高迁移率族蛋白B1基因沉默抑制子宫内膜癌侵袭与转移的机制

目的：探讨小干扰RNA抑制高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)表达后对p38MAPK通路的影响，从而了解HMGB1影响子宫内膜癌侵袭与转移的机制。方法：运用RNA干扰技术，设计合成4条HMGB1 shRNA，将HMGB1沉默效果最好的HMGB1 shRNA转染子宫内膜癌HEC-1A细胞，通过RT-PCR和Western 印迹技术检测转染后细胞HMGB1及p38MAPK在基因和蛋白水平的表达情况，MTT实验检测转染后细胞生长活力状态。结果：RT-PCR和Western 印迹结果均证实HMGB1 shRNA载体成功抑制HMGB1和p38MAPK在HEC-1A细胞中mRNA和蛋白的表达(P<0.05)；MTT结果显示HMGB1 shRNA转染后HEC-1A细胞生长明显受抑(P<0.05)。结论：HMGB1表达下调可有效抑制子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖、侵袭和转移，此过程可能通过p38MAPK信号通路进行调节。     

小干扰RNA抑制HMGB1表达对子宫内膜癌细胞侵袭与迁移的影响

目的：探讨靶向HMGB1的shRNA对HMGB1表达改变的影响及其与子宫内膜癌细胞侵袭与迁移力改变的关系。方法：运用RNA干扰技术，构建HMGB1短发夹RNA(pshRNA-1 /HMGB1，pshRNA-2 /HMGB1，pshRNA-3/HMGB1)，同时设置转染非特异性质粒的阴性对照组 (HMGB1/p-NC) 和脂质体转染组 (Lipo组) ，用脂质体法转染人子宫内膜癌细胞(HEC-1A)，利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测转染后48 h各组细胞HMGB1在 mRNA和蛋白水平的表达，Transwell小室法观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的侵袭情况，细胞划痕实验观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的迁移情况。结果：RT-PCR显示：3组重组质粒HMGB1-pshRNAs转染后，HMGB1 mRNA相对表达水平分别是0.192±0.006，0.055±0.002和0.123±0.086，较Lipo组(0.268±0.008)和HMGB1/p-NC组(0.270±0.004)明显减少(P<0.05)，最大抑制率分别达28.4%，79.5%和54.1%。Western印迹显示：HMGB1蛋白相对表达水平分别是0.259±0.129，0.032±0.002和0.104±0.007，较Lipo组(0.347±0.007)和HMGB1/p-NC组(0.349±0.007)明显减少(P<0.05)，最大抑制率分别达25.4%，90.8%和70.0%。实验组在接种后48 h，穿过Transwell小室膜的细胞数显著少于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P<0.05)。划痕愈合实验亦显示实验组划痕愈合率明显低于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P<0.05)。结论：靶向干扰HMGB1的shRNA可以抑制HMGB1的表达，转染后的子宫内膜癌细胞侵袭与迁移能力明显
下降。     

PAX2特异性siRNA在诱导HEC-1A细胞增殖及凋亡中的作用

目的研究靶向全长配对盒基因-2(PAX2)siRNA在诱导子宫内膜癌细胞增殖、凋亡中的作用。方法慢病毒载体介导针对PAX2基因的siRNA转染HEC-1A细胞,Western blot、激光共聚焦显微镜、Annexin-V/PI双标法及四甲基偶氮唑蓝(MTT)分别检测PAX2蛋白表达、细胞凋亡形态学改变、凋亡率及细胞增殖变化。结果 PAX2-siRNA转染后,HEC-1A细胞的PAX2蛋白表达明显降低(P<0.05);细胞早期凋亡率显著增加(22.07±2.17)%,与空载体转染组(1.12±0.37)%及未转染组(0.89±0.52)%比较,差异均具有统计学意义(均P<0.01);细胞生长速率显著减慢,细胞经Hoechst 33258荧光染色,见转染后细胞的胞核呈浓集固缩改变,而空载体转染组和未转染组细胞的胞核无凋亡形态学改变。结论 PAX2特异性siRNA能明显抑制PAX2蛋白在子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达,抑制细胞增殖并诱导HEC-1A细胞凋亡。     

