小鼠胚胎单侧与双侧输卵管移植的结果比较

目的 比较小鼠胚胎移植入单侧与双侧输卵管的差异,探索最佳的胚胎移植方法.方法 选用C57BL/6J小鼠作为供体小鼠,取1.5 d胚胎即2-细胞期胚胎分别采用单侧和双侧输卵管移植入ICR假孕雌鼠,统计仔鼠出生率.结果经单侧输卵管移植和双侧输卵管移植后假孕雌鼠的妊娠率均为100％,产仔率分别为32.5％和34.7％.结论 小鼠2-细胞期胚胎经输卵管双侧移植较单侧移植的产仔率略高,但无显著差异.     

瞬时受体电位通道家族M8型受体转基因小鼠模型的建立

目的 建立瞬时受体电住通道家族M8型受体(TRPM8)转基因小鼠模型.方法 通过显微注射法将pcDNA3.1-hTrpm8导入C57BL/6J×CBA F1小鼠的受精卵中,并将其移植到假孕母鼠输卵管中获得子代小鼠.采用PCR方法鉴定子代基因型,通过RT-PCR和免疲印迹法检测Trpm8基因及蛋白在组织中的表达.结果 将405枚注射受精卵移植给15只假孕鼠,其中13只顺利妊娠并产下95只子鼠,经PCR鉴定得到5只转基因阳性首建鼠,其中4只小鼠可稳定传代,经与C57BL/6J小鼠回交7代后互交数代建系.子代转基因小鼠经RT-PCR检测发现Trpm8基因在心脏、肝脏、肾脏、脂肪和骨骼肌中均有表达,且TRPM8蛋白表达在转基因小鼠中显著增加.结论 通过显微注射法成功建立了Trpm8转基因小鼠模型.     

两种小鼠胚胎移植方法的比较

目的:通过将传统的撕破囊膜进行小鼠胚胎移植的方法改为囊膜穿刺,以期提高胚胎移植的成功率.方法:共移植ICR和C57BL/6供体小鼠106只,其中改进方法移植47只(ICR小鼠31只,C57BL/6小鼠16只),传统方法移植59只(ICR小鼠39只,C57BL/6小鼠20只).结果:囊膜穿刺方法将输卵管和腹壁的炎性黏连发生率由60%降低到了20%,减轻了对移植后胚胎存活的不利影响,将ICR小鼠和C57BL/6小鼠胚胎移植成功率分别提高到了61%和37%.结论:通过囊膜穿刺进行胚胎移植提高了胚胎移植成功率.     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的 将人的钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin,CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法 利用Gateway技术构建pRP.EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57BL/6J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果 将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100%,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9%。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论 通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

瞬时受体电位家族香草醛1型受体转基因小鼠模型的建立

目的 建立瞬时受体电位家族香草醛1型受体(Trpvl)转基因小鼠模型.方法 通过显微注射法把pcDNA3.1-rTrpv1导入C57BL/6J×CBA F1小鼠的受精卵雄原核中并移植到假孕母鼠输卵管内,用PCR方法鉴定子代基因型,用蛋白免疫印迹法检测TRPV1在组织中的表达水平.结果 将400枚注射卵移植到16只假孕母鼠的输卵管中,共出生小鼠120只,获得5只转基因阳性小鼠.其中2只阳性小鼠可稳定传代,经过与C57小鼠回交数次后各自建系.经蛋白免疫印迹法证实,与同窝野生型小鼠相比,转基因小鼠的脑组织和肌肉组织中TRPV1蛋白的表达显著升高.结论 成功建立了Trpv1转基因小鼠模型,为深入研究TRPV1通道的功能提供了更好的条件.     

小鼠品系影响胚胎移植成功率的比较研究

目的:探讨不同受体鼠和供体鼠品系对胚胎移植成功率的影响以及不同品系胚胎混合移植的可行性. 方法:以Balb/c雄鼠和C57BL/6雌鼠杂交F1代(B6CF1)小鼠24只和昆明鼠(KM鼠)14只作为供体鼠,共取状态良好的受精卵362颗,分别或混合回种于8只B6CF1和16只KM受体鼠输卵管内,比较两种品系鼠的产仔率. 结果:除同品系回种可产仔外,KM鼠和B6CF1杂交鼠受精卵交叉回种B6CF1或KM受体鼠以及两品系受精卵混合回种均可产仔. 其中B6CF1受体鼠产仔率(29.0%)明显高于KM受体鼠(7.0%),B6CF1供体鼠产仔率(16.0%)也略高于KM供体鼠(11.0%);杂交B6CF1受精卵同品系回种产仔率最高(32.0%),KM鼠受精卵同品系回种产仔率仅4.0%,而B6CF1和KM鼠作为受体鼠混合回种两品系受精卵的产仔率分别为25.0%和15.0%. 结论:不同品系小鼠胚胎可交叉或混合回种,小鼠胚胎移植技术不受品系限制,但同品系胚胎移植成功率更高;B6CF1作为胚胎移植实验动物明显优于KM鼠.     

