脐带脱细胞支架培养鼠肝前体样细胞功能研究

目的对脐带脱细胞支架(Human Decellularized Umbilical Cord Scaffolds,dHUCs)进行制备和表征,评价三维支架上培养小鼠肝前体样细胞(Rodent hepatocyte-derived liver progenitor-like cells,rHepLPCs)功能,提供一种新型组织工程化肝脏构建的新方案。方法两步灌肝法分离小鼠原代肝细胞,体外扩增并用Dil标记。基于脐带脱细胞支架材料的三维培养下rHepLPCs,通过测定成分检测、化学染色等方法表征材料,通过定量PCR、氨清除和尿素合成等方法进行rHepLPCs-3D的功能评价。结果经过脱细胞工艺处理后,脐带生物支架材料核酸残留量为(60.20±1.42)ng/mg(干重),核酸去除率达到90.5%,基质成分含量丰富。小鼠肝前体样细胞体外扩增效果好,部分肝脏功能基因表达下降。支架培养2周后,ALB、G6PC和CPS1肝细胞功能基因的表达水平分别上调10.1±2.3、34.4±1.3、42.0±22.0倍。在氨代谢方面,2D培养的rHepLPCs氨清除量为(5.7±0.9)mg/(dL·106细胞·d),尿素含量为(7.1±2.5)mg/(dL·106细胞·d),而3D培养的rHepLPCs氨清除量为(26.7±4.5)mg/(dL·106细胞·d),尿素量为(42.1±7.0)mg/(dL·106细胞·d)。结论脐带脱细胞支架是理想的肝脏组织工程材料,3D培养rHepLPCs肝细胞功能明显提升,治疗以血氨升高为特征的急性肝衰竭具有明显优势。     

糖脂代谢异常对丙型肝炎病毒感染肝细胞SIRT1-AMPK信号通路的影响

目的探讨不同浓度的葡萄糖、油酸对丙型肝炎病毒(HCV)感染肝细胞沉默信息调节因子1(SIRT1)-AMP激活蛋白激酶(AMPK)信号通路的影响。方法表达HCV核心蛋白的质粒转染HepG2细胞。表达HCV核心蛋白的HepG2细胞在不同终浓度的葡萄糖或油酸的无血清DMEM培养液中孵育24h。分别应用液体闪烁计数仪和蛋白质印迹检测SIRT1和AMPK活性及蛋白的表达。结果随着葡萄糖浓度(1、2、4.5g/L)不断升高,SIRT1活性(1.0±0.2、0.6±0.15、0.2±0.05)及SIRT1蛋白表达(0.9±0.2、0.4±0.1、0.1±0.05)下降,AMPK活性(1.0±0.2、0.5±0.08、0.22±0.05)及p-AMPK蛋白表达(0.9±0.2、0.4±0.1、0.2±0.05)下降;随着油酸浓度(0、300、500uM/L)不断升高,SIRT1活性(1.0±0.2、0.6±0.1、0.2±0.05)及SIRT1蛋白表达(0.9±0.2、0.5±0.1、0.2±0.05)下降,AMPK活性(1.0±0.2、0.5±0.1、0.1±0.05)及p-AMPK蛋白表达(0.9±0.2、0.5±0.1、0.2±0.05)下降。结论高糖、高油酸可下调HCV感染肝细胞SIRT1-AMPK信号通路的活性及表达。     

