倍体细胞。结论：兔血管平滑肌细胞和聚羟基丁酯（PHB）的细胞相容性较好，但细胞与材料间的粘附有待进一步改善。     

组织工程血管支架材料最适孔径的研究

目的 筛选组织工程血管支架材料的最适孔径.方法 用生物可降解材料聚β羟基丁酯(PHB)作为支架材料,运用盐析方法制成实心和不同孔径的膜片;将培养的第3代血管平滑肌细胞种植于膜片上,于培养的第1、3、7、11、14天,采用倒置显微镜下观察、苏木素-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色、扫描电镜检查及噻唑蓝(MTT)比色法检测查明材料上细胞附着和生长情况.结果 倒置显微镜下无法观察附着于材料上的细胞;HE和扫描电镜标本制备过程中细胞丢失多,其不能为材料提供准确的信息;甲苯胺蓝染色可快速观察材料上细胞附着情况;MTT比色法可定量测定材料上的细胞数.经比较发现150～200 μm孔径的PHB膜片上血管平滑肌细胞附着和生长最佳.结论 150～200 μm孔径的PHB膜片最适合血管平滑肌细胞的附着和生长.     

生物可降解材料聚β-羟基丁酯对兔骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的：检测生物可降解材料聚β-羟基丁酯(PHB)对兔骨髓基质细胞(BMSC)形态、生长、附着及增殖的影响。方法：将家兔BMSC进行体外培养，以诱导剂(β-甘油磷酸钠，地塞米松，L-抗坏血酸)使其向成骨细胞分化，行碱性磷酸酶染色并计算阳性率，将PHB与成骨细胞样细胞进行体外复合培养，用倒置显微镜及扫描电镜观察PHB对BMSC的形态、生长、附着及增殖的影响。结果：在诱导剂的作用下BMSC向成骨细胞分化，碱性磷酸酶染色呈阳性，其阳性率随培养时间延长而增加。PHB与成骨细胞样细胞进行体外复合培养后显示PHB对BMSC的形态、生长、附着及增殖均无不良影响。结论：PHB具有良好的生物相容性，可望与骨髓复合移植修复骨缺损。     

鸵鸟钙磷陶瓷支架细胞相容性研究

目的：评价由鸵鸟松质骨制备的钙磷陶瓷支架的细胞相容性。方法：通过物理、化学方法将煅烧的鸵鸟松质骨改性为HAP／β-TCP／NaCaPO4多相钙磷陶瓷，然后分离兔骨髓基质细胞，体外扩增、诱导后接种于鸵鸟钙磷陶瓷支架。骨髓基质细胞与支架复合培养8天，通过相差显微镜、扫描电镜观察细胞在材料上的粘附、伸展及生长情况。通过细胞计数观察细胞增殖情况。结果：骨髓基质细胞在鸵鸟钙磷陶瓷支架表面及孔隙内粘附、伸展、增殖良好。结论：鸵鸟钙磷陶瓷支架具有良好的细胞相容性。     

尿道种子细胞与生物可降解材料的生物相容性研究

目的 观察生物可降解材料聚β-羟基丁酸酯(PHB)与种子细胞即兔膀胱移行上皮细胞及平滑肌细胞间的生物相容性,探讨其作为种子细胞载体构建组织工程化尿道的可行性.方法 经过传代培养,分别在PHB与上皮细胞共同培养2、7 d,与平滑肌细胞共同培养1、5 d,每组各取6个样本,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,并利用扫描电镜检测细胞在材料上的空间生长情况,评估移行上皮细胞和平滑肌细胞与聚β-羟基丁酸酯的生物相容性.结果 平滑肌细胞能够在该材料上正常生长,各组间A值差异无统计学意义(P>0.05);而移行上皮细胞在该材料上只有少量生长,且实验组与对照组间A值差异有统计学意义(P<0.05),而A、B两实验组间A值差异无统计学意义(P>0.05).结论 聚β-羟基丁酸酯与平滑肌细胞具有良好的生物相容性,但其对移行上皮细胞的生长具有一定的抑制作用,生物相容性不甚理想.     

