生物型人工肝用肝细胞源研究现状及展望

作为肝衰竭(hepatic failure,FHF)有效治疗手段,生物型人工肝(Bioartificial liver,BAL)可以比较全面的替代肝脏解毒、生物合成和分泌代谢等功能。BAL由三部分组成:(1)生物成分;(2)生物反应器;(3)辅助循环装置:包括外部控制系统和体外循环系统。肝细胞作为其生物成分是BAL发展的关键因素,理想的BAL肝细胞应具有人源化,易获取,可快速、稳定增殖,而且能在数天或数周内保持良好的分化状态,能在体外完成合成和解毒功能。但BAL的     

中空纤维生物反应器的建立及其功能的初步鉴定

目的构建生物反应器并评估其生物学功能。方法采用自主建立的永生化HepG2细胞系为生物材料,以中空纤维构建生物反应器,观察肝细胞在生物反应器内生长情况,同时进行肝细胞功能检测,以肝衰竭患者血浆置换出的废弃血浆作为试验因素,试验性行生物人工肝治疗。结果该系统内肝细胞生长良好,每个生物反应器培养72h后细胞数量达7．60×10^8个,肝细胞活力保持90％以上。AST、LDH低水平波动;利多卡因转化实验良好;对细胞培养液进行细菌培养监测及支原体检测,均未发现异常。应用肝衰竭患者血浆500ml培养肝细胞6h,总胆红素平均下降98．6μmol／L。结论建立的永生化肝细胞系应用中空纤维构建生物反应器,肝细胞功能良好,经进一步改进有望应用于生物人工肝治疗。     

脐带脱细胞支架培养鼠肝前体样细胞功能研究

目的对脐带脱细胞支架(Human Decellularized Umbilical Cord Scaffolds,dHUCs)进行制备和表征,评价三维支架上培养小鼠肝前体样细胞(Rodent hepatocyte-derived liver progenitor-like cells,rHepLPCs)功能,提供一种新型组织工程化肝脏构建的新方案。方法两步灌肝法分离小鼠原代肝细胞,体外扩增并用Dil标记。基于脐带脱细胞支架材料的三维培养下rHepLPCs,通过测定成分检测、化学染色等方法表征材料,通过定量PCR、氨清除和尿素合成等方法进行rHepLPCs-3D的功能评价。结果经过脱细胞工艺处理后,脐带生物支架材料核酸残留量为(60.20±1.42)ng/mg(干重),核酸去除率达到90.5%,基质成分含量丰富。小鼠肝前体样细胞体外扩增效果好,部分肝脏功能基因表达下降。支架培养2周后,ALB、G6PC和CPS1肝细胞功能基因的表达水平分别上调10.1±2.3、34.4±1.3、42.0±22.0倍。在氨代谢方面,2D培养的rHepLPCs氨清除量为(5.7±0.9)mg/(dL·106细胞·d),尿素含量为(7.1±2.5)mg/(dL·106细胞·d),而3D培养的rHepLPCs氨清除量为(26.7±4.5)mg/(dL·106细胞·d),尿素量为(42.1±7.0)mg/(dL·106细胞·d)。结论脐带脱细胞支架是理想的肝脏组织工程材料,3D培养rHepLPCs肝细胞功能明显提升,治疗以血氨升高为特征的急性肝衰竭具有明显优势。     

人工肝用肝细胞的培养及相关技术研究现状

近年来人工肝技术在临床上得到了快速发展,明显降低了肝衰竭的病死率[1,2].生物型人工肝(Bio-artificial liver,BAL)可以较好的替代肝脏解毒、生物合成和分泌代谢等功能,是国内外研究的热点.肝细胞是生物型人工肝发展的关键因素,如何得到满意的生物人工肝用肝细胞、实现肝细胞的体外大规模培养和冻存,使其快速、稳定增殖,而且能在数天或数周内保持良好的分化状态,能在体外完成合成和解毒功能,近年来有较多研究.现就目前BAL用肝细胞培养和相关技术的研究现状作一介绍.     