细胞色素酶P4502E1介导的氧化应激对人肝星状细胞的活化作用

目的 研究细胞色素酶P4502E1(CYP2E1)介导的氧化应激对人肝星状细胞的活化作用. 方法 以CYP2E1为目的 基因,将CYP2E1表达载体PCI-CYP2E1及空载体PCI-neo转染到人肝癌细胞株HepG2细胞,分别为HepG2/CYP2E1,HepG2/PCI.检测HepG2/CYP2E1,HepG2/PCI及正常HepG23组细胞上清液中丙二醛(MDA)含量.将上述3种细胞分别与人肝星状细胞LX2共培养48 h,分别命名为CYP2E1/LX2组,PCI/LX2组,HepG2/LX2组,提取RNA、上清液,用羟脯氨酸(Hyp)试剂盒检测3组LX2上清液中Hyp含量,用逆转录多聚酶链反应检测LX2细胞内Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶2(MMP2)的mRNA水平,用酶联免疫吸附试验检测3组上清液中LX2分泌的Ⅰ型前胶原羧基肽(PICP)蛋白水平,用明胶酶谱法检测3组上清液中LX2分泌的MMP2酶活性.组间比较用单因素方差分析进行统计学分析. 结果 (1)HepG2/CYP2E1细胞、阴性对照组HepG2细胞及HepG2/PCI细胞的MDA值分别为(6.51±0.25)nmol/ml、(3.07±0.29)nmol/ml和(2.57±0.29)nmol/ml,F值为22.66,P值均<0.01.(2)HepG2/CYP2E1、HepG2、HepG2/PCI 3组细胞培养液中Hyp含量分别为(35.24±3.52)nmol/ml、(24.50±1.37)nmol/ml和(17.77±2.58)nmol/ml,F值为58.89,P值均<0.01; 3组LX2细胞Ⅰ型胶原mRNA水平表达,差异无统计学意义.CYP2E1/LX2组、阴性对照组HepG2组及PCI/LX2组LX2分泌的PICP蛋白吸光度值分别为540.01±11.38、262.57±15.61和231.59±12.76,F值为124.97,P值均<0.01; 3组LX2细胞内MMP2 mRNA水平表达、MMP2的酶活性,差异无统计学意义. 结论 CYP2E1可引起氧化应激,CYP2E可增加LX2细胞外Hyp的合成和分泌.CYP2E1活化了肝星状细胞,可促进其细胞外PICP合成与分泌.     

体外诱导人脐带间充质干细胞定向分化为肝细胞的研究

目的对肝组织匀浆上清液(LHS)体外诱导人脐带间充质干细胞(hUCMSC)定向分化为肝细胞的功能特性进行检测。方法选取第3代hUCMSC,采用LHS作为诱导培养基,实验分为对照组和LHS处理诱导组,每组有3、5、7 d三个时间点;诱导后对细胞进行AFP、CK1 8、TPH2、CYP3A4、Alb、HGF的免疫荧光细胞化学染色;并测定诱导前后CYP3A酶活性、Alb、HGF和尿素的分泌量。结果 LHS诱导3 d后细胞表达肝特异性蛋白AFP、CK18、TPH2、CYP3A4、Alb和HGF;对照组hUCMSC不同时间点CYP3A酶特异性代谢底物咪达唑仑的代谢量为0.026~0.03 0ng/mg,LHS诱导3、5和7 d后细胞代谢量分别为(30.14±1.19)、(50.20±6.24)和(120.85±15.52)ng/mg,与对照组相比显著升高(P0.01);对照组细胞3、5和7 d HGF的分泌量分别为(0.24±0.14)、(0.42±0.20)和(0.18±0.15)ng/mg,LHS诱导后细胞HGF的分泌量分别为(4.06±1.35)、(3.35±0.17)和(3.83±0.42)ng/mg,与对照组相比显著升高(P0.01);LHS诱导后各组细胞尿素分泌量增加14倍以上,与对照组相比显著升高(P0.01);对照组3、5和7 d Alb的分泌量分别为(22.66±2.99)、(16.99±2.90)和(15.37±1.86)μg/mg,诱导3、5和7 d后Alb的分泌量分别为(36.40±3.53)、(46.66±2.50)和(54.82±4.28)μg/mg,与对照组相比显著升高(P0.05或P0.01)。结论在体外经LHS诱导后,hUCMSC能够分化为具有成熟肝细胞功能的肝细胞。     