组织工程人工血管支架的预构

目的：探讨具有血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）活性的组织工程人工血管支架的构建方法。方法：①将聚羟基乙酸（polyglycolic acid,PGA）纤维无纺网支架材料、血管平滑肌细胞和胶原纤维相混合，构建组织工程血管。②将VSMCs置入胶原凝胶中，观察VSMCs的生长状况。③观察VSMCs胶原悬液滴入该支架材料中的生长。结果：①VSMCs在胶原凝胶中的位置固定，分布于不同层次，约3－4h逐渐形成多个胞质突起。随时间推移，胞质突起继续伸展，部分细胞呈梭形、纺锤形。②VSMCs胶原悬液滴入胶原包埋处理的PGA支架中后，大部分细胞随胶原凝胶状态的形成，滞留于支架材料网孔中，细胞可沿PGA纤维表面生长。结论：胶原包埋处理的PGA纤维无纺网是良好的携带VSMCs的多孔生物降解材料。     

改善人工神经支架材料粘附性的研究

目的 探讨改善人工神经支架材料表面粘附性的方法。方法 对聚羟基乙酸细丝支架进行化学和/或生物学修饰处理,通过体外培养方法比较SD乳鼠许旺细胞在不同聚羟基乙酸细丝表面贴壁生长情况。结果 在经化学处理及生物学修饰的聚羟基乙酸细丝表面许旺细胞能良好贴壁生长,仅予生物学修饰的支架材料次之,未经处理的支架材料上罕有许旺细胞粘附。结论 人工神经构建中支架材料表面的粘附性是至关重要的因素,对聚羟基乙酸进行化学处理后再行生物学修饰是改善其粘附性的简单可行、效果确切的方法。     

组织工程血管模型体外构建的实验研究

目的：在体外环境下，探索构建分别含内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞的三层结构的组织工程化血管，三种细胞相互作用，相互支持，形成一个在形态和功能与正常血管近似的组织工程化血管。方法：通过用胶原分别包埋处理的三个管径大小不同，但能相互嵌套的聚羟基乙酸（PGA）管形支架，并种植人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞进行三维立体生长培养，观察细胞生长分化情况。采用酶消化法和组织块法分离培养人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞，人成纤维细胞并传代，纯化，将聚羟基乙酸（PGA）无纺网用胶原溶液包埋，真空冷冻干燥，形成多孔状PGA＋胶原管型支架；接种3代－7代人脐静脉内皮细胞，人血管平滑肌细胞及人成纤维细胞与其内腔面，采用动脉旋转培养技术体外培养3周，行扫描电镜观察。结果：构建后的血管模型，层与层结构紧密，内皮细胞，平滑肌细胞及成纤维细胞分泌细胞外基质，相互进行物质交换，类似于生理条件。结论：该支架具有一定弹性和韧性，在培养液中，能较长时间保持形状。此方法的进一步应用组织工程方法构筑具有分层结构的人造血管打下基础。     

组织工程心脏瓣叶体外生成可行性研究

目的初步探讨组织工程心脏瓣叶体外生成的可行性。方法杂种猪6只，取主动脉。分离血管内皮细胞及成纤维、平滑肌细胞，予培养扩增。将成纤维、平滑肌细胞与内皮细胞按顺序种植在预湿处理的支架材料上，使用DMEM培养。以首次种植成纤维、平滑肌细胞为起点，28d送样本进行扫描电镜、组织学检查和羟脯氨酸测定。结果扫描电镜检测显示，瓣叶支架上可见大量细胞粘附，支架表面细胞融合成片，表面尚可见细胞基质形成。HE染色显示材料上可见大量细胞粘附，已长入材料中部。弹性纤维染色显示有弹性纤维合成。羟脯氨酸测定显示瓣叶材料有羟脯氨酸合成。结论使用体外分离、培养及传代的内皮细胞和成纤维、平滑肌细胞，经体外种植、培养，有可能生成具有活性的组织工程心脏瓣叶。     

新型聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架的细胞相容性研究

目的研究骨髓基质干细胞(BMSCs)与该聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)类支架的细胞相容性及体外粘附情况,为制备负载多种细胞因子的PLGA类支架提供研究基础。方法抽取新西兰兔骨髓,用全骨髓培养法获取单核细胞,经条件培养液体外诱导、扩增。设立空白BMSCs组和具有良好细胞相容性的β-磷酸三钙(β-TCP)为对照组。BMSCs以1×106/mL浓度接种于PLGA和β-TCP上,通过倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞生长及细胞与材料的附着情况。以MTT实验、流式细胞仪等手段检测各组细胞增殖和细胞周期变化情况。结果BMSCs可较好粘附于PLGA支架上,且该PLGA类支架对细胞增殖、生长周期无明显影响。结论该PLGA类支架的细胞相容性较好,并可进一步作为多种细胞因子载体构建缓释型支架,从而用于骨组织工程。     

