肠三叶因子启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析

目的:克隆肠三叶因子(ITF)启动子序列,构建ITF启动子荧光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法:运用PCR方法从人全血基因组DNA中获得目的基因;双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建不同长度的ITF启动子报告基因载体(-100--1 826bp);将重组质粒转染至HEK293细胞和LS174细胞48h后,采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果:PCR扩增出不同长度的ITF启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染HEK293细胞和LS174细胞后检测启动子活性,100和200bp启动子活性较低,而300至1 826bp启动子活性较强。结论:成功构建了ITF启动子报告基因载体,具有活性的启动子最小长度为300bp。     

含hITF启动子的荧光素酶报告质粒的构建及活性检测

目的构建含有人肠三叶因子(intestinal trefoil factor,hITF)启动子的荧光素酶表达载体,并检测启动子活性。方法采用PCR技术从LS-174T细胞基因组DNA中扩增出长约2.5kb的含hITF基因启动子片段(-2331/+53),而后在此基础上构建了10个不同长度的启动子序列至pGL-3basic荧光素酶表达载体,然后将这些重组质粒转染HEK-293细胞并在48h后检测其荧光素酶活性。结果插入的hITF启动子片段测序结果显示正确,-500/+53,-400/+53和-300/+53片段活性介于0.023～0.026之间,-200/+53,-100/+53和-50/+53活性介于0.0032～0.0042之间,明确了最小活性功能域位于-300/+53区域,-300/-200区域对hITF转录起始起关键性作用。结论成功构建了含hITF启动子的萤火虫荧光素酶报告基因质粒,鉴定出人肠三叶因子(hITF)启动子活性位于-300/-200区域。     

人三叶因子3基因启动子区的生物信息学分析

目的人三叶因子3(human trefoil factor 3,hTFT3)是一种具有胃肠黏膜修复和保护作用的小分子多肽,文中利用生物信息学在线软件预测hTFF3基因启动子功能。方法获取hTFF3基因启动子全长序列,利用多种在线相关软件预测出CpG岛及转录因子结合部位。结果 hTFF3基因序列全长为2295 bp,核苷酸数据库(GenBank)登录号为AB038162.1。hTFF3启动子存在于非编码区上游1500bp内,启动子序列中未发现CpG岛,启动子区共发现204个转录因子。结论生物信息学在线软件能预测hTFF3基因启动子功能,提高了针对启动子的研究效率。     

酪酸梭菌对实验性溃疡性结肠炎小鼠ITF、NF-κB和TNF-α表达的影响及意义

目的观察酪酸梭菌对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的实验性溃疡性结肠炎（UC）小鼠结肠粘膜中ITF、NF-κB和TNF-α表达的影响,了解酪酸梭菌治疗UC的效果及可能的作用机制。方法用3%的DSS建立小鼠溃疡性结肠炎的模型。60只BALB/c小鼠随机分为正常组、模型（空插灌胃针）组、阴性对照（生理盐水）组、阳性对照（美沙拉嗪）组、酪酸梭菌低剂量（106CFU/ml）组、高剂量（107CFU/ml）组。观察小鼠疾病活动指数（DAI）评分和肠道病理形态改变,以检测各处理组的效果;免疫组化法检测结肠组织中ITF和NF-κB的表达;放射免疫法检测TNF-α的表达。结果酪酸梭菌可以影响急性期UC小鼠的一般情况,降低DAI积分,减轻肠道的组织学损伤程度;与模型组和阴性对照组相比,结肠中ITF的表达升高（P〈0.05）;NF-κB和TNF-α的表达下降（P〈0.05）,其中低剂量组和阳性对照组效果相当（P〉0.05）。结论酪酸梭菌对急性UC有治疗作用,疗效与剂量有一定的相关性,其部分机制可能与酪酸梭菌增加ITF的表达,抑制NF-κB和TNF-α的表达有关。     