肝癌细胞对5-氮杂-2'-脱氧胞苷的敏感性与细胞总DNA甲基化水平无关

目的 比较不同肝癌细胞株对5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-dC)的敏感性,探讨肝癌细胞对5-aza-dC的敏感性是否与细胞总DNA甲基化水平有关.方法 用不同剂量(0.5、5.0、10.0μmol/L)的5-aza-dC处理肝癌细胞株(HepG2、QGY7701和HepG2.2.15细胞)及正常肝细胞株L02,比较不同浓度处理前后的细胞增殖抑制率,比较10 μmol/L 5-aza-dC处理前后的Caspase-3活性及细胞DNA片段化水平(5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入率),比较不同细胞总DNA甲基化水平.组间检测结果比较采用t检验.结果 5-aza-dC对HepG2、QGY7701、HepG2.2.15、L02细胞的半数抑制浓度分别为0.5、0.5、4.5、11.4μmol/L,与HepG2细胞和QGY7701细胞相比,HepG2.2.15绌胞和L02细胞对5-aza-dC不敏感.HepG2和QGY7701细胞中Caspase-3的活性升高较L02和HepG2.2.15细胞明显(P值均＜0.05),QGY7701细胞中5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入率升高较L02细胞明显(P＜0.05).L02、HepG2、QGY7701和HepG 2.2.15细胞的DNA总甲基化水平分别为11.7%±0.9%、10.9%±1.3%、11.7%±1.7%和12.2%±1.0%,差异无统计学意义(P值均＞0.05).结论 细胞对5-aza-dC的敏感性与细胞总DNA甲基化水平无关.     

miR-363靶向调控E2F3表达影响HepG2细胞增殖和凋亡研究

目的探讨微小RNA-363(miR-363)靶向调控E2F转录因子3(E2F3)的表达对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养HepG2细胞,采用Lipofectamine法将miR-363抑制剂或其阴性对照转染到HepG2细胞,继续培养48 h,收获细胞,采用四噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖率,使用流式细胞术法检测细胞凋亡率,采用实时荧光RT-PCR法检测HepG2细胞miR-363 mRNA水平,采用Western Blot法检测HepG2细胞E2F3、BAX和Caspase-3蛋白表达水平。结果对照组HepG2细胞增殖率为(96.4±9.7)%,显著高于抑制剂处理组[(72.3±6.5)%,P0.05],凋亡率为(8.2±1.4)%,显著低于抑制剂处理组[(9.7±0.8)%,P0.05];对照组HepG2细胞miR-363 mRNA相对水平为(1.0±0.1),显著高于抑制剂处理组[(0.6±0.2),P0.05],E2F3蛋白表达量为(1.0±0.1),显著高于抑制剂处理组[(0.6±0.1),P 0.05],而对照组HepG2细胞Bax和Caspase-3蛋白表达量分别为(0.4±0.0)和(0.5±0.1),均显著低于抑制剂处理组[(0.6±0.1)和(0.7±0.0),P均0.05]。结论 miR-363可靶向调控E2F3的表达,抑制HepG2细胞增殖,诱导其凋亡。本研究结果为肝癌靶向治疗提供了一定的理论依据。     

体外循环状态下新生小型猪肝细胞的活性

目的:观察体外循环状态下新生小型猪肝细胞的活性变化.方法:利用Cello培养循环式人工毛细管培养装置构建肝细胞循环系统,以50 mL/min的流速循环乳猪肝细胞悬液,分别观察循环8 h内肝细胞形态、活力和功能等的变化.结果:循环4 h后,乳猪肝细胞的活力和贴壁率下降,分别为76.1%±1.4%、62.8%±1.8%,氨清除率是对照组的62.7%±14.6%,继续观察发现,随着循环时间的延长,悬液中细胞碎片增多,LDH和AST显著升高(P<0.01),细胞活力、贴壁率、白蛋白和尿素合成率、氨清除率等均显著下降(P<0.05).结论:乳猪肝细胞悬液循环模式可用于生物人工肝BAL系统.     

十二种人肝细胞株肝脏功能水平的比较研究

目的初步研究12种常见人肝细胞株所具有的合成、代谢、解毒等肝脏的功能,了解它们作为人工肝生物材料的价值、不足与缺陷。方法通过实时定量PCR检测各肝细胞株肝脏功能相关基因的表达情况,细胞免疫荧光检测部分相关功能蛋白的表达,以及全自动生化分析仪检测各细胞培养上清中白蛋白和尿素氮的含量,并与新鲜分离的原代正常成人肝细胞相关功能指标进行比较。结果实时定量PCR检测发现肝脏功能相关基因的mRNA表达水平在不同肝细胞株中差异较大,HepG2、C3A和Hep3B2.1-7肝细胞特异性功能相对较好,尤其是合成功能。细胞免疫荧光证实了部分相关基因的蛋白水平表达,培养上清中白蛋白和尿素氮的含量与实时定量PCR检测结果基本相符。结论现有肝细胞株虽然具有正常肝细胞的一些特异性功能,但其活性水平均较低,需要进一步开展高活性的肿瘤来源人工肝专用肝细胞株的构建研究。     