体外高磷环境下血管平滑肌细胞转分化过程的研究

目的 观察体外高磷培养条件下,血管平滑肌细胞（VSMC）向类似成骨样细胞转分化的动态变化特点。 方法 Western印迹和免疫荧光法观察不同磷浓度（1.0、2.5、3.5 mmol/L）培养条件下,人VSMC的标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）以及成骨细胞特异性的核转录因子Cbfα1、相关骨基质蛋白（骨桥蛋白、I型胶原和骨钙素）的动态变化过程。实时荧光定量PCR法分析上述指标的基因表达水平。在此基础上,以硝酸银染色和茜素红染色了解细胞的钙盐沉积状况,最后通过电镜观察不同培养条件下细胞超微结构的改变。 结果 在无血清的培养条件下,高磷（2.5、3.5 mmol/L）刺激细胞12 h时,胞内 Cbfα1的表达就明显增加（P ＜ 0.05）;3 d后高磷组（2.5、3.5 mmol/L）细胞中I型胶原和骨桥蛋白的含量显著上调（均P ＜ 0.05）;第6天骨钙素的产生开始增加;15 d时高磷组（2.5、3.5 mmol/L）α-SMA的含量才显著下降（P ＜ 0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,高磷环境培养1 d时,细胞中骨桥蛋白、I型胶原的mRNA水平显著升高（均P ＜ 0.05）;5 d时骨钙素的mRNA表达显著增加（P ＜ 0.05）;10 d时α-SMA的mRNA含量显著减少（P ＜ 0.05）。在高磷营养液中培养15 d时,细胞出现多处斑片状的钙盐沉积。电镜可见胞质内产生大量胶原纤维和钙化的基质囊泡。 结论 高磷可诱导VSMC向类似成骨样细胞转分化,这是一个复杂的、有多个环节、有序的动态变化过程。     

复合可降解基质膜片制备及血管内皮细胞在其吸附生长的实验研究

目的　制备几种复合可降解基质膜片 ,观察血管内皮细胞在其上的生长情况。方法　用胶原酶消化法分离牛主动脉血管内皮细胞 (VEC) ,另采用两步盐析法提取牛骨 型胶原。将交联胶原包埋处理聚羟基乙酸 (PGA)、聚乳酸 (PL A)及聚β羟基丁酸 (PHB)形成可降解基质材料膜片 ,并接种牛 VEC,采用 MTT法比较 VEC在几种可降解基质材料膜片的生长情况。结果　胶原、PGA/胶原、PL A/胶原膜质地均匀柔韧 ,固定成形 ,具有一定弹性和吸水性 ;MTT比色实验表明 VEC在胶原、PGA/胶原、PL A/胶原上均生长良好 ,优于 PHB/胶原组。尤以 PGA/胶原所形成的基质材料固定成形 ,弹性和韧性好 ,VEC在其上贴附生长良好。结论　通过生物材料与人工可降解材料有机结合 ,PGA/胶原物理性能互补 ,是组织工程再造血管较理想的基质材料之一。     

Ⅰ型胶原海绵/血管内皮生长因子缓释系统的初步构建

[目的]研制Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,CI)海绵/血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)缓释生物支架材料,了解该种材料中的VEGF体外缓释效果.为骨肌腱组织工程寻求一种新型复合支架材料.[方法]从CI海绵自身的力学、孔径、紫外最大吸收光谱、孔隙率、含水率、傅立叶红外光谱及与VEGF的组织相容性等方面研究VEGF胶原缓释系统支架材料的特性,利用生物学方法将VEGF负载于CI,制备具有VEGF缓释效果的复合支架.[结果]CI海绵能够成功的将VEGF包裹起来,可以达到明显的缓释作用,与VEGF有良好的组织相容性.[结论] CI海绵有理想的孔径和合理的生物力学及与VEGF良好的生物学相容性结构性质,VEGF可以从CI - VEGF缓释材料中缓慢释放,有明显的缓释效果,是一种具有良好材料特性的组织工程材料.     