JAK-STAT3与EGFR-STAT3信号通路在非小细胞肺癌演进中的作用

JAK—STAT3信号通路和EGFR—STAT3信号通路在非小细胞肺癌（NSCLC）中呈过度激活状态,增加了癌细胞的恶性表型。通过对这两条信号通路的抑制可逆转或减慢癌细胞的恶性转化进程。以它们为治疗靶点的药物已在临床中取得一定疗效,相关的研究将会进一步深入。本文将对这两条信号通路在NSCLC演进中的作用做一综述。     

大鼠舌下腺TFF2、TFF3在实验性胃溃疡愈合过程中表达的变化

目的探讨舌下腺三叶因子2(TFF2)和三叶因子3(TFF3)在大鼠实验性胃溃疡自愈期间表达的变化。方法雄性SD大鼠分为溃疡组(42只)和正常对照组(6只)。溃疡组在胃前壁近胃窦处将0.01ml冰醋酸注入黏膜下层制作实验性胃溃疡模型,对照组不作任何处理。分别以免疫组织化学S-P法和RT-PCR检测溃疡组和正常组舌下腺TFF2及TFF3基因和多肽表达情况。结果 TFF2及TFF3免疫反应阳性物质主要位于纹状管、闰管和肌上皮细胞,管腔内亦有阳性物质表达。TFF2的积分光密度在溃疡第1天时与正常组相比明显增高,第2天最低,第4、第6天逐渐升高(P<0.01),第10～23天均维持在较高水平(P<0.05);而TFF3的积分光密度在溃疡第1、第2天时接近正常组,第4、第6天逐渐增强并高于正常组(P<0.05),到第10天达高峰(P<0.01),至第23天仍高于正常组(P<0.05)。RT-PCR显示TFF2mRNA和TFF3mRNA的转录情况与相应多肽的表达趋势相似。结论舌下腺TFF2和TFF3基因在大鼠实验性胃溃疡自愈期间表达增高,可能参与胃溃疡愈合过程的调节。     

HIV-1 Tat通过抑制启动子活性调控MCAK基因表达

目的验证HIV-1Tat对有丝分裂着丝点关联驱动蛋白MCAK基因表达的调节作用并探讨其分子机制。方法利用表达Tat的人横纹肌肉瘤细胞(TE671)模型及原核表达纯化的Tat蛋白,通过Northern印迹法和蛋白印迹技术验证HIV-1 Tat对MCAK基因表达的抑制作用。PCR扩增MCAK基因各启动区片段,与荧光素酶报告质粒相连接,并转染到TE671细胞,通过荧光素活性分析法检测DNA片段启动活性,确定MCAK基因的活性启动区域。进一步通过HIV-1Tat与MCAK启动区作用,分析Tat对启动子活性的调控作用。结果Northern印迹和蛋白印迹结果证实Tat蛋白对MCAK转录、翻译水平的表达都有强烈的抑制作用;荧光报告质粒检测系统分析表明MCAK的核心启动区存在于-399～+1bp区域,且其启动子活性在Tat存在的情况下受到明显的抑制。结论HIV-1 Tat能作用于MCAK基因启动区-399～+1bp区域,导致MCAK启动子活性降低,从而抑制MCAK基因的表达。     

GPC3启动子报告基因载体构建与转录活性分析

目的 构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)启动子荧光素酶报告基因载体,并验证其转录活性.方法 以人类基因组DNA为模板,PCR扩增GPC3启动子基因片段,克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上,通过转染HepG2细胞检测荧光素酶活性来验证GPC3启动子的转录活性.结果 GPC3基本启动子和全长启动子分别成功构建到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中,GPC3基本启动子具有很强的转录活性,而全长启动子的转录活性比基本启动子高4倍以上.结论 成功构建了GPC3启动子荧光素酶报告基因载体,为研究GPC3转录调控提供了重要手段.     