成人原代肝细胞的分离、培养及冻存

目的:建立一种稳定的成人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源.方法:20例供肝采用离体两步胶原酶灌注技术分离成人原代肝细胞.选择7个不同的预培养时间点(2、6、12、24、36、48和72h),分离所获肝细胞按上述不同预培养时间在4℃人无血清培养基(HepatoZYME-SFM)中培养,然后收集预培养肝细胞转移到含100mL/L胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM中,再立即放入-80℃异丙醇冷冻盒过夜,次日投入液氮.分析比较各肝细胞在解冻后细胞活力率、贴壁率、白蛋白分泌及尿素合成.结果:在部分肝叶切除后使用离体两步胶原酶灌流技术分离所得肝细胞活率和贴壁率分别是75.0%±4.6%和72.0%±6.0%.4℃预培养12或24h被证明是最适预培养时间,这两个时间点的白蛋白分泌高于其他时间点(P<0.05).与立即冷冻组相比较,预培养12或24h肝细胞解冻后活力(61.4%±4.8%,62.0%±5.6%vs53.4%±4.2%)、贴壁率(63.2%±5.8%,62.6%±3.6%vs55.2%±4.6%)、白蛋白分泌及...     

原代猪肝细胞无血清培养

目的研究原代猪肝细胞无血清培养及肝细胞的功能。方法采用EGTA和胶原酶P两步法经肝静脉逆行灌注分离乳猪肝细胞,在无血清培养基中培养,并对不同培养时间的肝细胞生化合成及生物转化功能进行检测。结果肝细胞产量为（1．5±0．1）×10^10／肝,活率为（90．3±1．5）％,接种培养后肝细胞增生旺盛,LDH漏出第2天达到高峰,然后逐渐下降并稳定于一定水平。随着时间的延长及肝细胞数量的增加,自蛋白合成及利多卡因转化率逐渐增加,呈时间及肝细胞数量的依赖关系。结论采用本法分离获取的猪肝细胞产率高、活性强、具有良好的生物合成及生物转化功能,可作为生物人工肝较理想的肝细胞来源。     

二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌过程中PC3/BTG2基因表达的变化

目的 探讨PC3/BTG2在肝细胞癌形成过程中的变化趋势及作用.方法 建立改进的二乙基亚硝胺(DEN)诱发的大鼠肝癌模型.免疫组织化学法检测PC3/BTG2蛋白的表达情况,用RT-PCR和Western blot检测诱癌不同时期PC3/BTG2、p53、细胞周期素D1的mRNA和蛋白表达情况.统计学处理采用单因素方差分析.结果 PC3/BTG2蛋白在大鼠肝细胞中主要表达于细胞核,亦可见于部分细胞质,随着DEN诱癌过程的发展,PC3/BTG2的表达有由细胞核向细胞质易位的趋势.在DEN诱发的大鼠肝癌模型中,PC3/BTG2 mRNA早期表达增高,5周达高峰(0.653±0.023),晚期降低(16周为0.312±0.021);p53 mRNA早期增高(5周为0.493±0.027),晚期降低(16周为0.187±0.026);细胞周期素D1 mRNA早期未检测到,晚期增高并达高峰(16周为0.582±0.029).PC3/BTG2蛋白在诱癌早期表达增高,诱癌5周时达高峰(0.630±0.032),成癌后降低(16周为0.113±0.019);p53蛋白在诱癌早期及中期(5～12周)持续增高(12周为1.186±0.049),到成癌后降低(16周为0.622±0.035)l细胞周期素D1在整个诱癌过程中表达都高于正常对照大鼠,在肝癌形成时增高并达高峰(16周为0.912±0.038).结论 PC3/BTG2表达降低可能与HCC进展有密切联系;在肝癌形成过程中,PC3/BTG2与p53的表达可能存在正调控作用,而与细胞周期素D1可能存在负调控作用.     