不同日龄和品系小鼠超排卵、体外受精及受孕率的比较研究

用PMSG和HCG分别对不同日龄(28日龄、56日龄和112日龄)的ICR,B6C3F1和C57BL/6J三个品系小鼠进行超排处理,并分别进行IVF(体外受精)及体外培养后将2-细胞期的胚胎移植至假孕受体的输卵管中,以此比较不同日龄和品系小鼠的超排、体外受精率和受孕率.结果显示,三个品系的28日龄小鼠的排卵数均高于56日龄和112日龄的排卵数(P<0.01),但品系和年龄并不影响卵母细胞在体外受精后形成2-细胞胚胎的受精率(平均约为91%的受精率),以及这些正常的胚胎在移植至受体后的受孕率(约51%左右).     

探讨建立抗癌新药“维泰醇”小鼠模型

目的为研制筛选抗癌新药维泰醇建立适宜的动物模型。方法将有生物学活性的癌细胞接种于不同种小鼠，逐日观察、记录致瘤情况和死亡时间。结果L1210细胞腹腔接种于DBA-2、BDF-1、CDF-1、C57BL/6J和昆明鼠（KM）小鼠共86只，接种量（1×10^4-1×10^6）个/只；其中DBA-2、BDF-1和CDF-1小鼠的致瘤率为100.0%，C57BL/6J和昆明鼠（KM）的致瘤率为0。B16细胞腋窝皮下接种BDF-1小鼠20只，接种量〉1×10^6个/只，致瘤率为95.0%。MGC-803细胞腋窝皮下接种于BALB/C裸鼠，接种量（5×10^6）个/只，致瘤率为100.0%。HL（对照细胞）和Z-HL16C细胞腋窝皮下接种BALB/C裸鼠6只，接种量（5×10^6）个/0.2ml.部位，致瘤率为100.0%。结论用L1210、B16、MGC-803和Z-HL16C细胞成功制备了相应的荷瘤小鼠模型，为下一步体内药效研究打下了良好基础。     

检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠建立

目的建立用于检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠.方法采用显微注射方法,将携带lacZ和人碱性磷酸酶(human alkaline phosphatase,hAP)报告基因的ZAP载体导入近交C57BL/6小鼠554枚受精卵;利用PCR,Southern blotting技术对其仔鼠进行基因整合鉴定;应用X-gal染色方法,对转基因小鼠胚胎进行转基因表达检测.结果存活的398枚受精卵被移入21只假孕受体小鼠输卵管;13只受体怀孕产下68只后代.合子存活率和出生率分别为71%(398/554)和17%(68/398).在68只小鼠中,5只雄性和4只雌性小鼠整合有双报告基因.转基因整合率和有效率分别为13%(9/68)和1.6%(9/554).9只首建鼠与正常C57 BL/6小鼠杂交产生F1代小鼠.F1代小鼠转基因的传递符合孟德尔规律,X-gal染色仅在3只首建鼠的13.5 d龄胚胎中观察到.结论检测Cre位点特异重组酶活性的双报告转基因小鼠已建立.     

615小鼠胚胎移植初探

目的 提高615小鼠胚胎移植成功率。方法 采用经超量排卵的615雌鼠与正常雄鼠交配，取受精卵，再经手术分别将单胚卵、双胚卵移入发情的假孕雌鼠的输卵管中，妊娠产仔。结果 单胚卵移卵后妊娠率为63．3％、产仔率为35．8％；双胚卵移入第1．5天、第0．5天的假孕雌鼠妊娠率为0.72％，后者的产仔率为52．7％；结论 移植双胚卵可提高615小鼠的胚胎移植成功率。     