生物人工肝在肝衰竭治疗中的应用

生物人工肝一般是指以培养肝细胞为基础的体外生物人工肝支持系统(EBLSS)。从理论上讲,以肝细胞为材料的生物人工肝最能代替正常肝脏的功能,为暴发性或急性肝衰竭(FIIF/ALF)患者提供可靠的过渡支持治疗,使患者通过自身肝再生或肝移植而恢复。 1.基本原理:生物人工肝是肝细胞培养技术与血液净化技术相结合的产物,其基本原理是将体外培养增殖的肝细胞(人肝细胞、哺乳动物肝细胞或肝细胞系)置于特殊的生物反应器内,利用体外循环装置将肝衰竭患者血液或血浆引入生物反应器,通过反应器内的半透膜与肝细胞进行物质交换与生物作用。由于这一过程如正常机体血液流过肝脏肝窦一样,一方面血液中的毒性物质被培养肝细胞摄取、转化、代谢,另一方面血液中因肝功能衰竭而缺乏的机体必需物质由培养肝细胞合成、补     

高血氨致大鼠急性肝损伤新模型的建立与初步分析

目的 依次建立大鼠急性肝衰竭模型,D-氨基半乳糖(D-gal)急性肝损伤模型和氯化铵(NH4Cl)诱导急性肝损伤模型,探索肝衰竭中高血氨再次诱导肝细胞损伤机制.方法 (1)大鼠急性肝衰竭动物模型建立:将雄性SD大鼠36只分为等渗盐水对照组(n=10),12h急性肝衰竭模型组(n=10),24h急性肝衰竭模型组(n=16);D-gal 400 mg/kg+脂多糖50μg/kg混合剂量给予各组大鼠腹腔注射,分别在给药后12h或24h处死各组大鼠.(2) NH4C1所致肝脏损伤动物模型的建立:将雄性SD大鼠40只分为3组:NH4Cl模型组(n=20),D-gal肝脏损伤组(n=10)和等渗盐水对照组(n=10);NH4C1模型组每8h给予NH4C1 10 ml/kg灌胃,急性D-gal肝脏损伤组则于大鼠腹腔每6d注射1次D-gal (800 mg/kg),对照组为等渗盐水10 ml/kg灌胃,30d后处死各组大鼠.(3)分别检测大鼠血氨,血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AS2);凝血酶原时间活动度比率(PT-A),甲胎蛋白(AFP),γ-谷氨酰转移酶(GGT);肝脏HE染色后观察病理变化和细胞凋亡指数;统计学分析采用秩和检验.结果 在大鼠急性肝衰竭动物模型中,12h后出现转氨酶升高[ALT和AST分别为(1202.51±282.00) U/L和(1560.14±298.98) U/L],血氨随之升高[(165.9±23.6)μmol/L],24h检测ALT、AST和血氨分别为(774.40±207.65) U/L、(967.60±121.94)U/L和(143.4±18.1)μmol/L,与等渗盐水对照组比较,P值均＜0.05.24h后转氨酶和血氨下降,但未发现AFP(除急性肝衰竭24h组外)、GGT变化;肝脏病理检查显示各组肝细胞出现片状弥漫性出血性坏死,淤血,并有灶状出血,伴随细胞凋亡指数逐渐上升.但在NH4C1所致急性肝脏损伤中,6h后即检测到血氨升高,ALT和AST同比增加,30d后检测血氨,ALT和AST进一步升高,但AFP,GGT与对照组相比,无明显差异;HE染色未见肝细胞明显变性、坏死和淋巴细胞浸润,无肝细胞再生或纤维组织增生.另外,30 d NH4Cl模型组和D-gal肝损伤组内肝组织均见较多的凋亡细胞,但D-gal肝损伤组可见明显炎性细胞侵润.除血氨外,其余检测指标与NH4C1组差异均无统计学意义.结论 在急性肝衰竭模型中,血氨随着肝细胞坏死而升高,相同血氨浓度可以导致大鼠肝脏再次损伤,但这种损伤与D-gal诱导肝损伤明显不同:不是通过肝细胞坏死,炎症细胞侵润实现,而是可能通过细胞凋亡途径,抑制肝细胞再生,进一步导致肝细胞功能受阻.     