大鼠肝细胞与人脐静脉内皮细胞混合共微囊化的体外研究

目的 观察人脐静脉内皮细胞(HUVECs)对共微囊化大鼠肝实质细胞的保护作用.方法 利用自制微囊发生器制备含肝细胞或肝细胞与HUVECs以10:1混合的微囊进行体外培养,同时建立非微囊化单独培养和共培养组,通过测定培养液中自蛋白、尿素的分泌量和肝细胞形态来判断肝细胞功能和活性.结果 肝细胞与HUVECs共培养或共微囊化均能提高前者的白蛋白分泌和尿素合成量(均P<0.01),存活时间延长;共微囊化组虽前7 d的白蛋白和尿素合成量较非微囊化共培养组低,但在7 d后的白蛋白和尿素合成量高于后者,且相对平稳.结论 肝细胞与HUVECs混合共微囊化能明显改善囊内肝细胞的形态、功能与寿命.     

生物人工肝乳猪肝细胞的聚集培养、冻存及形态、功能观察

目的　为构建生物人工肝进行肝细胞的准备。方法　采用胶原酶半原位灌流法分离单个乳猪肝细胞 ,并对其活力、单层、聚集培养及冻存复苏后培养的白蛋白、尿素合成功能进行检测。结果　采用本方法从每头乳猪中分离到的单个肝细胞数为 ( 3 .1± 1.5 )× 10 10 ,活性超过 95 %。在加入激素和生长因子的培养基中单层培养时 ,肝细胞功能良好 ,可维持 2周左右 ,而在未加入激素和生长因子的培养基中肝细胞虽能存活 1周 ,但功能于 2 4h后即丧失。球形聚集培养可实现肝细胞的大量培养 ,且生物学活性较单层培养显著提高。冻存复苏后肝细胞活力仍超过 90 % ,肝细胞功能与新鲜分离培养的肝细胞功能间无明显差异。结论　采用胶原酶半原位灌注法所得单个乳猪肝细胞基本满足构建生物人工肝对肝细胞数量的要求。聚集培养接种密度大 ,细胞生物学活性高 ,可用于构建生物人工肝。冻存复苏后肝细胞仍功能良好。     

转基因肝星状细胞株对肝细胞生长的支持作用

目的 探讨转基因肝星状细胞株CFSC／HGF对大鼠肝细胞生长的支持作用。方法将大鼠原代肝细胞培养于稳定表达肝细胞生长因子(HGF)的肝星状细胞株CFSC／HGF所构建的饲养层上,连续动态观察肝细胞的形态、超微结构、白蛋白分泌、尿素合成以及吲哚氰绿摄取排泌功能的变化,同时与传统胶原贴壁培养的肝细胞进行比较,并通过半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HGF受体c-Met表达的变化。结果共培养的肝细胞体外培养至7～10d时细胞增殖、白蛋白分泌及尿素合成达到峰值,以后逐渐下降,至35d时仍保持一定的存活和功能。与传统胶原上培养的肝细胞相比,其寿命、形态和功能的维持时间明显延长;RT-PCR结果显示,与CFSC／HGF饲养层细胞共培养1周后,肝细胞表面c-Met表达上调2．23倍。结论转基因肝星状细胞株CFSC／HGF对肝细胞较长时间内保持高活性、高密度的生长有显著的支持作用,CFSC／HGF诱导的肝细胞表面c-Met表达上调可能参与了该支持作用。     

猪骨髓间充质干细胞对共培养肝细胞的作用及其机制

目的 探索细胞外基质(ECM)在猪肝细胞与骨髓间充质干细胞(MSCs)体外共培养中的表达与分布规律. 方法自中华实验猪髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代;原位两步胶原酶法分离猪肝细胞后与MSCs随机混合培养,观察肝细胞形态和功能的变化情况.用免疫细胞化学染色法观察ECM的表达和分布情况.RNA干扰MSCs后继续观察共培养肝细胞的功能变化情况.多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法.结果 第3代MSCs纯度>90%;肝细胞活率>95%,纯度>99%.共培养组肝细胞迅速黏附于MSCs表面,呈肝细胞岛样分布.共培养组肝细胞白蛋白分泌水平和尿素合成能力自共培养第1天起均明显高于单纯肝细胞组(P值均<0.01),并在第2天达到高峰,分别为(457.71士22.62)ng和(69.05±2.12)μg.免疫细胞化学检测结果显示共培养组MSCs表达多种ECMl RNA干扰实验进一步证实ECM的存在与共培养中肝细胞的白蛋白分泌和尿素合成功能有关.结论 骨髓MSCs通过分泌多种ECM改善共培养肝细胞的形态与功能.     