C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎冷冻保种技术研究

目的 建立C57-ras癌症转基因小鼠模型胚胎的冷冻保种技术.方法 通过直接收集体内发育的2-细胞胚或者通过体外受精方法获得2-细胞胚,采用玻璃化冷冻法冷冻、复苏、移植,后代经PCR检测.结果 体内发育至2细胞期胚胎90枚,解冻后的平均复苏率是67.78％,移植产仔率是21.31％,后代的阳性率是23.08％;体外受精的2细胞期胚胎203枚,解冻复苏60枚,平均复苏率是63.33％,移植产仔率是15.78％,后代的阳性率是33.33％.结论 两种胚胎冷冻途径均获得了C57-ras癌症转基因动物模型阳性小鼠,建立了该模型动物的低温保存方法.     

利用超数排卵技术进行优化C57BL/6J小鼠生物净化体系的研究

目的以近交系C57BL/6J小鼠为实验对象,通过注射不同剂量的孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促进腺激素(hCG)对小鼠进行超数排卵、体外授精和胚胎移植,确定最佳超排剂量,从而完善以C57BL/6J小鼠为背景的转基因小鼠的生物净化体系。方法将5周龄的C57BL/6J雌鼠进行5 IU、10 IU、7.5 IU、15 IU四个剂量组的超数排卵,通过超数排卵与剖宫取胎、胚胎移植两种净化方法相结合,确定C57BL/6J小鼠的净化方法所需的最佳剂量。结果剖宫取胎方法中,注射5 IU剂量组的C57BL/6J小鼠超排后合笼见栓率最高,为(89.00±19.05)%,产仔数和见栓率与其它三组均差异不显著;胚胎移植方法中,10 IU剂量组平均卵母细胞数为30.33±0.89枚,平均体内2-细胞胚胎数为23.78±0.19枚,均显著高于其它三组。结论剖宫取胎法生物净化时,5 IU剂量组可以提高C57BL/6J小鼠的交配成功率;胚胎移植法生物净化时,10 IU剂量组可以获得最多的体内和体外2-细胞胚胎,为C57BL/6J小鼠最佳超排剂量。     

C57BL/6J小鼠冻融IVF原核胚用于Cas9显微注射探讨

目的探讨小鼠体外受精(IVF)冻融后用于Cas9注射的可行性。方法新鲜C57BL/6J小鼠卵子IVF后采用冻存管法(EFS20/40)冷冻原核胚(单细胞胚)和2细胞胚胎,次日复苏后培养。比较冻融原核胚和2细胞胚胎的回收率及成活率。选取部分冻融原核胚与新鲜原核胚同时进行Cas9和稀释液胞质注射并培养至2细胞,分别比较注射后的存活率及2细胞发育率。结果冻融后的B6小鼠原核胚的回收率为92.5%、成活率为92.8%,2细胞胚的回收率为90.5%、成活率95.8%,两组数据差异无显著性(P0.05)。新鲜原核胚Cas9注射后的存活率为92.7%,空白组注射组为97.5%,冻融原核胚Cas9注射后的存活率为82.6%,空白组为92%,冻融组Cas9注射与各组差异有显著性(P0.05),其它各组差异无显著性(P0.05)。注射后的2细胞胚发育率差异无显著性(P0.05)。结论冻融原核胚可用于Cas9显微注射。     

转基因技术和冷冻胚胎技术的实验数据建立

目的 建立一系列转基因技术和冷冻胚胎技术的实验室数据库。方法 a)显微注射法注射1864个1-细胞期受精卵,注射后存活的1283个胚胎进行胚胎移植,获得20只阳性转基因动物。b)设计不同单位的激素剂量(PMSG HCG)获得每个品系的小鼠平均排卵量和最佳激素剂量。e)采用常规法和玻璃化法进行胚胎冷冻保存,并就囊胚和桑椹胚两个不同时期进行复苏成活率的比较。结果 和讨论a)建立转基因技术和胚胎冷冻保存的实验数据库(随着实验技术的不断提高还将不断的完善)。胚胎显微注射存活率为68．8％;转基因阳性鼠出生率为16．16％;基因整合率为1．56％。b)激素诱发5种品系小鼠的平均超排卵数为：C57BL/6J(日本)15．6;C57BL/6J 19．6;BDF1(日本)21．4;C3H(日本)14．8;KM 30。e)胚胎冷冻保存复苏,出生幼子存活率为30％～31％。     