第十三讲重型肝炎的人工肝支持治疗

人工肝是一种代替肝脏功能的治疗手段，系在体外采用某种具有解毒、代谢等作用的装置和方法来代偿肝脏功能，对急性肝衰竭(ALF)患者起辅助支持治疗作用。目前已用于重型肝炎治疗的人工肝技术和方法主要有血液灌流、血浆置换、培养肝细胞型生物人工肝等，均有较好的疗效。     

N-乙酰半胱氨酸对C3A永生化肝细胞解毒代谢功能的影响

目的:研究N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对慢性重型肝炎肝衰竭时肝细胞解毒代谢功能的影响,并比较NAC与还原型谷胱甘肽(GSH)的疗效.方法:体外慢性重型肝炎患者血浆(chronic severe hepatitis plasma,CSHP)培养C3A细胞,并同时分别加入大、中、小三个剂量NAC及对应剂量的GSH,以正常血浆(normal human plasma,NHP)及培养基(100 mL/L FBS-MEM)为对照,分别于24、48、72h 3个时间点检测细胞内GSH及脂质过氧化物(MDA)的含量,并检测安定代谢量的变化.结果:24、48、72h 3个时间点.培养基组、正常血浆组、各剂量NAC治疗组和GSH治疗组C3A细胞中GSH含量与安定代谢量均分别高于慢性重型肝炎血浆组(GSH:F=246.116,235.489,201.536,均P＜0.01;安定代谢量:F=306.812,476.722,502.061,均P＜0.01),而慢性重型肝炎血浆组C3A细胞中MDA含量均分别高于上述各组(F=332.48,662.349,492.983,均P＜0.01).慢性重型肝炎血浆+NAC组与慢性重型肝炎血浆+GSH组比较,前者细胞内的GSH含量和对安定的代谢量,大、中、小剂量组均分别高于后者对应剂量组(P＜0.01),而前者细胞内的MDA含量,大、中、小剂量组均分别低于后者对应剂量组(P＜0.01).结论:NAC可以显著改善慢性重型肝炎肝衰竭时肝细胞解毒代谢功能,GSH也有相似功效,且相同摩尔剂量的NAC效果要优于GSH.     

生物型人工肝的新种子细胞来源-诱导性多潜能干细胞

生物型人工肝在严重广泛肝细胞功能受损特别是急性肝衰竭的临床应用方面获得了一致认可,而肝细胞的获取是生物型人工肝的根本所在,无论是何种来源的肝细胞,获取后其功能正常高效发挥是所有工作的导向。因此,获取良好状态的人工肝种子细胞是一切工作的前提。由于分化、培养和增殖等方面的限制,获取人工肝种子细胞的常规途径并不能满足临床对种子细胞的需求。2006年日本学者通过重编程体细胞成功诱导成具有多分化潜能的iPS细胞,这为生物型人工肝在获取安全有效种子细胞来源方面带来了新的曙光,本文主要论述iPS细胞的来源、分化及其特性,以及将其应用于临床特别是生物型人工肝所面临的主要问题,并对其前景进行探讨。     

生物人工肝用C3A细胞在零下非结冰时的保存

目的:探讨零下非结冰保存肝细胞的效果及其与细胞凋亡的关系.方法:UW液保存的C3A细胞悬液分为3组:-0.8℃组(零下非结冰组),0℃组(0℃非结冰组),4℃组(对照组).低温保存24、48及72 h后,采用流式细胞术分别测定细胞存活率及凋亡率,同时测定LDH、乳酸释放,细胞内ATP含量、尿素合成功能及白蛋白分泌功能,同时观察细胞形态.结果:零下非结冰组较0℃非结冰组及对照组明显提高了低温保存72 h的C3A细胞的存活率(86.49%±2.80%vs 81.50%±2.83%.77.83%±3.40%,均P<0.05),降低了细胞凋亡率(1.26%±0.84%vs 5.34%±1.20%,9.16%±1.99%,均P<0.05);明显抑制了低温保存72 h乳酸以及LDH释放(乳酸:10.38μg/106 Cells±1.40 μg/106 cells vs 12.02 μg/106cells±1.64μg/106 cells,17.41μg/10°cells±2.40μg/106cells:LDH:80.10 U/L±11.10 U/L vs 12004U/L±14.32 U/L,148.98 U/L±15.37 U/L,均P<0.05);更好地维持了低温保存72 h C3A细胞内ATP含量、尿素合成功能、及白蛋白分泌功能(均P<0.05).形态上,零下非结冰组保存细胞死亡比例少,细胞接触良好,未见对照组及0℃非结冰组细胞膜周围出现"毛刺"样改变及细胞内的"空泡样"改变.结论:在零下非结冰条件下保存肝细胞,建立一个"血库样"(ready to use)肝细胞库,可以有效促进生物人工肝的发展.     