T-cadherin启动子甲基化与人肝癌T-cadherin表达的关系

目的:探讨T-cadherin启动子甲基化与T-cadherin在肝细胞癌中表达的关系.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific PCR,MSP)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)和免疫印迹(Western blot)检测T-cadherin在肝细胞癌中启动子甲基化的状态及其对T-cadherin表达的影响.培养肝癌HepG2细胞,采用去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine处理后.Western blot检测T-cadherin表达,并观察T-cadherin表达对肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响.结果:T-cadherin在肝细胞癌中存在启动子甲基化(40%),肝细胞癌组织中T-cadherin启动子甲基化导致其表达明显下调(表达评分:0.227±0.875 vs 0.188±1.667,P<0.05):对存在T-cadherin启动子甲基化的HepG2细胞应用去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine培养能诱导HepG2细胞T-cadherin分子的重新表达,T-cadherin分子重新表达能抑制HepG2级胞增殖.结论:T-cadherin启动子的甲基化导致其表达下调;去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine能恢复HepG2细胞T-cadherin的表达,并抑制HepG2级胞增殖.     

足叶苦素抑制胰岛素样生长因子Ⅰ受体表达对肝癌细胞增殖与运动的影响

目的 观察足叶苦素(PPP)抑制胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-IR)后对肝癌细胞增殖和运动的影响. 方法 体外培养肝细胞L02和肝癌细胞(Bel-7404、Bel-7402、HepG2和Huh-7),以Western blot分析IGF-IR表达,以磺酰罗丹明B法分析细胞活性;在PPP抑制IGF-IR后,以流式细胞术分析细胞周期,以AnnexinV-FITC法分析细胞凋亡;在z-VAD-FMK抑制caspases后,以均质发光法检测caspase-3/7活性;划痕试验分析细胞运动能力.对数据进行析因设计方差分析,采用t检验或one-way ANOVA法进行组间比较.结果 肝细胞L02中几乎检测不到IGF-IR,各肝癌细胞中IGF-IR呈不同程度表达.PPP抑制肝癌细胞增殖呈时间和剂量依赖性,经1.0μmol/L PPP处理HepG2细胞24h,G1、S期和G2/M期细胞比例分别为2.1％±0.4％、11.0％±0.7％和87.1％±0.6％,且划痕不愈合;caspase-3/7活性显著增加(t=11.83,P＜0.01);HepG2细胞凋亡率为16.4％±0.4％,明显高于对照组的5.8％±0.2％ (t=14.05,P＜ 0.01);z-VAD-FMK抑制caspases表达,HepG2细胞凋亡率为11.3％±0.7％,明显高于对照组的5.8％±0.2％ (t=11.83,P＜0.01). 结论 IGF-IR表达与肝癌细胞增殖、运动和凋亡相关,可能是肝癌分子靶向治疗的有效靶点.     