血管平滑肌细胞中睾酮膜受体的研究

目的:观察血管平滑肌细胞(VSMCs)胞膜有无睾酮(T)特异性结合位点(膜受体),并对其与经典的细胞内雄激素受体(iAR)的关系作初步探讨。方法:贴块法培养雄性SD大鼠胸主动脉VSMCs,给以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白-睾酮复合物(T-BSA-FITC)作用,流式细胞仪检测VSMCs荧光标记情况,以及iAR拮抗剂氟他胺对T-BSA-FITC与VSMCs结合的抑制作用;用免疫荧光法标记胞膜完整和TritonX-100处理后胞膜透化VSMCs表达的iAR,流式细胞术检测细胞平均荧光强度,进一步转换为相对荧光强度进行统计学分析。结果:与0作用时间点相比,T-BSA-FITC与VSMCs作用10s,细胞相对荧光强度即显著增加(P<0.01);VSMCs与T-BSA-FITC作用10min,细胞相对荧光强度显著高于对应摩尔浓度的BSA-FITC、BSA-FITC+BSA、BSA-FITC+BSA+T对照(P值分别为0.357,0.832和0.823)。与单纯T-BSA-FITC作用相比,预先给以iAR拮抗剂氟他胺对VSMCs荧光强度没有显著影响(P=0.318)。胞膜完整VSMCs与iAR抗体作用后,细胞相对荧光强度较单纯加入FITC标记二抗无明显增加(P=0.733);而胞膜透化VSMCs与iAR抗体作用后,细胞荧光强度较单纯FITC标记二抗处理明显增加(P=0.024)。结论:VSMCs中存在睾酮膜受体,其性质不同于经典的iAR。     

Role and mechanism of tissue plasminogen activator in venous wall fibrosis remodeling after deep venous thrombosis via the glycogen synthase kinase-3 beta signaling pathway

Background

Deep venous thrombosis (DVT) confers vein wall injury associated with fibrosis and extracellular matrix turnover. The activation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and phenotypic switching are postulated to be the significant contributing factors in the evolution of the pathogenic processes. This study investigated the effect of tissue plasminogen activator (tPA) on the phenotypic switching and collagen deposition of VSMCs, as well as related signaling pathway that leads to this activation.

Materials and methods

The model of stasis-induced DVT was established by ligation of the femoral vein. VSMCs transfected with the plasmid vector carrying a rat recombinant tPA gene with an enhanced green fluorescent protein (EGFP) tag (AdtPA-EGFP). Fibrotic change, expression of collagen type I, the cell number of media, and intimal thickness score were evaluated; the comparisons were made among the AdtPA-EGFP–transfected group, an empty vector (AdNull-EGFP) transfected group, and a phosphate-buffered saline perfused group in vivo. tPA induced VSMCs phenotypic switching and collagen deposition in vitro. The related signaling pathway molecules and the cell cycle progression were also investigated by western blot and flow cytometry.

Results

In the AdtPA-EGFP stasis DVT model, early vein wall collagenolysis and deposition occurred more remarkable. Histological studies showed that the expression of vein wall collagen type I protein, cell number of media, and intimal thickness score was significantly increased (P < 0.05). In primary culture VSMCs, sustained stimulation with tPA induced collagen type I upregulation and triggered sequential signaling events involving Akt, extracellular signal–regulated kinases 1/2 (ERK1/2), glycogen synthase kinase-3 (GSK3)-β phosphorylation, and cyclin D1 induction. Blockade of phosphatidylinositol 3-kinase-Akt and ERK1/2 activation suppressed tPA-induced GSK3β phosphorylation, cyclin D1 expression, and the deposition of collagen type I.

Conclusions

tPA was a profibrotic factor that potentiated the phenotypic switching and the deposition of collagen in VSMC. The effect of tPA on VSMCs involved activation of Akt and ERK1/2 pathways and inhibition of GSK3β activity, which could promote a switch of the synthetic phenotype in VSMCs and lead to the remodeling of vascular injury.     

Endoplasmic reticulum stress mediates parathyroid hormone-induced apoptosis in vascular smooth muscle cells

Vascular calcification is one of the most common complications of chronic kidney disease (CKD), which is closely associated with increased mortality and morbidity rates of CKD patients. It has been reported that increased parathyroid hormone (PTH) aggravates vascular calcification in CKD patients. However, the direct role of PTH in vascular smooth muscle cells (VSMCs) is less elucidated. Here, we present evidence that PTH promotes apoptosis of VSMCs and endoplasmic reticulum (ER) stress participates in this process. Human aorta vascular smooth muscle cells (HASMCs) were treated with different concentrations of PTH for various time. HASMC apoptosis was detected by flow cytometry. Expression of phosphorylated (p)-PERK, CHOP, IRE1, p-JNK, and cleaved caspase 3 was determined by Western blotting. We found that PTH induced HASMC apoptosis and increased the expression of cleaved caspase 3. Furthermore, PTH activated PERK-CHOP and IRE1-JNK ER stress pathways. Either inhibition of JNK by SP600125 or CHOP by siRNA ameliorated PTH-induced apoptosis in HASMCs. We therefore suggest that ER stress participates in PTH-induced apoptosis of VSMCs, which may be a possible mechanism of PTH-promoted vascular calcification in CKD patients.