hTFF3基因真核表达载体构建及表达鉴定

 目的克隆人肠三叶因子基因hTFF3,构建重组真核表达载体pEGFP-C1-TFF3,并在真核细胞中表达。方法应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,从真核细胞中扩增得到人TFF3的全长序列,克隆至表达增强型绿色荧光蛋白载体中,经酶切、PCR鉴定后测序证实克隆成功。将重组载体转至真核细胞,荧光显微镜观察下转染效率,同时采用RT-PCR、Western blot技术检测外源基因TFF3的表达。结果成功将hTFF3基因克隆到真核表达载体中,酶切片段与预期大小一致（200 bp）。在荧光显微镜下观察转染后的细胞可见明显的绿色荧光,RT-PCR及Western blot结果表明：转染后的细胞中TFF3 在转录和翻译水平的表达均有明显提高。结论成功构建了真核表达载体pEGFP-C1-TFF3,并在真核细胞中显著表达,为进一步研究TFF3 因子的生物学功能奠定了基础。     

小鼠miR-155基因启动子分析及转录活性鉴定

目的：鉴定小鼠miR-155基因启动子转录活性区域,预测转录因子结合位点,探讨miR-155在巨噬细胞极化中表达失调的转录调控机制。方法：分别构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。将miR-155表达载体与miR-155启动子荧光素酶报告载体瞬时共转染人胚肾上皮细胞293T,48 h后检测双荧光素酶活性。选取miR-155基因转录起始位点(TSS)上游2 000 nt作为启动子区,生物信息学预测该区域可能结合的转录因子,并在体外极化的M1型和M2型巨噬细胞中检测结合的相关转录因子的表达。结果：成功构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。双荧光素酶试验结果显示,小鼠miR-155基因TSS上游1～500 nt、1～1 000 nt及1～2 000 nt片段均存在转录激活作用,提示小鼠miR-155基因TSS上游1～2 000 nt均为miR-155基因的启动子区域,其中1～500 nt为启动子核心区域。转录因子的生物信息学预测结果显示,miR-155基因TSS上游1～2 000 nt...     

纤维连结蛋白启动子的克隆及其活性的测定

目的:克隆纤维连结蛋白(Fibronectin,FN)启动子和检测启动目的基因转录活性。方法:从正常人gD-NA中扩增FN启动子,驱动氯霉素乙酰转移酶报告基因表达,构建其重组体报告载体。利用脂质体介导的转染技术导入HT1080细胞,检测重组体的瞬时表达,确定克隆FN启动子转录活性。结果:克隆的FN启动子在HT1080细胞中活性比SV40启动子稍强。结论:成功的克隆FN启动子,在HT1080细胞中有活性,为运用FN启动子和特异性靶细胞治疗各种遗传性疾病提供了一定基础。     

PI3K信号通路调控中枢敏感化的研究进展

PI3K被激活后可通过产生的第二信使作用于其下游的相关蛋白或激酶,激活不同的效应子,参与多种生物学效应.目前研究发现PI3K-TRPV1、PI3K-PKB/Akt和PI3K-AChRs等多种信号通路可调控痛觉超敏,PI3K信号通路后既可促进炎性疼痛易化的产生和维持,又有助于神经病理性疼痛的发展.     