丙型肝炎病毒核心蛋白下调沉默信息调节因子2相关酶1-AMP激活蛋白激酶信号通路活性致肝细胞能量代谢紊乱

目的 探讨沉默信息调节因子2相关酶1 (SIRT1)-AMP激活的蛋白激酶(AMPK)信号通路在HCV核心蛋白所致肝细胞能量代谢紊乱中的作用.方法 pcDNA3.1-core重组质粒转染HepG2细胞,流式细胞仪测定表达HCV核心蛋白的HepG2细胞的活性氧(ROS),液体闪烁计数仪测定ATP/ADP比例和AMPK α2酶活性,比色法测定烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态与还原态之比(NAD+/NADH),荧光定量检测SIRT1酶活性,RT-PCR和Western印迹检测SIRT1、AMPK α2的表达.计量资料比较采用t检验.结果 Western印迹检测证实,HepG2细胞表达相对分子质量为22 000的HCV核心蛋白.与HepG2细胞相比,表达HCV核心蛋白的HepG2细胞ROS水平升高(1.0±0.1比4.0±0.5,t=14.411,P＜0.01);ATP/ADP比例无明显变化(8.2±2.2比9.3±2.8,t=0.757,P＞0.05);AMPK α2酶活性(0.8±0.2比0.2±0,t=7.345,P＜0.01)明显降低;NAD+/NADH比例明显降低(0.08±0.02比0.02±0,t=7.348,P＜0.01);SIRT1酶活性[(0.30±0.05) pmol·μg 1·min-1比(0.15±0.04) pmol·μtg-1·min-1,t=5.738,P＜0.01)]明显降低;SIRT1 mRNA(0.8±0.2比0.4±0.1,t=4.382,P＜0.01)和AMPK α2 mRNA(0.9±0.3比0.2±0,t=5.715,P＜0.01)表达明显降低;SIRT1蛋白(0.8±0.2比0.3±0,t=5.941,P＜0.01)和磷酸化AMPK蛋白(0.5±0.1比0.1±0,t=9.608,P＜0.01)水平明显降低.结论 HCV核心蛋白能下调SIRT1-AMPK信号通路活性,导致肝细胞能量代谢紊乱.     

生物人工肝体外支持系统合成功能的评价

目的 对人肝细胞型体外生物人工肝进行生物合成功能的评价,藉以探讨其用于肝衰竭治疗的可能性。方法 用2×10~8个混合聚集球形培养的人肝细胞、肝非实质细胞与中空纤维型生物反应器组成体外生物人工肝支持系统(EBLSS),通过循环液(RPMI 1640)中肝细胞合成分泌产物的分析,评价其生物功能。结果 经过6小时的体外循环,循环液中总蛋白、白蛋白和甲胎蛋白含量均显著增加,尿素和葡萄糖水平也有明显改变,该循环液使体外培养大鼠肝细胞DNA合成率显著增加(与对照组比较P<0.01),实验后球形体肝细胞仍保持良好的活动。结论 由培养人肝细胞相中空纤维型生物反应器组成的体外生物人工肝具备肝脏生物合成功能,并有刺激肝细胞增殖的能力,对肝衰竭可能有一定的支持治疗作用。     

MicroRNA-377和组蛋白甲基转移酶SMYD3在肝细胞癌中的表达及两者的相关性

目的:探讨microRNA-377(miR-377)与组蛋白甲基转移酶SMYD3在肝癌中的表达规律及与肝癌的相关性.方法:利用实时定量PCR分别检测不同肝组织及肝细胞系中miR-377表达水平, 应用实时定量PCR和Western blot分别检测不同肝组织及肝细胞系中SMYD3 mRNA和蛋白水平的表达情况. 通过转染miR-377模拟物上调其在肝癌细胞株HepG2中表达后, 应用实时定量PCR、Western blot分别检测转染前后HepG2中SMYD3 mRNA和蛋白表达的变化.结果:MiR-377 mRNA在人肝癌旁组织和肝癌组织中的表达较正常肝脏明显降低(0.331±0.059, 0.139±0.064 vs 0.874±0.178, 均P <0.05);在HepG2中的表达较L-02明显降低(0.145±0.021 vs 0.868±0.194, P <0.05).SMYD3 mRNA和蛋白质在人肝癌旁组织和肝癌组织中的表达较正常肝脏明显升高(mRNA: 3.836±0.137, 5.836±0.965 vs 1.235±0.332;蛋白: 0.381±0.020, 0.484±0.030 vs 0.252±0.015;均P <0.05). SMYD3 mRNA和蛋白质在肝癌细胞系HepG2中的表达较正常肝细胞系L-02明显升高(mRNA: 0.845±0.047vs 0.348±0.134;蛋白: 0.575±0.008 vs 0.259±0.007, 均P <0.05). 转染miRNA-377模拟物上调HepG2中miR-377表达后转染组SMYD3mRNA和蛋白表达较空白组和阴性对照组均明显下降(mRNA: 0.125±0.010 vs 0.857±0.163, 0.779±0.167;蛋白: 0.092±0.026 vs0.347±0.040, 0.383±0.054, 均P <0.05).结论:miRNA-377在肝癌中表达明显下调,其靶基因SMY D3表达上调;表达下调的miRNA-377丧失对SMYD3表达的抑制可能是肝癌发生的重要机制.