小鼠胎肝激酶-1阳性细胞向胆管细胞和肝细胞分化

干细胞对再生医学和人工器官的发展具有巨大潜在应用价值.肝脏可能是再生医学的一个很有吸引力的目标,理由是:(1)肝脏是一种多种遗传性和获得性代谢性疾病的易损器官;(2)增殖肝可接受来自同基因供者的肝细胞.     

骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞的诱导分化

目的:探讨大鼠骨髓间充质细胞向肝细胞祥细胞的诱导分化,观察诱导分化细胞的形态和分子生物学特性,及其对急性肝损伤大鼠的治疗作用.方法:分离、培养并纯化大鼠骨髓间充质细胞.培养基中加入肝细胞生长因子(HGF)、纤维生长因子-4(FGF-4)及上皮细胞生长因子(EOF),分别于7、14、21、28 d观察细胞形态变化,采用RT-PCR方法检测细胞白蛋白(ALB)、甲种胎儿球蛋白(AFP)、细胞角蛋白-18(CK-18)的mRNA表达.将诱导分化28 d的细胞经DAPI染料染色后,经门静脉注入同种异体大鼠体内,经24、48、72及168 h分批处死大鼠,观察大鼠肝组织内荧光细胞的分布.大鼠腹腔注射硫代乙酰胺制作急性肝衰竭模型,将1×106及5×106个诱导分化细胞经门静脉注入大鼠体内,经48、168 h采血查肝功,168 h处死大鼠,取肝组织病理学检查.结果:大鼠间充质细胞经上述3种细胞因子诱导后,形态和生物学行为方面都发生向肝细胞样细胞方面的转化,经门静脉注入大鼠体内后,有大量该种细胞在肝组织内分布,24 h荧光细胞最多,随时间延长逐渐减少,可持续7 d.骨髓间充质细胞的诱导分化细胞经门静脉注入肝损伤模型大鼠体内后,大鼠肝功能有所好转,注入1×106细胞大鼠ALT由注入前238.0±113.5 U/L,48 h后降至189±68.4 U/L,168 h后降至149.0±54.2 U/L,TBIL由注入前2.9±1.6 μmol/L,48 h至3.0±1.4 μmoI/L,168 h至1.3±0.3 μmol/L;注入5×106个细胞者(ALT)由注入前238.0±113.5 U/L,48 h后降至169.7±46.0U/L,168 h后降至103.7±46.0 U/L,TBIL由注入前2.9±1.6μmol/L,48 h至2.9±1.3μmol/L,168 h至0.9±0.3 μmol/L.结论:大鼠骨髓间充质细胞可在某些细胞因子的诱导作用下发生类肝细胞样转化,将转化细胞经门静脉植入同种异体大鼠体内后可在肝组织内存活并对大鼠肝损伤有一定修复作用.     

肝再生大鼠血清诱导骨髓干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的观察肝大部切除大鼠再生血清和肝细胞生长因子(HGF)诱导骨髓干细胞向肝实质细胞分化的作用；探讨骨髓干细胞向肝细胞分化和增殖的体外培养条件和方法，为患者应用自身骨髓细胞修复损伤肝脏提供实验依据。方法制作肝大部切除大鼠肝再生动物模型，收集术后24h血清；分别应用鼠肝再生血清和HGF对大鼠骨髓细胞进行定向诱导分化培养；以免疫组化、RTPCR和western blot等方法对分化不同阶段细胞进行检测。将分化细胞经尾静脉输入同系大鼠，观察输注细胞在肝、脾内的生长情况。结果活体移植分化细胞能定向迁移至肝和脾；体外及体内分化细胞在mRNA水平和蛋白质水平均表达白蛋白，并在一定时期内表达甲胎蛋白。结论大鼠骨髓干细胞在肝大部切除再生血清或HGF的诱导下能横向分化为肝实质样细胞。     