肠三叶因子对胃黏膜上皮细胞增殖的影响及其信号转导机制的研究

目的：肠三叶因子（ intestinal trefoil factor , ITF）对胃黏膜具有保护作用,但其机制尚不明确。文中探讨重组ITF对胃黏膜上皮细胞增殖能力的影响及其可能作用的分子机制。方法将体外培养的GES-1细胞分为3组,其中1组作为细胞增殖活力实验空白对照组,其他2组分别加入浓度为100和500 ng/mL的人重组ITF形成低浓度ITF组和高浓度ITF组。光镜下观察细胞形态,并采用CCK-8试剂盒检测GES-1细胞的增殖活力。体外培养的GES-1细胞株分别用100 ng/mL的ITF和浓度为15μmol/L的PI3 K/Akt 信号通路抑制剂LY294002进行处理,分为信号通路蛋白表达实验空白对照组、ITF组、LY294002组和ITF＋LY294002组,光镜下观察细胞形态。随后采用CCK-8试剂盒检测GES-1细胞处理后的增殖活力,采用Western blot检测PI3K/Akt信号通路中p-Akt和Akt蛋白的表达情况。结果与空白对照组相比, ITF刺激下GES-1细胞增殖活力明显增强,且ITF浓度越高、增殖活力越强。使用LY294002处理后,能够显著抑制ITF刺激的细胞增殖。 Western blot检测结果表明,ITF提高了p-Akt蛋白的表达水平,激活PI3K/Akt信号通路。结论 ITF促进GES-1细胞的增殖,推测其分子作用机制主要是通过激活PI3K/Akt信号通路促进细胞增殖。     

Observation on Effects of Aconitine via Acupoint Injection in Rabbits

Objective:To investigate the ability of the pericardium meridian(PM) to mitigate or enhance the cardiotoxic effects of aconitine injected at specific acupoint and non-acupoint sites in rabbits.Methods:This study consisted of 3 experiments that were designed to test the effects of injection of 30μg/kg of aconitine at acupoints on the PM(Test 1),at non-acupoint sites on the PM(Test 2),and at acupoints on other meridians and non-meridian sites(Test 3).In Test 1,24 rabbits were randomly assigned to receive injections at Quze (PC3),Tianquan(PC2),or intramuscularly.In Test 2,24 rabbits were randomly assigned to receive injections of aconitine at non-acupointⅠ,non-acupointⅡ,or intramuscularly.In Test 3,48 rabbits were randomly assigned to receive injections at Neiguan(PC6),Sanyinjiao(SP6),Yangjiao(GB35),a non-meridian and non-acupoint site (NMNA),intravenously,and intramuscularly.Electrocardiographs of the rabbits were performed before,during and after injection to determine the incidence of arrhythmia,latency of ventricular rhythm,and recovery rate after aconitine injection.The recovery time index and extent of arrhythmia scores were calculated.Results:In all groups the incidence of arrhythmia was 100%,and the latency of ventricular rhythm was less than 30 min.In Tests 1 and 2,the recovery rates of the Quze and non-acupoint II groups were significantly higher than those of the muscular group(P<0.05).In Test 3,the recovery time index and extent of arrhythmia scores of the Neiguan group were low.There were no significant differences between the other acupoint groups,or the NMNA group, when compared with the group receiving aconitine intramuscularly.Conclusions:Acupoints or non-acupoints along the PM could reduce the severity of the arrhythmia induced by aconitine in healthy rabbits.Meridians play an important role in protecting body functions.     

肠三叶因子在大鼠肠道中表达的实验研究

目的 研究肠三叶因子（ＩＴＦ）及其ｍＲＮＡ大鼠肠道的分布规律。方法 采用原位杂交、免疫组化等手段观察了ＩＴＦ及ＩＴＦｍＲＮＡ在大鼠肠道的表达并使用高效液相色谱仪检测了不同肠段ＩＴＦ的含量。结果 从十二指肠至结肠均有ＩＴＦ及ＩＴＦｍＲＮＡ表达，主要分布于肠绒毛杯状细胞，其中ＩＴＦｍＲＮＡ仅在杯状细胞的基底和边缘表达，其它区域的杯状细胞则呈ＩＴＦｍＲＮＡ阴性反应，同时发现部分其它部位的肠上皮细胞中亦有     

系统性红斑狼疮患者皮损组织及外周血单核细胞中JAK-STAT1信号转导途径活化的研究

目的:研究系统性红斑狼疮(SLE)患者皮损组织及外周血单核细胞中Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信号转导和转录激活子1(STATl)信号转导途径的活化及其反馈抑制因子细胞因子信号抑制因子-1(SOCS-1)的表达情况,初步探讨其在红斑狼疮发病机制中的作用.方法:随机选择45例活动期SLE患者及30例正常对照者,采用...     