乳猪肝细胞的分离培养及其功能

目的探讨乳猪肝细胞分离和培养的条件及其功能．方法用门静脉插管原位灌注结合胶原酶消化法分离乳猪肝细胞,应用条件培养基对其进行体外培养,观察其形态、增殖。分化和功能等方面的变化．结果发现乳猪肝细胞的得率为（７．２±２．２）×１０９／肝,活率为９５．０％±３．０％,体外培养的乳猪肝细胞,在长达９０ｄ的培养时间内能较好地维持其形态,原代和传代培养的乳猪肝细胞其ＤＮＡ和蛋白质的合成及ＡＬＴ和Ｇ—６—ＰＤ的活性相比,虽有变化,但趋势相同,两者无统计意义（Ｐ＞０．０５）．结论体外培养的乳猪肝细胞,在一定的培养条件下,能维持其生物学特性,可作为混合型生物人工肝的细胞成分     

C3A永生化肝细胞系的部分功能评价

全面检测肝永生化细胞系的功能,对评价其功能状态、比较不同肝细胞系的差别、研究生物人工肝的疗效、判断药物对肝细胞功能的影响,以及改建与优化更好的肝细胞系等方面具有重要的意义。C3A细胞是目前用于临床研究的生物人工肝永生化肝细胞系,它从肝纤维母细胞瘤细胞转化获得。本研究以C3A细胞为对象,对反映肝细胞生长增殖、蛋白合成、代谢、分泌、抗氧化的部分指标进行检测,以期建立较全面反映其功能状态的检测方法，为其细胞改建与功能优化提供依据，为新一代生物反应器及生物人工肝发展服务。[第一段]     

血浆置换对慢加急性(亚急性)肝衰竭患者外周血CD34~+细胞生物学活性的影响

目的研究慢加急性(亚急性)肝衰竭患者血浆置换前后机体内环境的改变对外周血CD34+细胞生物学活性的影响。方法采用含慢加急性(亚急性)肝衰竭患者血浆置换前后血清的培养基体外培养患者外周血CD34+细胞,通过比较2组细胞的生长曲线,及RT-PCR检测细胞表面标志物PK-M2、Integrin-β1、L-PK的表达,免疫荧光检测细胞表面标志Integrin-β1的表达情况,了解血浆置换后机体内环境的改善对外周血CD34+细胞生物学活性的影响。计量资料组间比较采用重复测量资料方差分析。结果血浆置换后组外周血CD34+细胞的增殖明显优于含血浆置换前血清培养组(P 0. 05);血浆置换前组与血浆置换后组均能检测到PK-M2、Integrin-β1,未检测到L-PK。结论血浆置换对肝衰竭患者机体内环境的改善有利于维持外周血CD34+细胞的生物学活性,有助于提高干细胞移植治疗肝衰竭的疗效。     