小鼠胚胎切割及半胚体外培养

目的 为基因型完全相同的同卵双胞脂人类动物模型的建立积累基础资料。方法C57BI/6J雌性小鼠与KM雄性小鼠交配,见栓3．5d采集小鼠晚期桑椹胚和早期囊胚,应用显微手术刀直接分割法进行胚胎二等份分割,所得半胚体外培养,观察其发育情况。结果 晚期桑椹胚分割成功率是91．3％,半胚发育率为57.1％,早期囊胚分割成功率约为89．2％,半旺发育率为71.2％。结论 C57BI/6J小鼠与KM小鼠的F1代胚胎经切割后能在体外良好发育,该资料可用于同卵双胞胎分化发育的研究及人类双胞胎动物模型的制作。     

C57BL/6J小鼠冻融胚胎移植后所得小鼠及其子代生物学特性数据测定与分析

目的探讨C57BL/6J(B6)小鼠冷冻复苏胚胎移植后所得小鼠及其子代的平均体增长和血液生化等部分生物学特性数据的变化。方法实验分为3组。实验组Ⅰ:冻融胚移植组,B6小鼠体外受精后的2-cell胚胎采用EFS法冷冻,复苏后移植到受体(ICR小鼠)输卵管内所产的小鼠(雄鼠30只,雌鼠20只);实验组Ⅱ:冻融胚胎移植所产的小鼠成熟后经自然交配得到的子一代(雄鼠26只,雌鼠17只);对照组:正常饲养和自然交配所得的子代(雌雄小鼠各20只)。3组小鼠饲养至16周龄,每周定时测定体质量,至16周龄时采血,测定各组小鼠血清生化值,并进行分析比较。结果实验组Ⅰ雌雄小鼠初生重和1~16周的平均体重均显著高于对照组(P0.01),实验组Ⅱ雌鼠体重从12周开始均显著高于对照组(P0.01),而雄鼠只有部分周龄与对照组有差异,其余周龄则差异无显著性;实验组Ⅰ和实验组Ⅱ小鼠的血清生化值与对照组相比除AST、TP和Ca等项目无变化外,其余项目均发生了显著或极显著的上调或下调。结论冷冻对胚胎移植所得小鼠及其自然繁殖子一代的平均体增长和血清生化值有一定影响。     

不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究

目的　探讨不同品系小鼠的体外受精、胚胎和精子的低温保存效果。方法　本实验分别在中国科学院上海实验动物中心 (SLAC)和日本熊本大学动物资源开发中心 (CARD)对 13个品系小鼠 (C57BL 6J、BALB c、C3H HeJ、ICR、KM、FVB、MRL、NOD、CBA、DBA 2、CD 1、BDF1、B6C3F1)的体外受精 (IVF)率、胚胎培养及移植成绩进行了比较研究。结果　各品系小鼠新鲜精子的IVF率 15 1%～ 87 9% ,冻融精子的IVF率 8%～ 80 % ;冷冻胚胎的复苏率4 2 6 %～ 83 9% ;冻融胚胎移植后的产仔率在 17 8%～ 5 1 8%。结论　遗传背景不同的小鼠体外受精率、冷冻胚胎复苏率和胚胎移植的产仔率差异有显著性。但同一品系两个实验室间的新鲜精子的IVF率、冷冻胚胎的复苏率及移植产仔率差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;冻融精子的体外受精率CARD明显高于SLAC(P <0 0 1)。     

不同品系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究

目的　研究甘油作为冷冻保护剂、不同基因型小鼠对胚胎玻璃化冷冻的影响。方法　采用 6 5mol L的甘油作为冷冻保护剂 ,采用二步法对CBA、NOD、C57BL 6J、ICR及CD1小鼠 3 5d的胚胎进行玻璃化冷冻 ,并比较了不同品系小鼠胚胎的复苏率及移植受孕率。结果和结论　CBA、NOD、C57BL 6J,ICR及CD1的复苏率分别为 5 7 6 %、4 8%、31 3%、86 5 %及 88% ,移植受孕率为 2 1%、2 3 5 %、11%、38%和 35 5 % ,封闭群小鼠的胚胎复苏率、移植受孕率均显著高于近交系小鼠。这提示胚胎的复苏率及移植受孕率可能与小鼠的不同基因型有关。五个品系中 ,桑椹胚及早期囊胚的体外复苏率均显著高于扩张囊胚。这说明不同基因型及胚胎的不同发育阶段对胚胎玻璃化冷冻效果有影响