大鼠神经干细胞中PI3-K/AKT信号转导通路的研究

目的 应用PI3-K特异性阻滞剂LY294002孵育大鼠神经干细胞（NSCs）,探讨PI3-K/AKT信号转导通路在NSCs中的作用。方法 体外分离、培养E15～16 胎鼠NSCs,应用不同浓度（0~40 μmol/L）的LY294002孵育NSCs后进行细胞存活(WST-8检测)、增殖(BrdU免疫组织化学鉴定)、分化(β Tubulin-Ⅲ免疫组织化学鉴定)和AKT磷酸化蛋白水平(Western Blotting)的检测。结果 LY294002对NSCs的存活、增殖和分化的影响呈剂量依赖性。在LY294002较高浓度（25、30、35、40 μmol/L）时,NSCs的存活率明显下降（P<0.05）;LY294002为30、35、40 μmol/L时,BrdU阳性细胞数明显少于正常对照组（LY294002 0 μmol/L）（P<0.05）;LY294002为35、40 μmol/L时,β Tubulin-Ⅲ的阳性细胞数明显少于正常对照组（P<0.05）。LY294002 阻断AKT表达的作用呈剂量依赖性。结论 PI3-K/AKT信号转导通路对大鼠NSCs的存活、增殖、分化起重要作用。     

SOCS3经JAK/STAT信号通路调控气道黏蛋白高分泌

目的 研究细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)在炎症情况下经JAK/STAT通路调控气道黏液高分泌.方法 培养人气道16HBE上皮细胞,设置空白对照组、白介素(IL)-6处理组、IL-6和microRNA (miR)-203处理组,Westernblot法分析细胞中磷酸化JAK激酶(p-JAK1/2)、SOCS3、黏蛋白(MUC) 5AC蛋白水平;Real-time法检测各组细胞中SOCS3、STAT3、MUC5AC mRNA表达量;ELISA法检测各组培养上清液中p-JAK1/2、SOCS3、MUC5AC蛋白含量.结果 在IL-6刺激下,IL-6处理组的p-JAK1/2、SOCS3、MUC5AC蛋白量及SOCS3、STAT3 mRNA含量较空白对照组显著升高(P＜0.05),IL-6和miR-203处理组的p-JAK1/2、MUC5AC蛋白量及STAT3 mRNA含量较IL-6处理组显著升高(P＜0.05),但SOCS3 mRNA与IL-6处理组比较差异无统计学意义,SOCS3蛋白含量较IL-6处理组显著降低(P＜0.05).结论 细胞在IL-6刺激后SOCS3呈现高表达,同时经JAK/STAT信号通路负反馈调控MUC5AC.     

大鼠神经干细胞中PI3-K/AKT信号转导通路的研究

目的 应用PI3-K特异性阻滞剂LY294002孵育大鼠神经干细胞(NSCs),探讨PI3-K/AKT信号转导通路在NSCs中的作用.方法 体外分离、培养E15～16 胎鼠NSCs,应用不同浓度(0~40 μmol/L)的LY294002孵育NSCs后进行细胞存活(WST-8检测)、增殖(BrdU免疫组织化学鉴定)、分化(β Tubulin-Ⅲ免疫组织化学鉴定)和AKT磷酸化蛋白水平(Western Blotting)的检测.结果 LY294002对NSCs的存活、增殖和分化的影响呈剂量依赖性.在LY294002较高浓度(25、30、35、40 μmol/L)时,NSCs的存活率明显下降(P<0.05);LY294002为30、35、40 μmol/L时,BrdU阳性细胞数明显少于正常对照组(LY294002 0 μmol/L)(P<0.05);LY294002为35、40 μmol/L时,β Tubulin-Ⅲ的阳性细胞数明显少于正常对照组(P<0.05).LY294002 阻断AKT表达的作用呈剂量依赖性.结论 PI3-K/AKT信号转导通路对大鼠NSCs的存活、增殖、分化起重要作用.