人工肝血浆置换治疗肝衰竭的临床观察

目的观察血浆置换术(PE)治疗肝衰竭的疗效。方法回顾性分析2012年1月至2013年6月收治的肝衰竭患者的临床资料,PE组33例肝衰竭患者在内科综合治疗基础上加用血浆置换治疗,对照组30例肝衰竭患者予内科综合治疗,观察两组患者治疗2周后临床症状、并发症发生情况、肝功能生化指标的变化等,随访治疗后3个月内病情转归情况并分析影响疗效的因素。实验检测数据用均数±标准差(x±s)表示,计量资料用t检验进行比较,计数资料采用χ2检验或Fisher确切概率法。结果予血浆置换治疗后,患者乏力、纳差、腹胀等临床症状明显改善,血清中ALT、TBil水平较治疗前降低[(390.48±536.52)U/L vs(81.03±47.58)U/L;(479.27±130.01)μmol/L vs(244.64±151.05)μmol/L,P值均0.01],Alb、胆固醇(CHO)、凝血酶原活动度(PTA)水平较治疗前升高[(33.06±5.42)g/L vs(35.24±3.68)g/L;(2.50±1.24)mmol/L vs(3.59±0.86)mmol/L;(34.16±5.33)%vs(73.98±27.23)%,P值均0.01],对照组治疗后ALT、TBil、Alb、CHO、PTA水平较治疗前差异无统计学意义(P0.05);PE组患者好转率明显高于对照组(χ2=8.276,P0.01),而病死率低于对照组(χ2=13.258,P0.01);PE治疗效果与治疗前TBil水平、并发症、胆酶分离、年龄≥40岁有关(P0.05),TBil、胆酶分离是影响PE疗效的独立危险因素(P0.05,OR值分别为1.01、8.75);术中共发生不良反应8例次,予对症处理后均可好转并完成治疗。结论 PE治疗肝衰竭安全有效,有临床推广价值。TBil、胆酶分离是影响PE疗效的独立危险因素。     

解毒凉血方含药血清调节TGFβ1/Smad信号通路对急性肝衰竭肝细胞凋亡的抑制作用

目的:研究解毒凉血方含药血清对TNFα联合ActD诱导肝衰竭肝细胞凋亡的抑制作用及机制。方法:采用人正常肝细胞Chang liver及肿瘤细胞HepG2筛选解毒凉血方含药血清的有效比例。干预组采用有效比例的解毒凉血方含药血清预刺激24 h,然后采用TNFα联合ActD刺激Chang liver模拟急性肝衰竭肝细胞凋亡,流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,免疫荧光实验检测凋亡肝细胞TBFβ1的表达及分布,免疫印迹法检测TGFβ1/Smad信号通路中TGFβ1、p-TβRⅡ、Smad7及p-Smad2/3的表达水平。结果:15%(体积比)解毒凉血方含药血清对TNFα联合ActD诱导的肝细胞凋亡具有抑制作用,15%解毒凉血方含药血清组细胞凋亡率显著低于模型组及空白血清组(P<0.01);与模型组及空白血清组比较,15%解毒凉血方含药血清预处理组胞质中TGFβ1、p-TβRⅡ以及Smad2/3磷酸化(p-Smad2/3)均低水平表达,而Smad7表达水平较高(均P<0.05)。结论:解毒凉血健脾方含药血清对TNFα联合ActD刺激诱导的急性肝衰竭肝细胞凋亡具有抑制作用,其机制可能与调节...     

永生化人肝细胞系的建立及其鉴定

目的 建立永生化的人肝细胞系,为生物人工肝、肝细胞移植、体外药物代谢等提供细胞模型.方法 应用胶原酶等四步灌流法分离获得原代人肝细胞,以含有SV40大T抗原(SV40LT)的重组反转录病毒对原代人肝细胞进行永生化,并对永生化人肝细胞进行生物学特性鉴定.结果原代人肝细胞经含有SV40 LT的重组反转录病毒感染3～4周后,获得2株永生化人肝细胞系,分别命名为HepLi2和HepLi3,永生化人肝细胞在相差显微镜下具有典型的肝细胞形态.Western印迹显示有SV40 LT基因的蛋白表达;RT-PCR显示永生化人肝细胞有Alb、谷胱甘肽S转移酶(GSTp)、人凝血因子X(HBCF-X)和β-actin mRNA表达,有细胞色素(CY)P450亚型(CYP3A5、CYP2E1、CYP2C8-19、CYP3A4)mRNA的表达;在HepILi2和HepLi3永生化人肝细胞的培养上清液中可检测到ALT、乳酸脱氢酶(LDH)和Alb.结论 新建立的永生化人肝细胞系具有正常人肝细胞的生物学特性以及完善的肝细胞CYP450酶功能,可进一步用于肝细胞药物代谢研究.     