肝星状细胞诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化的体外研究

目的 研究肝星状细胞(HSC)在体外培养的卵圆细胞向成熟肝细胞分化过程中所起的作用.方法 (1)将卵圆细胞分别与原代培养的HSC混合共培养(混合共培养组),采用Millicell小室不接触共培养(不接触共培养组),卵圆细胞单独培养作为对照组.在共培养后第7、14、21天观测,采用Western blot和荧光定量PCR检测肝细胞核因子4 α(HNF-4 α)、白蛋白和甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK-19)的表达量;(2)电子透射显微镜观察卵圆细胞超微结构的变化;(3)过碘酸希夫染色检测各时间点卵圆细胞内糖原颗粒的含量;(4)酶联免疫吸附法检测各时间点卵圆细胞分泌白蛋白的含量.统计学处理采用重复测量资料的多因素方差分析和LSD-t检验.结果 (1)卵圆细胞第7、14、21天表达HNF-4 α和白蛋白的mRNA的量(相对与共培养之前的表达量的倍数):混合共培养组HNF-4 α分别为(1.9±0.2)倍、(10.7±1.2)倍、(12.0±1.3)倍;白蛋白mRNA的量分别为(5.7±1.6)倍、(110.7±13.7)倍、(173.6±22.3)倍;不接触共培养组HNF-4 α分别为(1.4±0.1)倍、(3.2±0.6)倍、(8.9±1.4)倍;白蛋白mRNA的量分别为(2.9±1.4)倍、(22.3±8.5)倍、(96.3±16.3)倍.共培养组(混合共培养与不接触共培养组)的表达量均高于对照组,LSD-t值分别为32.98,10.08;13.38,7.96; P值均<0.01,差异有统计学意义.第7、14、21天AFP、CK-19的表达量:混合共培养组AFP分别为(1.1±0.2)倍、(0.2±0.0)倍、(0.0±0.0)倍;CK-19分别为(0.2±0.1)倍、(0.0±0.0)倍、(0.0±0.0)倍;不接触共培养组AFP分别为(1.0±0.2)倍、(0.2±0.1)倍、(0.1±0.0)倍;CK-19分别为(0.6±0.1)倍、(0.1±0.0)倍,(0.0±0.0)倍.共培养组(混合共培养与不接触共培养组)的表达量均低于对照组.LSD-t值分别为37.99,34.50;13.59,22.46;P值均<0.01,差异有统计学意义.(2)卵圆细胞共培养后白蛋白分泌量明显增加:混合共培养组:14 d为(15.30±0.09)ng/ml、21 d(20.98±0.12)ng/ml,不接触共培养组14 d为(11.41±0.13)ng/ml,21 d为(15.12±0.17)ng/ml,混合共培养组高于不接触共培养组,LSD-t=251.94,P<0.01,差异有统计学意义.(3)随着共培养时间的延长,卵圆细胞内质网、线粒体和高尔基体等细胞器逐渐丰富,且细胞间形成毛细胆管结构.(4)过碘酸希夫染色显示共培养后卵圆细胞内出现大量红色糖原颗粒.结论 HSC可以诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化,HSC除了通过细胞因子等可溶性因子途径发挥作用外,与卵圆细胞的直接接触也有着重要作用.     

人骨髓单个核细胞向肝细胞诱导分化的体外研究

目的 探讨在HGF、FGF_4诱导下骨髓单个核细胞能否向肝细胞分化。方法 找健康忐愿者,年龄4～50岁,胸骨抽取骨髓,用淋巴分离液分离出骨髓单个核细胞,用含2％胎牛血清和1×ITS的DMEM培养,分别用单独HGF、单独FGF_4、HGF和FGF_4联合刺激、无生长因子4种处理因素进行诱导培养,分别于诱导培养0、7、14、21、28天时,留取细胞,用免疫细胞化学法检测CK18、AFP、白蛋白,用PAS法进行糖元染色试验以验证诱导分化的结果。结果 0天时,AFP、白蛋白少数细胞阴性,CK18阴性,糖元未见阳性;加生长因子的三组AFP在7、14天时表达逐渐增高,21、28天减弱;糖元、CK18、白蛋白表达逐渐增高。无生长因子组,在7、14、21、28天时,这此指标均未见表达。结论 在HGF、FGR_4诱导下,骨髓单个核细胞可分化为具肝细胞表型和功能的细胞。     

不同来源干细胞向肝细胞分化研究进展

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,包括胚胎干细胞和成体干细胞.干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响.干细胞的应用是目前生命科学领域的研究热点.现就不同来源干细胞向肝细胞的分化研究进展情况综述如下.     

骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的研究

骨髓间充质干细胞(MSC)是一类具有自我增殖和分化潜能的细胞.在特定条件诱导下可向多系细胞分化.近年来,MSC向肝系细胞分化的研究越来越受到人们的关注.一系列实验证明MSC在一定条件下可向肝细胞分化.其向肝细胞分化的机理以及诱导分化条件的优化还在进一步研究之中.     

间充质干细胞向肝细胞诱导分化的研究进展

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）作为一种多能干细胞,具有横向分化能力,在组织工程、基因工程以及临床应用上有着巨大的应用价值。我国是肝病大国,肝硬化、肝癌和肝衰竭已成为众多肝病患者的最终归宿。干细胞移植为治疗终末期肝病提供了新的希望,而间充质干细胞以其独特的优势,得到许多研究者的青睐。     

骨髓间充质干细胞向肝细胞的诱导分化

目的:探索肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M(OSM)在体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向肝细胞分化的能力及效果.方法:分离、培养大鼠MSCs,取第3代按以下分组诱导其向肝细胞分化:A组:低糖杜氏改良培养基(DMEM-LG) 100 mL/L胎牛血清(fetal calf,serum,FCS);B组:肝细胞生长培养基(HGM);C组:HGM 20μg/L HGF;D组:HGM 20μg/L OSM;E组:HGM 20μg/L HGF 20μg/L OSM,于不同时间点用免疫细胞化学检测甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18(CK18)表达,高碘酸-希夫氏(PAS)染色检测糖原表达,谷氨酰胺脱氢酶法检测上清液尿素含量.结果:C,E组于诱导第7天出现AFP阳性表达,以后其阳性表达率随诱导时间延长逐渐降低,诱导第7天E组阳性表达率高于C组(x~2=6.322,P<0.05).C组、E组分别于诱导第7、14天出现CK18阳性表达,于诱导第7天开始出现糖原阳性表达,随诱导时间延长表达率逐渐增高,同一时间点E组CK18(14 d:x~2=4.811,P<0.05;21 d:x~2=6.902,P<0.01;28 d:x~2=5.771,P<0.05)及糖原(14 d:x~2=6.902,P<0.01;21 d:x~2=6.818,P<0.01;28 d:x~2=6.818,P<0.01)阳性表达率高于C组.C,E组培养上清液中尿素浓度随诱导时间延长逐渐增高,E组增长幅度比C组高.A,B,D组各时间点均未见AFP、CK18、糖原表达及尿素浓度变化.结论:MSCs具有向肝细胞分化的能力,HGF能够诱导MSCs分化肝样细胞,OSM与HGF联合使用,能促进MSCs的分化,明显提高分化率.     

脂肪间充质干细胞向肝细胞横向分化的研究

目的探讨脂肪源性间充质干细胞（AMSC）向肝细胞横向分化的可能性。方法胶原酶消化脂肪组织,贴壁培养,体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增3代的AMSC分为2组,诱导分化组在含有2％FBS的DMEM-F12培养基中加入肝细胞生长因子20 ng/ml和成纤维细胞生长因子4 10 ng/ml、1×ITS和地塞米松0．1μmol/L,培养14 d；空白对照组则不加任何细胞因子。RT-PCR检测诱导分化过程中肝细胞核因子1、GATA4等基因转录水平的变化。2周后,采用流式细胞术检测AFP和Alb阳性细胞在两组细胞中的比例,检测肝细胞特异性细胞角蛋白（CK） 18、CK19的表达。结果分离、培养的AMSC呈成纤维细胞样生长,可以稳定传代。流式细胞术检测结果显示第3代脂肪间充质干细胞高表达表面CD29、CD44；不表达CD34、CD45。RT-PCR检测诱导5、8、11、14 d的细胞,显示有肝细胞特异性转录因子GATA4和肝细胞核因子1A基因的表达,并随时间延长而逐渐增多。流式细胞术检测诱导14 d的细胞,发现30．0％的细胞表达Alb,17．8％细胞表达AFP,双阳性的细胞为6．9％；免疫荧光检测发现诱导细胞表达CK18、CK19。空白对照组脂肪间充质干细胞则未见上述各项变化。结论在低血清培养体系中,采用细胞因子联合诱导,显示脂肪间充质细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞。     