PTEN基因对子宫内膜癌细胞PI3K/AKT通路的影响

 【目的】探讨PTEN基因在子宫内膜癌PI3K/AKT通路中的作用,评估PTEN基因在抗肿瘤治疗中的意义。【方法】利用慢病毒载体系统, 构建人PTEN基因RNA干扰慢病毒载体和PTEN基因过表达慢病毒载体,分别转染PTEN野生型的HEC-1A细胞和PTEN突变型的Ishikawa细胞, 建立PTEN 基因敲减及过表达的细胞模型,Western Blot方法检测PTEN基因敲减或过表达前后PTEN蛋白的表达和AKT通路的活化情况, MTT法检测慢病毒转染前后细胞增殖的变化,流式细胞术检测慢病毒转染前后细胞周期及细胞凋亡率的变化。【结果】1. HEC-1A细胞转染PTEN基因干扰慢病毒载体后,细胞的增殖曲线和细胞凋亡率与对照组比较无明显变化。但Ishikawa细胞转染PTEN基因过表达慢病毒载体后,增殖曲线和细胞凋亡率显示其生长呈明显抑制状态。2.当HEC-1A细胞转染了RNA干扰病毒后（HEC-1A-RNAi）,Western Blot 结果显示PTEN蛋白表达下调,其EGFR, p-EGFR, mTOR, p-mTOR, AKT, p-AKT蛋白表达增强,当Ishikawa细胞转染了过表达载体病毒后（Ishikawa-PTEN）,Western Blot 结果显示其PTEN蛋白表达上调,p-EGFR,p-mTOR,AKT,p-AKT蛋白表达减弱。3.HEC-1A-RNAi细胞周期中G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,Ishikawa-PTEN细胞周期中G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少。【结论】PTEN 基因可以抑制细胞增殖过程, 有可能成为子宫内膜癌患者基因治疗的选择之一。     

小干扰RNA抑制HMGB1表达对子宫内膜癌细胞侵袭与迁移的影响

目的:探讨靶向HMGB1的shRNA对HMGB1表达改变的影响及其与子宫内膜癌细胞侵袭与迁移力改变的关系.方法:运用RNA干扰技术,构建HMGB1短发夹RNA(pshRNA-1 /HMGB1,pshRNA-2/HMGB1,pshRNA-3/HMGB1),同时设置转染非特异性质粒的阴性对照组(HMGB1/p-NC)和脂质体转染组(Lipo组),用脂质体法转染人子宫内膜癌细胞(HEC-1A),利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测转染后48 h各组细胞HMGB1在mRNA和蛋白水平的表达,Transwell小室法观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的侵袭情况,细胞划痕实验观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的迁移情况.结果:RT-PCR显示:3组重组质粒HMGB 1-pshRNAs转染后,HMGB1 mRNA相对表达水平分别是0.192±0.006,0.055±0.002和0.123±0.086,较Lipo组(0.268±0.008)和HMGB1/p-NC组(0.270±0.004)明显减少(P＜0.05),最大抑制率分别达28.4％,79.5％和54.1％.Western印迹显示:HMGB1蛋白相对表达水平分别是0.259±0.129.0.032±0.002和0.104±0.007,较Lipo组(0.347±0.007)和HMGB1/p-NC组(0.349±0.007)明显减少(P＜0.05),最大抑制率分别达25.4％,90.8％和70.0％.实验组在接种后48 h,穿过Transwell小室膜的细胞数显著少于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P＜0.05).划痕愈合实验亦显示实验组划痕愈合率明显低于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P＜0.05).结论:靶向干扰HMGB1的shRNA可以抑制HMGB1的表达,转染后的子宫内膜癌细胞侵袭与迁移能力明显下降.     

钙激活性中电导钾离子通道在子宫内膜癌细胞周期中的调控作用

目的探讨子宫内膜癌组织中钙激活性中电导钾离子通道(KCa3.1)的表达变化及其在子宫内膜癌细胞周期中的调控作用。方法应用蛋白质印迹法、Real-time PCR技术检测25例正常子宫内膜、26例非典型增生的子宫内膜和25例子宫内膜癌组织中KCa3.1蛋白和mRNA的表达;用克霉唑阻断剂和siRNA干扰两种方法,阻断KCa3.1的作用后,观察子宫内膜癌细胞HEC-1A细胞周期的变化。结果子宫内膜癌组织中KCa3.1 mRNA和蛋白的表达水平明显高于非典型增生的子宫内膜和正常子宫内膜组织(P<0.01);克霉唑呈剂量依赖性方式将细胞阻滞于G0～G1期,使S期细胞减少;转染siRNA细胞KCa3.1蛋白表达量为转染阴性对照siRNA细胞的(40.27±6.09)%,与转染阴性对照siRNA的HEC-1A细胞比较,转染KCa3.1 siRNA可将细胞阻滞于G0～G1期、使S期细胞减少;同时降低cyclin D1蛋白的表达。结论子宫内膜癌组织中KCa3.1的表达增高,KCa3.1可能通过影响cyclin D1蛋白表达参与子宫内膜癌细胞周期调控。     