体外诱导人脐带间充质干细胞定向分化为肝细胞的研究

目的对肝组织匀浆上清液(LHS)体外诱导人脐带间充质干细胞(hUCMSC)定向分化为肝细胞的功能特性进行检测。方法选取第3代hUCMSC,采用LHS作为诱导培养基,实验分为对照组和LHS处理诱导组,每组有3、5、7 d三个时间点;诱导后对细胞进行AFP、CK1 8、TPH2、CYP3A4、Alb、HGF的免疫荧光细胞化学染色;并测定诱导前后CYP3A酶活性、Alb、HGF和尿素的分泌量。结果 LHS诱导3 d后细胞表达肝特异性蛋白AFP、CK18、TPH2、CYP3A4、Alb和HGF;对照组hUCMSC不同时间点CYP3A酶特异性代谢底物咪达唑仑的代谢量为0.026~0.03 0ng/mg,LHS诱导3、5和7 d后细胞代谢量分别为(30.14±1.19)、(50.20±6.24)和(120.85±15.52)ng/mg,与对照组相比显著升高(P0.01);对照组细胞3、5和7 d HGF的分泌量分别为(0.24±0.14)、(0.42±0.20)和(0.18±0.15)ng/mg,LHS诱导后细胞HGF的分泌量分别为(4.06±1.35)、(3.35±0.17)和(3.83±0.42)ng/mg,与对照组相比显著升高(P0.01);LHS诱导后各组细胞尿素分泌量增加14倍以上,与对照组相比显著升高(P0.01);对照组3、5和7 d Alb的分泌量分别为(22.66±2.99)、(16.99±2.90)和(15.37±1.86)μg/mg,诱导3、5和7 d后Alb的分泌量分别为(36.40±3.53)、(46.66±2.50)和(54.82±4.28)μg/mg,与对照组相比显著升高(P0.05或P0.01)。结论在体外经LHS诱导后,hUCMSC能够分化为具有成熟肝细胞功能的肝细胞。     

生物型人工肝治疗肝衰竭的研究进展

肝脏作为人体中最重要的器官之一,承担着合成、分泌、代谢、解毒等多种复杂的功能,各种原因一旦造成肝细胞的大量坏死,将出现肝衰竭,导致机体代谢紊乱和毒性物质的堆积,而这反过来又加重了肝细胞的损伤,影响肝细胞的再生,形成肝衰竭的恶性循环。生物人工肝治疗的原理是基于肝损伤的可逆性及肝细胞的可再生性,希望通过体外辅助装置来暂时替代衰竭的肝脏功能,从而为肝移植或者肝再生赢得时间,创造条件。     

肝细胞来源的肝前体样细胞对巨噬细胞的调控作用研究

目的 探究人类肝细胞来源的肝前体样细胞(HepLPC)对巨噬细胞亚群M1及M2的影响.方法 采用肝细胞扩增培养体系(TEM)将原代肝细胞体外扩增转分化为HepLPC,培养过程收集HepLPC条件培养上清,离心后冻存备用.巨噬细胞为C57小鼠骨髓来源(BMDM),通过红细胞裂解处理后,加入小鼠GM-CSF 40 ng/m...     

解决生物人工肝细胞源匮乏的可能途径——干细胞

以培养肝细胞为材料、生物反应器为核心的生物人工肝,不仅能为肝衰竭患者等待肝移植争取时间,而且可为肝再生恢复创造条件.然而,由于人肝细胞来源的困难、哺乳动物肝细胞传播动物源性传染病的可能性、永生化肝细胞株的功能差异以及远期致瘤危险等,使细胞源成为生物人工肝进一步临床研究与应用的瓶颈.自1998年Thomson等报道胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESc)建株以来,干细胞(stem cells)的研究引起了人们的极大兴趣.干细胞的可塑性使其有可能成为解决生物人工肝细胞源匮乏的途径.