增强CT瘤内动脉鉴别肝内胆管细胞癌和低分化肝细胞癌的价值

目的:探讨动态增强计算机断层扫描(computed tomography,CT)的影像特征对肝内胆管细胞癌和低分化肝细胞癌的鉴别价值.方法:回顾性分析68例行动态增强CT扫描并经病理证实为肝内胆管细胞癌患者28例、低分化肝细胞癌患者40例的临床资料及影像学资料.结果:单因素分析显示分叶征(P=0.010)、肝内胆管扩张(P=0.031)、肿瘤内肝动脉(P=0.020)、环形强化(P=0.002)、延迟强化(P=0.021)、迅速廓清(P0.001)征象在肝内胆管细胞癌组和低分化肝细胞癌组较差异有统计学意义(P0.05).Logistic回归多因素分析显示肿瘤内肝动脉征象是肝内胆管细胞癌重要的独立预测因素(P=0.026),13例(46.43%)病例显示此征象.迅速廓清征象在低分化肝细胞癌的重要识别征象(P=0.015),25例(62.5%)病例显示此征象.结论:动态增强CT中瘤内动脉征象是肝内胆管细胞癌的重要识别因素,而迅速廓清则支持低分化肝细胞癌的诊断.准确的影像学诊断为及时制定合理的治疗方案提供客观依据.     

iPS细胞向肝系细胞诱导分化的研究进展

诱导多能干细胞(iPS细胞)具有和胚胎干细胞(ES细胞)类似的功能,却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理问题,可诱导分化为有功能的肝细胞,为干细胞移植提供新的种子细胞.此文对iPS细胞向肝系细胞分化的研究现状予以阐述,从而为iPS细胞的应用研究提供借鉴.     

胆汁化血清对骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞定向分化的诱导

目的:寻找生物人工肝和肝细胞移植需要合适的肝细胞来源,研究不同诱导方法对骨髓间充质干细胞(MSC)在体外分化为肝细胞样细胞的影响。方法:本研究应用贴壁法对MSC进行分离和培养后,应用胆汁化血清及肝细胞生长因子不同诱导方式对之进行诱导分化,研究MSC转化为肝细胞样细胞的可能性,并进行转化的鉴定。结果:经贴壁分离和培养的MSC在5%胆汁化血清诱导作用下,21 d后可分化为形态似肝细胞样的细胞,经免疫组织化学显示,该细胞可表达细胞角蛋白18(CK18)和甲胎蛋白(AFP),且原位杂交显示,在培养的第35天,部分细胞还可合成清蛋白,与肝细胞生长因子(HGF)有着相似的诱导效果。结论:在合适的条件下,MSC可向肝细胞方向转化,且本方法操作简捷,胆汁化血清易于获得,具有潜在的应用价值。     