小檗碱体外抗子宫内膜癌HEC-1A细胞的作用研究

目的研究小檗碱体外对非激素依赖型人子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移、周期、凋亡的影响。方法 MTT法检测小檗碱对人子宫内膜癌HEC-1A[中分化腺癌,雌激素受体(ER)弱阳性,孕激素受体(PR)阴性]细胞株的抑制作用;倒置显微镜观察细胞形态变化;将实验组分成50、25、12.5 mg/L高、中、低剂量组。Transwell法测定细胞体外迁移能力,流式细胞仪观察细胞周期分布,Annexin V-FITC/PI双染检测HEC-1A细胞凋亡。结果小檗碱可显著抑制HEC-1A细胞生长,在100、50、25、12.5、6.25 mg/L浓度范围内呈剂量依赖性(P0.05)。小檗碱能明显改变细胞形态,小檗碱作用于子宫内膜癌HEC-1A细胞后,倒置显微镜下可见部分细胞体积改变,细胞内出现空泡,结构破坏,裂解成碎片,贴壁细胞减少,并散在排列。抑制子宫内膜癌HEC-1A细胞体外迁移的能力,高剂量组效果更佳,迁移细胞数明显减少。小檗碱低剂量组可以将HEC-1A细胞阻滞于G0/G1期。小檗碱作用24 h能提高HEC-1A细胞总凋亡率、早期凋亡率及晚期凋亡率,早期凋亡率更明显。结论小檗碱能够抑制非激素依赖型子宫内膜癌HEC-1A细胞株的增殖、迁移,并且促进HEC-1A细胞凋亡,低剂量小檗碱能将细胞阻滞在G0/G1期。     

曲古霉素A对人子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖和凋亡的作用及相关机制

【目的】探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(trichostatin A,TSA)对人子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖和凋亡的作用及其可能机制。【方法】应用不同浓度的TSA处理子宫内膜癌HEC-1B细胞72 h,Western blotting法检测细胞内组蛋白H4乙酰化水平及p21蛋白,荧光定量PCR方法检测p21基因mRNA表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率。【结果】经TSA作用后,人子宫内膜癌HEC-1B细胞内组蛋白H4乙酰化水平增加,p21基因mRNA及蛋白表达增加;同时细胞生长受到抑制,细胞凋亡增加。【结论】TSA通过提高组蛋白乙酰化水平,增加p21基因表达,抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞的增殖和诱导细胞凋亡。     

KCC1基因在IGF-Ⅰ调控子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖中作用的研究

目的 探讨胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)对子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖能力的影响,以及KCC1基因在IGF-Ⅰ调控子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖中的作用.方法 应用IGF-Ⅰ处理子宫内膜癌HEC-1B细胞,RT-PCR检测HEC-1B细胞中KCC1基因的表达,MTT比色法和流式细胞术检测HEC-1B细胞增殖能力和细胞周期的改变.设计并合成KCC1基因特异性的siRNA,转染HEC-1B细胞,检测RNA干扰后HEC-1B细胞的增殖能力及细胞周期的变化.结果 IGF-Ⅰ能够明显增加HEC-1B细胞中KCC1基因的表达,而且能够促进细胞增殖分裂.KCC1基因特异性的siRNA能够明显抑制HEC-1B细胞中KCC1基因的表达(P<0.05).KCC1表达下调的HEC-1B细胞的增殖能力出现明显下降(P<0.05),细胞周期分析显示实验组细胞明显阻滞于G0/G1期(P<0.05).结论 IGF-Ⅰ能够促进子宫内膜癌HEC-1B细胞的增殖,KCC1基因参与了该调控过程,抑制KCC1基因的表达能够抑制子宫内膜癌细胞的增殖能力.     

血管紧张素II受体1 抑制剂对雌激素作用下的子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

 目的探讨雌激素及血管紧张素域受体1（AT1-R）抑制剂saralasin 对HEC-1A细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。方
法应用免疫细胞化学方法检测AT1-R、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（p-Akt）、细胞外信号调节
激酶（ERK）蛋白在HEC-1A 细胞中的表达;应用MTT 法、流式细胞技术检测雌激素作用于HEC-1A 细胞不同时间后细胞增殖、
细胞周期和凋亡的变化,以及saralasin对雌激素诱导下的HEC-1A 细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响;Western blot 分析雌激素
作用后HEC-1A细胞中ERK、p-Akt 蛋白表达的变化,及saralasin 对雌激素诱导下的HEC-1A细胞中ERK、p-Akt 蛋白表达的影
响。结果AT1-R、PI3K、p-Akt、ERK蛋白在HEC-1A细胞中均有阳性表达;雌激素能够促进HEC-1A细胞增殖,使G0~G1期的
细胞比例下降,S 期的细胞比例升高,凋亡减少,ERK蛋白的表达上调;而saralasin 可明显地抑制雌激素诱导的HEC-1A细胞的
增殖,使细胞周期停滞在G0~G1期,S 期的细胞比例下降,凋亡增多,ERK蛋白的表达下调。结论雌激素可以通过AT1-R促进
HEC-1A 细胞增殖,AT1-R 抑制剂saralasin 可以抑制雌激素的促细胞增殖作用,并促使HEC-1A 细胞发生凋亡,其机制可能是通
过阻断丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路引起ERK蛋白表达的下调,从而抑制细胞增殖,因此saralasin 可能有助于雌激素受
体低表达的子宫内膜癌的治疗。     