共同培养诱导骨髓基质干细胞向肝细胞分化的研究

目的 探索大鼠骨髓皋质干细胞（MsCS）向肝细胞分化的能力，及肝细胞生长的微环境埘其诱导分化的作用。方法 采用梯度离心法，获取大鼠骨髓基质干细胞；改良的两步法获取大鼠肝细胞。将鉴定的MsCS和肝细胞以半透膜相隔共同培养，以单独培养的MSCs作对照。在第1、3、7．14．21、28天，分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学分析检测甲胎蛋白（AFP）、白蛋白、细胞角蛋白l8（CK-l8）的基因和蛋白表达。结果在MSCs与肝细胞共同培养过程中，MSCs出现明显的细胞形态、体积和数量变化，可见双核或多核细胞，细胞轮廓较清晰。RT-PCR检测：共同培养的MSCs第7天即出现AFP基因表达，第14天表达增强，第21天表达减弱；第14天开始出现白蛋白、CK-18基因表达，并持续表达。单独培养的MSCs均无表达。共同培养的MSCs，于第7天进行免疫细胞化学检测，AFP即呈阳性；第14天白蛋白和CK-18也呈阳性；单独培养的MSCs未见AFP、白蛋白及CK-18表达。结论 大鼠骨髓基质干细胞与肝细胞共同培养，可被诱导分化为肝细胞。     

骨髓基质干细胞向肝细胞的定向分化及体内移植

目的:研究骨髓基质干细胞(BMSCs)在体外向肝细胞的定向分化和体内移植后对小鼠受损肝脏的修复作用.方法:在体外培养体系中用肝细胞提取液(HE)模拟体内肝脏微环境,诱导BMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学和吲哚靛青绿(ICG)染色检测其分化程度.将5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的BMSCs移植入小鼠体内,免疫组织化学方法显示BMSCs在肝脏的分布,血清酶学检测肝脏受损小鼠移植后7,14,28d谷草转氨酶(AST,nkat/L)、谷丙转氨酶(ALT,nkat/L)和碱性磷酸酶(AKP,nkat/L)的含量变化.结果:在体外BMSCs可由HE诱导分化成肝细胞,但HE诱导组α1-抗胰蛋白酶(4d:52.5±3.9vs76.8±4.5,P<0.05;14d:60.3±6.1vs85.4±7.6,P<0.05;21d:80.5±8.0vs105.7±8.6,P<0.05)和白蛋白(4d:43.2±6.5vs71.6±7.6,P<0.05;14d:61.5±10.4vs93.6±13.9,P<0.05;21d:80.6±17.1vs128.3±22.2,P<0.05)表达量少于HGF诱导组;体内移植后BMSCs整合于肝实质内;肝脏受损小鼠移植BMSCs后,血清中ALT(7d:493.43±120.02vs696.81±140.03,P<0.01;14d:558.45±130.03vs780.16±151.7,P<0.01;28d:583.45±138.36vs880.18±170.53,P<0.01)、AST(7d:1521.97±186.7vs2342.14±208.38,P<0.01;14d:1590.32±200.04vs2692.21±238.38,P<0.01;28d:1625.33±208.38vs2872.24±281.72,P<0.01)和AKP(7d:1.24±0.22vs1.78±0.18,P<0.01;14d:1.21±0.21vs2±0.19,P<0.01;28d:1.32±0.19vs2.27±0.2,P<0.01)比损伤组小鼠相应值均有下降,但仍高于正常对照组.结论:BMSCs在体外可由HE诱导分化成肝细胞,在体内移植后可促进小鼠受损肝脏的修复.     

肝细胞条件培养液对人脂肪问充质干细胞向肝细胞分化和增殖的作用

目的 探讨人脂肪间充质干细胞在改良的诱导体系下向肝细胞的分化和增殖情况,为肝组织工程提供新的种子细胞来源.方法 从人脂肪组织分离出脂肪间充质干细胞,用含有碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4的肝细胞诱导液进行诱导,并于诱导7 d后加入抑瘤素M.用细胞计数试剂盒-8法检测整个诱导过程细胞的增殖情况;通过光学显微镜观察诱导细胞的形态变化;用RT-PCR法和免疫荧光法分别检测肝细胞特异性基因和蛋白的表达;并对多种肝细胞特异性功能进行检测.组间比较采用t-test检验.结果 用改良肝细胞诱导液培养的人脂肪间充质干细胞在培养第5、7、14、21天时,细胞数均明显多于用对照培养液培养的细胞(f值分别为6.59、8.69、15.94和24.64,P值均＜0.05).诱导细胞表现出上皮样肝细胞形态,表达肝细胞特异性基因和蛋白;具有多种肝细胞特异性功能,如靛青绿摄取/排泌、糖原合成以及白蛋白分泌功能.结论 人脂肪间充质干细胞在含碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4和抑瘤索M的诱导体系中能够分化为更加成熟的具有多种肝细胞特异性功能的细胞,且此诱导体系同时具有促进细胞增殖的作用.     

ES细胞的三维培养与肝细胞分化的初步研究

目的 探索用生物材料三维培养胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)并向肝细胞分化的可行性.方法 胰酶消化悬滴法形成5 d的鼠拟胚胎,将1×106/mL鼠ES细胞与细胞外基质MatrigelTM1:1混合接种于聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA)和聚乙醇酸(polyglycolic acid,PGA)共聚合三维支架内,用DMSO、地塞米松、HGF、FGF4、胰岛素等诱导ES细胞向肝细胞分化,动态观察ES细胞的培育和生长情况,并用RT-PCR、免疫荧光染色检测其肝细胞标志物白蛋白(ALB)和甲胎蛋白(AFP)的表达.结果 立体显微镜见ES细胞及分化细胞在聚合支架材料上呈三维立体状态生长,并保持细胞活力,随培养时间延长不断增殖.RT-PCR检出分化细胞表达ALB mRNA和AFP mRNA,同样免疫荧光染色也证实表达ALB和AFP.结论 ES细胞可在生物材料聚合三维可降解支架及MatrigelTM上生长,并在诱导剂的作用下向肝细胞分化.     

丙烯醇致肝损伤微环境定向诱导骨髓干细胞向肝细胞分化

目的探讨丙烯醇导致的肝损伤环境对大鼠骨髓来源的Thy-1+β2M-细胞(BDTCs)向肝脏细胞诱导分化的影响。方法用免疫磁分选方法分离雄性F344大鼠BDTCs,以PKH26标记后经门静脉输注入受者雌性F344大鼠体内。30只受者随机分为3组,A组:丙烯醇损伤+BDTCs移植组;B组:正常+BDTCs移植组;C组:丙烯醇损伤+等渗盐水对照组。术后不同时间行血清生物化学检测,经荧光标记细胞定位、原位杂交检测Y染色体sry基因表达和免疫组织化学等方法检测移植的BDTCs在受体肝脏内分布、增殖和分化情况。结果荧光显微镜和sry基因原位杂交均发现,供体BDTCs在丙烯醇所致的坏死汇管区附近呈片状或索条状分布;免疫组织化学结果显示,汇管区附近的部分新生细胞序贯性表达OV-6、甲胎蛋白、细胞角蛋白19和白蛋白,而B组肝内几乎未见阳性细胞出现;A组和C组血清生物化学指标恢复正常所需时间分别为(9.8±3.1)d和(13.7±4.2)d。结论丙烯醇致肝汇管区坏死的微环境有利于BDTCs整合至肝细胞板中并向成熟的肝细胞分化,BDTCs在向肝细胞分化的同时还可能促进内源性的肝细胞再生和修复。     

胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞的定向分化

在适当的条件下，胚胎干细胞可在体外被诱导分化为胰岛素分泌细胞。这一过程包括胚胎干细胞的诱导分化以及分化细胞的筛选和成熟。通过检测胰岛细胞的细胞标志和应用组织化学方法可鉴定胚胎干细胞是否已分化为胰岛素分泌细胞。研究显示，来源于小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞可使糖尿病模型动物的血糖恢复到正常水平，但在胚胎干细胞进入临床应用之前，仍有很多问题需进一步研究加以解决。     

胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞的定向分化

在适当的条件下 ,胚胎干细胞可在体外被诱导分化为胰岛素分泌细胞。这一过程包括胚胎干细胞的诱导分化以及分化细胞的筛选和成熟。通过检测胰岛细胞的细胞标志和应用组织化学方法可鉴定胚胎干细胞是否已分化为胰岛素分泌细胞。研究显示 ,来源于小鼠胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞可使糖尿病模型动物的血糖恢复到正常水平 ,但在胚胎干细胞进入临床应用之前 ,仍有很多问题需进一步研究加以解决。