Phosphatase and tensin homolog gene inhibits the effect induced by gonadotropin-releasing hormone subtypes in human endometrial carcinoma cells

Background Type I gonadotropin-releasing hormone （GnRH-l） agonists have been applied for the treatment of steroid-dependent tumors such as breast carcinoma, ovarian cancer and prostatic carcinoma. But the mechanism has not been clarified yet. There are few reports about the treatment of endometrial carcinoma using GnRH-l agonists. Type II GnRH （GnRH-ll） is a new subtype of GnRH. Our aim was to investigate the effects of GnRH-l agonists and GnRH-ll on estrogen receptor-negative human endometrial carcinoma cells and the effect from phosphatase and tensin homolog gene （PTEN） to them.Methods A lentiviral vector-mediated RNAi method was used to establish a PTEN-negative HEC-1A cell clone （HEC-1A-ND）. MTT and flow cytometry were used to detect the cell proliferation, cell cycle and apoptosis of HEC-1A, HEC-1A-NC and HEC-1A-ND cells after treatment with GnRH-l agonist Triptorelin （10-11 mol/L to 10-5 mol/L） or GnRH-ll （10-11 mol/L to 10-5 mol/L）. Western blotting was used to detect AKT and ERK1/2 activation after treatment with different concentrations of Triptorelin or GnRH-ll for 30 minutes in the above mentioned three kinds of cells. Results Triptorelin and GnRH-ll induced apoptosis and inhibited proliferation of HEC-1 A, HEC-1A-ND and HEC-1A-NC in a dose-dependent manner. This effect was augmented in HEC-1 A-ND cells in which PTEN gene was knocked-down. Furthermore, Triptorelin and GnRH-ll inhibited the AKT and ERK activity in HEC-1 A-ND cells.Conclusions Triptorelin and GnRH-ll can promote apoptosis rate and inhibit cell proliferation of estrogen receptor-negative endometrial carcinoma cells in a dose-dependent manner. PTEN gene can inhibit the effects of Triptorelin or GnRH-ll on human endometrial carcinoma cells.     

二甲双胍在体外对人子宫内膜癌细胞增殖的影响

目的流行病学研究表明二甲双胍可以降低糖尿病患者患癌的风险性和癌症相关的死亡率,本实验进一步探讨二甲双胍在体外对人子宫内膜癌细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法二甲双胍干预人子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞不同时间后,采用MTT法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western blotting法检测ERα及PTEN的表达。结果二甲双胍显著抑制两种子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖。流式细胞术检测显示二甲双胍使子宫内膜癌细胞停滞在G0/G1期,并且可以诱导细胞的凋亡。Western blotting法检测显示二甲双胍能够促进子宫内膜癌细胞ERα的表达;Ishikawa细胞无PTEN蛋白的表达,HEC-1A细胞则高表达PTEN。结论二甲双胍能抑制子宫内膜癌细胞的生长,其作用机制可能与促进ERα的表达有关。     

短发卡状RNA对AKT2基因表达的抑制诱导人胰腺癌细胞凋亡

目的:构建AKT2基因特异性短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,运用RNA干扰(RNA i)技术,观察其对人胰腺癌细胞SW 1990和Capan2中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用,并探讨其增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性,促进细胞凋亡的机制。方法:运用基因工程技术,设计合成针对AKT2 mRNA的特异性shRNA,构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体包裹转染人胰腺癌细胞SW 1990和Capan2,荧光显微镜观察细胞内红色荧光蛋白的表达,计算转染效率,RT-PCR、W estern B lot检测AKT2的表达及干扰效率,FACS检测细胞凋亡率来比较转染前后人胰腺癌细胞的抗凋亡能力。结果:①经双酶切及测序证实pAKT2-shRNA构建成功。②SW 1990和Capan2细胞转染pAKT2-shRNA后,荧光显微镜下观察,发红色荧光的细胞占总细胞数的35%~40%;RT-PCR和W estern B lot检测结果示,转染后AKT2 mRNA和蛋白表达显著降低。③FACS检测结果示,转染pA-KT2-shRNA后,紫杉醇30 nM作用24h,与对照组相比,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。结论:pAKT2-shRNA能有效抑制胰腺癌细胞AKT2基因表达,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。